معلومة

6.2: العزلة والثقافة والتعرف على الفيروسات - علم الأحياء

6.2: العزلة والثقافة والتعرف على الفيروسات - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أهداف التعلم

  • ناقش سبب وصف الفيروسات في الأصل بأنها عوامل قابلة للتصفية
  • وصف زراعة الفيروسات وجمع العينات والتعامل معها
  • قارن بين التقنيات في الجسم الحي وفي المختبر المستخدمة لزراعة الفيروسات

في بداية هذا الفصل ، وصفنا كيف تم استخدام فلاتر شامبرلاند الخزفية ذات المسام الصغيرة بما يكفي للسماح بمرور الفيروسات لاكتشاف TMV. اليوم ، تم استبدال مرشحات البورسلين بمرشحات غشائية وأجهزة أخرى تستخدم لعزل وتحديد الفيروسات.

عزل الفيروسات

على عكس البكتيريا ، التي يمكن أن ينمو الكثير منها على وسط غذائي صناعي ، تتطلب الفيروسات خلية مضيفة حية للتكاثر. يمكن استزراع الخلايا المضيفة المصابة (حقيقية النواة أو بدائية النواة) وتنميتها ، ومن ثم يمكن حصاد وسط النمو كمصدر للفيروس. يمكن فصل الفيريونات الموجودة في الوسط السائل عن الخلايا المضيفة إما بالطرد المركزي أو الترشيح. يمكن للفلاتر إزالة أي شيء موجود في المحلول أكبر من الفيروسات ؛ يمكن بعد ذلك جمع الفيروسات في المرشح (الشكل ( PageIndex {1} )).

تمرين ( PageIndex {1} )

ما هو حجم مسام المرشح اللازمة لجمع الفيروس؟

زراعة الفيروسات

يمكن أن تنمو الفيروسات في الجسم الحي (داخل كائن حي كامل ، نبات ، أو حيوان) أو في المختبر (خارج كائن حي في خلايا في بيئة اصطناعية ، مثل أنبوب الاختبار ، أو قارورة استنبات الخلية ، أو لوحة أجار). يمكن زراعة البكتيريا في وجود طبقة كثيفة من البكتيريا (تسمى أيضًا العشب البكتيري) تنمو في أجار ناعم بنسبة 0.7٪ في طبق بتري أو قارورة مسطحة (أفقية) (الشكل ( PageIndex {2a} )). ينخفض ​​تركيز الآجار من 1.5٪ التي تستخدم عادة في زراعة البكتيريا. يسمح أجار 0.7٪ الناعم للعاثيات بالانتشار بسهولة عبر الوسط. بالنسبة للعاثيات اللايتية ، يمكن بعد ذلك ملاحظة تحلل العوائل البكتيرية بسهولة عند اكتشاف منطقة واضحة تسمى اللويحة (الشكل ( PageIndex {1b} )). عندما تقتل العاثية البكتيريا ، لوحظت العديد من اللويحات بين العشب البكتيري الغائم.

تتطلب الفيروسات الحيوانية خلايا داخل حيوان مضيف أو خلايا مستنبتة للأنسجة مشتقة من حيوان. تعد زراعة الفيروس الحيواني مهمة من أجل 1) تحديد وتشخيص الفيروسات المسببة للأمراض في العينات السريرية ، 2) إنتاج اللقاحات ، و 3) الدراسات البحثية الأساسية. يمكن أن تكون مصادر المضيف في الجسم الحي عبارة عن جنين نامي في بيضة طائر مُضغ (مثل الدجاج والديك الرومي) أو حيوان كامل. على سبيل المثال ، يُزرع معظم لقاح الإنفلونزا المصنوع لبرامج التطعيم السنوية ضد الإنفلونزا في بيض الدجاج.

يعمل الجنين أو الحيوان المضيف كحاضنة لتكاثر الفيروس (الشكل ( فهرس الصفحة {3} )). الموقع داخل الجنين أو الحيوان المضيف مهم. العديد من الفيروسات لها انتفاخات نسيجية ، وبالتالي يجب إدخالها في موقع معين للنمو. داخل الجنين ، تشمل المواقع المستهدفة التجويف الأمنيوسي أو الغشاء المشيمي أو الكيس المحي. قد تؤدي العدوى الفيروسية إلى إتلاف أغشية الأنسجة ، مما يؤدي إلى ظهور آفات تسمى الجدري ؛ يعطل التطور الجنيني. أو التسبب في موت الجنين.

للدراسات في المختبر ، يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا لدعم نمو الفيروسات. يتم تحضير مزرعة الخلايا الأولية حديثًا من أعضاء أو أنسجة حيوانية. يتم استخراج الخلايا من الأنسجة عن طريق الكشط الميكانيكي أو الفرم لتحرير الخلايا أو بطريقة أنزيمية باستخدام التربسين أو الكولاجيناز لتفتيت الأنسجة وتحرير الخلايا المفردة في التعليق. بسبب متطلبات الاعتماد على الإرساء ، تتطلب مزارع الخلايا الأولية وسيطًا مستنبتًا سائلًا في طبق بتري أو قارورة زراعة الأنسجة بحيث يكون للخلايا سطح صلب مثل الزجاج أو البلاستيك للتعلق والنمو. عادة ما يكون للثقافات الأولية عمر محدود. عندما تخضع الخلايا في الثقافة الأولية للانقسام الخيطي وتنتج كثافة كافية من الخلايا ، تتلامس الخلايا مع الخلايا الأخرى. عندما يحدث هذا الاتصال من خلية إلى أخرى ، يتم تشغيل الانقسام الفتيلي للتوقف. وهذا ما يسمى تثبيط الاتصال ويمنع كثافة الخلايا من أن تصبح عالية للغاية. لمنع تثبيط الاتصال ، يجب نقل الخلايا من ثقافة الخلية الأولية إلى وعاء آخر به وسط نمو جديد. وهذا ما يسمى ثقافة الخلية الثانوية. بشكل دوري ، يجب تقليل كثافة الخلايا عن طريق سكب بعض الخلايا وإضافة وسط جديد لتوفير مساحة ومغذيات للحفاظ على نمو الخلايا. على عكس مزارع الخلايا الأولية ، غالبًا ما تكون خطوط الخلايا المستمرة ، المشتقة عادةً من الخلايا أو الأورام المحولة ، قادرة على الاستزراع الفرعي عدة مرات أو حتى تنمو إلى أجل غير مسمى (في هذه الحالة يطلق عليها اسم خالدة). قد لا تظهر خطوط الخلايا المستمرة تبعية الإرساء (سوف تنمو في حالة تعليق) وقد تفقد تثبيط الاتصال بها. نتيجة لذلك ، يمكن أن تنمو خطوط الخلايا المستمرة في أكوام أو كتل تشبه نمو الورم الصغير (الشكل ( PageIndex {4} )).

مثال على خط الخلايا الخالدة هو خط خلية هيلا ، الذي تم زراعته في الأصل من الخلايا السرطانية التي تم الحصول عليها من هنريتا لاكس ، مريضة ماتت بسبب سرطان عنق الرحم في عام 1951. كانت خلايا هيلا هي أول خط خلية لزراعة الأنسجة المستمرة وتم استخدامها في إنشاء زراعة الأنسجة كتقنية مهمة للبحث في بيولوجيا الخلية وعلم الفيروسات والطب. قبل اكتشاف خلايا هيلا ، لم يكن العلماء قادرين على إنشاء مزارع الأنسجة بأي موثوقية أو استقرار. بعد أكثر من ستة عقود ، لا يزال هذا الخط الخلوي على قيد الحياة ويستخدم في الأبحاث الطبية. راجع The Immortal Cell Line of Henrietta Lacks لقراءة المزيد عن هذا الخط الخلوي المهم والوسائل المثيرة للجدل التي تم الحصول عليها من خلالها.

تمرين ( PageIndex {2} )

ما خاصية الخلايا التي تجعل التخفيفات الدورية لمزارع الخلايا الأولية ضرورية؟

الخط الخلوي الخالد لنقص هنريتا

في يناير 1951 ، تم تشخيص هنريتا لاكس ، وهي امرأة أمريكية من أصل أفريقي تبلغ من العمر 30 عامًا من بالتيمور ، بسرطان عنق الرحم في مستشفى جون هوبكنز. نحن نعلم الآن أن سبب سرطانها هو فيروس الورم الحليمي البشري (HPV). أدت تأثيرات الاعتلال الخلوي للفيروس إلى تغيير خصائص خلاياها في عملية تسمى التحول ، والتي تمنح الخلايا القدرة على الانقسام باستمرار. هذه القدرة ، بالطبع ، أدت إلى ورم سرطاني أدى في النهاية إلى وفاة السيدة لاكس في سن 31. قبل وفاتها ، تم أخذ عينات من خلاياها السرطانية دون علمها أو إذنها. انتهى المطاف بالعينات في حوزة الدكتور جورج جي ، الباحث في الطب الحيوي في جامعة جونز هوبكنز. كان Gey قادرًا على تنمية بعض الخلايا من عينة Lacks ، مما أدى إلى إنشاء ما يعرف اليوم باسم خط خلية هيلا الخالد. تتمتع هذه الخلايا بالقدرة على العيش والنمو إلى أجل غير مسمى ، وحتى اليوم ، لا تزال مستخدمة على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث.

وفقًا لزوج لاكس ، لم تمنح هنريتا ولا الأسرة الإذن للمستشفى بجمع عينة الأنسجة الخاصة بها. في الواقع ، لم تكن العائلة على علم إلا بعد مرور 20 عامًا على وفاة لاكس أن خلاياها لا تزال على قيد الحياة ويتم استخدامها بنشاط لأغراض تجارية وبحثية. ومع ذلك ، فقد لعبت خلايا هيلا دورًا محوريًا في العديد من الاكتشافات البحثية المتعلقة بشلل الأطفال والسرطان والإيدز ، من بين أمراض أخرى. كما تم تسويق الخلايا ، على الرغم من عدم حصولها على براءة اختراع. على الرغم من ذلك ، لم تستفد ملكية Henrietta Lacks أبدًا من استخدام الخلايا ، على الرغم من أنه في عام 2013 ، تم منح عائلة Lacks السيطرة على نشر التسلسل الجيني لخلاياها.

تثير هذه القضية العديد من القضايا المتعلقة بالأخلاقيات البيولوجية المتعلقة بموافقة المرضى المستنيرة والحق في المعرفة. في الوقت الذي تم فيه أخذ مناديل لاكس ، لم تكن هناك قوانين أو إرشادات حول الموافقة المستنيرة. هل هذا يعني أنها عوملت معاملة عادلة في ذلك الوقت؟ بالتأكيد وفقًا لمعايير اليوم ، ستكون الإجابة لا. لا يعتبر حصاد الأنسجة أو الأعضاء من مريض يحتضر دون موافقة أمرًا غير أخلاقي فحسب ، بل غير قانوني ، بغض النظر عما إذا كان مثل هذا الفعل يمكن أن ينقذ حياة المرضى الآخرين. هل من الأخلاقي إذن أن يستمر العلماء في استخدام أنسجة لاكس في البحث ، على الرغم من أنها تم الحصول عليها بشكل غير قانوني وفقًا لمعايير اليوم؟

أخلاقيًا أم لا ، تُستخدم خلايا Lacks على نطاق واسع اليوم للعديد من التطبيقات بحيث يستحيل سردها جميعًا. هل هذه حالة تبرر فيها الغايات الوسيلة؟ هل سيسعد لاكس بمعرفة مساهمتها في العلوم وملايين الأشخاص الذين استفادوا؟ هل تريد أن يتم تعويض أسرتها عن المنتجات التجارية التي تم تطويرها باستخدام خلاياها؟ أم ستشعر بانتهاك واستغلال الباحثين الذين أخذوا جزءًا من جسدها دون موافقتها؟ ولأنها لم تُسأل قط ، فلن نعرف أبدًا.

الكشف عن الفيروس

بغض النظر عن طريقة الزراعة ، بمجرد إدخال الفيروس في كائن حي أو جنين أو خلية زراعة الأنسجة بأكملها ، يمكن تحضير عينة من المضيف أو الجنين أو خط الخلية المصاب لمزيد من التحليل تحت حقل مشرق ، إلكترون ، أو مجهر الفلورسنت. تأثيرات الاعتلال الخلوي (CPEs) هي تشوهات خلوية واضحة يمكن ملاحظتها بسبب العدوى الفيروسية. يمكن أن تشمل CPEs فقدان الالتصاق بسطح الحاوية ، والتغيرات في شكل الخلية من مسطحة إلى مستديرة ، وانكماش النواة ، والفجوات في السيتوبلازم ، واندماج الأغشية السيتوبلازمية ، وتشكيل المخلوقات متعددة النوى ، وإدراج الأجسام في النواة أو السيتوبلازم ، وإكمال تحلل الخلايا (انظر الشكل ( PageIndex {6} )).

تشمل التغييرات المرضية الأخرى التمزق الفيروسي للجينوم المضيف وتغيير الخلايا الطبيعية إلى خلايا محولة ، وهي أنواع الخلايا المرتبطة بالسرطانات والأورام اللحمية. يعتمد نوع أو شدة CPE على نوع الفيروس المعني. يسرد الشكل ( PageIndex {6} ) CPEs لفيروسات معينة.

شاهد هذا الفيديو للتعرف على تأثيرات الفيروسات على الخلايا.

فحص التراص الدموي

يستخدم الفحص المصلي للكشف عن وجود أنواع معينة من الفيروسات في مصل المريض. المصل هو الجزء السائل بلون القش من بلازما الدم الذي تمت إزالة عوامل التخثر منه. يمكن استخدام المصل في فحص مباشر يسمى مقايسة التراص الدموي للكشف عن أنواع معينة من الفيروسات في عينة المريض. التراص الدموي هو تراص (تكتل) خلايا الدم الحمراء (خلايا الدم الحمراء). تنتج العديد من الفيروسات بروتينات أو طفرات سطحية تسمى هيماجلوتينين والتي يمكن أن ترتبط بالمستقبلات الموجودة على أغشية كريات الدم الحمراء وتتسبب في تراص الخلايا. يمكن ملاحظة التراص الدموي بدون استخدام المجهر ، لكن هذه الطريقة لا تفرق دائمًا بين الجزيئات الفيروسية المعدية وغير المعدية ، حيث يمكن لكليهما أن يتراكم كريات الدم الحمراء.

لتحديد فيروس ممرض معين باستخدام التراص الدموي ، يجب علينا استخدام نهج غير مباشر. يمكن استخدام البروتينات التي تسمى الأجسام المضادة ، والتي يتم إنشاؤها بواسطة الجهاز المناعي للمريض لمحاربة فيروس معين ، للارتباط بمكونات مثل hemagglutinins المرتبطة بشكل فريد بأنواع معينة من الفيروسات. يؤدي ارتباط الأجسام المضادة مع الهيماجلوتينين الموجود في الفيروس إلى منع كريات الدم الحمراء من التفاعل المباشر مع الفيروس. لذلك عندما تضاف كريات الدم الحمراء إلى الفيروسات المغلفة بالأجسام المضادة ، لا يظهر تراص ؛ تم منع التراص. نسمي هذه الأنواع من المقايسات غير المباشرة لمقايسات تثبيط التراص الدموي للأجسام المضادة الخاصة بالفيروس. يمكن استخدام HAI لاكتشاف وجود أجسام مضادة خاصة بأنواع عديدة من الفيروسات التي قد تسبب أو تسببت في إصابة المريض حتى بعد شهور أو سنوات من الإصابة (انظر الشكل ( PageIndex {7} )). تم وصف هذا الاختبار بمزيد من التفصيل في فحوصات التراص.

تمرين ( PageIndex {3} )

ما هي نتيجة اختبار HIA الإيجابي؟

اختبار تضخيم الحمض النووي

تُستخدم اختبارات تضخيم الحمض النووي (NAAT) في البيولوجيا الجزيئية لاكتشاف تسلسل الحمض النووي الفريد للفيروسات في عينات المرضى. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو NAAT يستخدم للكشف عن وجود الحمض النووي الفيروسي في أنسجة المريض أو عينة سوائل الجسم. PCR هي تقنية تضخّم (أي توليف العديد من النسخ) من جزء من الحمض النووي الفيروسي محل الاهتمام. باستخدام PCR ، ترتبط تسلسلات النوكليوتيدات القصيرة التي تسمى الاشعال بتسلسلات محددة من الحمض النووي الفيروسي ، مما يتيح التعرف على الفيروس.

إن النسخ العكسي لـ PCR (RT-PCR) هو NAAT يستخدم للكشف عن وجود فيروسات RNA. يختلف RT-PCR عن PCR في أن إنزيم النسخ العكسي (RT) يستخدم لصنع cDNA من كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي الفيروسي في العينة. يمكن بعد ذلك تضخيم (كدنا) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يستخدم كل من PCR و RT-PCR لاكتشاف وتأكيد وجود الحمض النووي الفيروسي في عينات المرضى.

تخويف فيروس الورم الحليمي البشري

جاءت ميشيل ، طالبة تمريض تبلغ من العمر 21 عامًا ، إلى عيادة الجامعة قلقة من تعرضها لمرض ينتقل عن طريق الاتصال الجنسي (STD). أصيب شريكها الجنسي مؤخرًا بعدة نتوءات على قاعدة قضيبه. كان قد أجل الذهاب إلى الطبيب ، لكن ميشيل تشتبه في أنها ثآليل تناسلية سببها فيروس الورم الحليمي البشري. إنها قلقة بشكل خاص لأنها تعلم أن فيروس الورم الحليمي البشري لا يسبب الثآليل فحسب ، بل هو سبب بارز لسرطان عنق الرحم. تستخدم هي وشريكها دائمًا الواقي الذكري لمنع الحمل ، لكنها ليست واثقة من أن هذا الإجراء الوقائي سيحميها من فيروس الورم الحليمي البشري.

لم يجد طبيب ميشيل أي علامات جسدية للثآليل التناسلية أو أي أمراض أخرى تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي ، ولكنه يوصي بأن تحصل ميشيل على مسحة عنق الرحم مع اختبار فيروس الورم الحليمي البشري. ستقوم مسحة عنق الرحم بفحص خلايا عنق الرحم غير الطبيعية و CPEs المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري ؛ سيختبر اختبار فيروس الورم الحليمي البشري وجود الفيروس. إذا كان كلا الاختبارين سلبيين ، فيمكن أن تطمئن ميشيل إلى أنها على الأرجح لم تصاب بفيروس الورم الحليمي البشري. ومع ذلك ، يشير طبيبها إلى أنه قد يكون من الحكمة أن تتلقى ميشيل التطعيم ضد فيروس الورم الحليمي البشري لحماية نفسها من التعرض المحتمل في المستقبل.

تمرين ( PageIndex {4} )

لماذا طلب طبيب ميشيل اختبارين مختلفين بدلاً من الاعتماد على أحدهما أو الآخر؟

إنزيم المقايسة المناعية

تعتمد المقايسات المناعية للإنزيمات (EIAs) على قدرة الأجسام المضادة على اكتشاف جزيئات حيوية معينة تسمى المستضدات والارتباط بها. يرتبط الجسم المضاد الكاشف بالمستضد المستهدف بدرجة عالية من الخصوصية فيما قد يكون مزيجًا معقدًا من الجزيئات الحيوية. كما يشتمل هذا النوع من المقايسة على إنزيم عديم اللون مرتبط بالجسم المضاد الكاشف. يعمل الإنزيم كعلامة على الجسم المضاد الكاشف ويمكن أن يتفاعل مع ركيزة عديمة اللون ، مما يؤدي إلى إنتاج منتج نهائي ملون. غالبًا ما تعتمد تقييمات التأثير البيئي على طبقات من الأجسام المضادة لالتقاط المستضدات والتفاعل معها ، وكلها متصلة بمرشح غشائي (انظر الشكل ( PageIndex {8} )). غالبًا ما تستخدم تقييمات الأثر البيئي للمستضدات الفيروسية كاختبارات فحص أولية. إذا كانت النتائج إيجابية ، فإن المزيد من التأكيد سيتطلب اختبارات ذات حساسية أكبر ، مثل لطخة غربية أو NAAT. تمت مناقشة تقييمات الأثر البيئي بمزيد من التفصيل في تقييمات الأثر البيئي و ELISA.

تمرين ( PageIndex {5} )

ما الذي يشير عادة إلى اختبار EIA إيجابي؟

الجزء 3

جنبًا إلى جنب مع تحليل RT / PCR ، تم أيضًا جمع لعاب David للزراعة الفيروسية. بشكل عام ، لا يوجد اختبار تشخيصي واحد كافٍ لتشخيص ما قبل الوفاة ، لأن النتائج ستعتمد على حساسية المقايسة ، وكمية الفيروسات الموجودة في وقت الاختبار ، وتوقيت الفحص ، منذ إطلاق الفيروسات في اللعاب يمكن أن تختلف. كما اتضح ، كانت النتيجة سلبية للزراعة الفيروسية من اللعاب. هذا ليس مفاجئًا لطبيب ديفيد ، لأن نتيجة سلبية واحدة ليست مؤشرًا مطلقًا على عدم وجود عدوى. قد يكون عدد الفيروسات في اللعاب منخفضًا في وقت أخذ العينات. ليس من غير المعتاد تكرار الاختبار على فترات لتعزيز فرصة اكتشاف حمولات أكبر من الفيروسات.

تمرين ( PageIndex {6} )

هل يجب على طبيب ديفيد تعديل مسار علاجه بناءً على نتائج الاختبارات هذه؟

ملخص

  • تتطلب الزراعة الفيروسية وجود شكل من أشكال الخلية المضيفة (كائن كامل ، أو جنين ، أو ثقافة خلوية).
  • يمكن عزل الفيروسات من العينات بالترشيح.
  • يعتبر المرشح الفيروسي مصدرًا غنيًا للفيروسات المنبعثة.
  • تم الكشف عن الجراثيم من خلال وجود واضح صفائح على العشب البكتيري.
  • تم الكشف عن الفيروسات الحيوانية والنباتية بواسطة آثار الاعتلال الخلوي، التقنيات الجزيئية (PCR ، RT-PCR) ، المقايسات المناعية الإنزيمية ، المقايسات المصلية (مقايسة التراص الدموي ، مقايسة تثبيط التراص الدموي).

مساهم

  • نينا باركر (جامعة شيناندواه) ومارك شنيغورت (جامعة ولاية ويتشيتا) وآنه-هيو ثي تو (جامعة ولاية جورجيا الجنوبية الغربية) وفيليب ليستر (كلية وسط نيو مكسيكو المجتمعية) وبريان إم فورستر (جامعة سانت جوزيف) مع العديد المؤلفين المساهمين. المحتوى الأصلي عبر Openstax (CC BY 4.0 ؛ الوصول مجانًا على https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


عزل فيروس الأنفلونزا أ وثقافته وتحديد هويته

تسبب فيروسات الأنفلونزا أ (IAVs) الأوبئة والأوبئة التي تؤدي إلى عبء مالي كبير وخسائر في الأرواح البشرية. لإدارة أوبئة IAV السنوية والاستعداد للأوبئة المستقبلية ، هناك حاجة ماسة إلى فهم أفضل لكيفية ظهور IAVs ونقلها وتسببها في المرض واكتساب إمكانية حدوث جائحة. التقنيات الأساسية الضرورية للحصول على مثل هذه المعرفة هي عزل IAV وثقافته من العينات التجريبية والمراقبة. نقدم هنا بروتوكولًا مفصلاً لجمع عينات IAV ومعالجتها ، والتضخيم في بيض الدجاج أو خلايا الثدييات ، وتحديد من العينات التي تحتوي على مسببات الأمراض غير المعروفة. هذا البروتوكول قوي ، ويسمح بتوليد ثقافات الفيروسات التي يمكن استخدامها لتحليلات المصب. بمجرد الحصول على عينات تجريبية أو مراقبة ، يمكن إنشاء ثقافات الفيروس ويمكن التحقق من وجود IAVs في 3-5 د عن طريق النسخ العكسي (RT) -PCR أو مقايسة التراص الدموي. قد يلزم زيادة الأطر الزمنية لموظفي المختبر الأقل خبرة ، أو عند معالجة أعداد كبيرة من العينات.

بيان تضارب المصالح

منافسة المصالح المالية

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

الأرقام

الشكل 1. عزل IAV وثقافته وتحديد هويته ...

الشكل 1. IAV عزل وثقافة وتحديد مخطط انسيابي بروتوكول

يشار إلى أجزاء البروتوكول والمكونات الفرعية ...

الشكل 2. تلقيح البويضة الجنينية والسقاء ...

الشكل 2. تلقيح البويضة الجنينية وحصاد السوائل السقاءية

(أ) مقطع طولي رسومي من ...

الشكل 3. آثار الاعتلال الخلوي التي يسببها IAV (CPE) في ...

الشكل 3. آثار الاعتلال الخلوي التي يسببها IAV (CPE) في خلايا MDCK

كانت خلايا MDCK مصابة بالعدوى الوهمية (باستخدام MEM-BSA ...

الشكل 4. مقايسة التراص الدموي (HA)

الشكل 4. مقايسة التراص الدموي (HA)

(أ) العينات التي تفتقر إلى نشاط التراص (اللوحة اليسرى) أو التي تحتوي على IAV ...

تم حصاد الحمض النووي الريبي من مخزون الفيروسات CA04 (H1N1) ، K173 (H1N1) ، ...

يُشار إلى 274 nt) بواسطة شريط على اليمين ، وأحجام معايير DNA مزدوجة الشريطة موضحة على اليسار (Nt = نيوكليوتيدات) وأوصاف الممر - تشير إلى نموذج فيروس الإدخال RNA - يتم توفيرها على يمين لوحة الهلام. (ب) يتم عرض مخططات RT-PCR Rn / Ct في الوقت الحقيقي لكل قالب فيروس. (ج) الرسم البياني يصور قيمة Ct لكل من التفاعلات المرسومة في اللوحة (B). يشير الخط الأحمر المنقط إلى عتبة تحديد عينة موجبة (يجب أن تكون قيمة Ct للعينة أقل من هذا الخط ليتم اعتبارها بثقة "إيجابية").


عزل وفحص وزراعة الفيروسات

يتم عزل الفيروسات من خلايا مضيفة مصابة تحتوي على فيروسات ناضجة. تتعطل الخلايا ميكانيكيًا ويتم إطلاق محتويات الخلية في محلول منظم مناسب. يخضع المعلق المحتوي على الفيريونات ومكونات الخلية للطرد المركزي لعدة مرات بسرعات مختلفة لتجزئة الفيروسات من مكونات الخلية الأخرى. يُعرف هذا الإجراء بالطرد المركزي التفاضلي.

الأسلوب الأكثر دقة هو الطرد المركزي المتدرج الكثافة والذي يتم تطبيقه عادة للحصول على عينة أكثر تنقية من الفيروسات. قبل تعريض عينة الفيروس لطرد مركزي متدرج الكثافة ، يتم تنقيته مبدئيًا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. يتم تحضير تدرج الكثافة في أنبوب الطرد المركزي. على سبيل المثال ، يحتوي تدرج السكروز على تركيز متزايد خطيًا للسكروز من أعلى إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي.

تُسكب عينة الفيروس المنقى جزئياً في الأعلى ويخضع الأنبوب لطرد مركزي عالي السرعة لعدة ساعات في جهاز طرد مركزي فائق. تدفع قوة الطرد المركزي الجزيئات الفيروسية نحو القاع حتى تستقر عند تدرج كثافة السكروز الذي يساوي تلك الموجودة في الفيريونات ، وتشكل منطقة أو عصابة مركزة.

يمكن بعد ذلك إزالة تعليق virions من هذه الفرقة بمساعدة ماصة. يمكن عزل العاثيات المسببة للعدوى اللايتية بطريقة مشابهة إلى حد ما عن طريق الطرد المركزي التفاضلي للمحلول للقضاء على حطام الخلية والخلايا السليمة غير المتحللة للبكتيريا المضيفة.

فحص الفيروسات:

الفحص الفيروسي يعني تحديد عدد الجزيئات الفيروسية لكل وحدة حجم للعينة. عدة طرق متاحة لهذا الغرض. يمكن حساب العدد الإجمالي للجسيمات الفيروسية في العينة بما في ذلك الفيريونات القابلة للحياة وغير القابلة للحياة مباشرة عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني.

لهذا الغرض ، يتم خلط حجم معروف من عينة مطهرة من الفيروس مع حجم معروف لتعليق حبيبات بوليسترين لاتكس دقيقة ذات تركيز معروف. يُرش الخليط في قطرات على غشاء داعم ، ويُجفف ويُظلل.

من نسبة عدد الحبيبات ونسبة الجسيمات الفيروسية ، يمكن حساب عدد الفيريونات لكل وحدة حجم ، عندما يتم فحص المستحضر تحت المجهر الإلكتروني. على سبيل المثال ، إذا كشفت القطرة في المستحضر عن وجود 200 جسيم فيروسي و 20 حبة لاتكس ، فإن تركيز الفيريونات / مل سيكون 200/20 مضروبًا في عدد الحبيبات لكل مل في المعلق.

إذا كان تركيز الخرزة في المعلق الأصلي هو 5 × 10 10 لكل مل. سيكون العد الفيروسي 200/20 × 5 × 10 10 / مل = 5 × 10 11 / مل. يُعرف أيضًا تركيز الفيروسات في العينة باسم عيارها. من بين الطرق الأخرى لفحص العيارات الفيروسية في العينة ، تعد طريقة البلاك طريقة مهمة للغاية.

يستفيد من عدوى الفيروسات وقدرتها على تدمير الخلايا المصابة. تم تطوير طريقة اللويحة لأول مرة للكشف عن العاثيات وعدها ، ثم امتدت بعد ذلك لتشمل دراسة فيروسات الحيوانات. تستخدم طريقة البلاك على نطاق واسع لبساطتها ودقتها وإمكانية تكرار نتائجها.

لفحص العاثيات ، يتم تخفيف العينة عدة أضعاف (

10 -20 إلى 10-25) وخلطها مع قطرة من الثقافة السائلة الكثيفة للبكتيريا المضيفة وبضعة مليلتر من وسط أجار ناعم منصهر عند 44 درجة مئوية. يُسكب الخليط على سطح أجار مغذٍ صلب وصلب بالفعل في طبق وينتشر بشكل موحد للسماح بتوزيع العاثيات والبكتيريا بالتساوي.

يكشف حضانة الصفائح بين عشية وضحاها عن وجود عدد من المناطق الواضحة ، المعروفة باسم اللويحات ، على العشب من النمو المستمر للبكتيريا المضيفة. تتشكل اللويحات بسبب العدوى وتدمير الخلايا المضيفة مما ينتج المناطق الصافية. يتناسب عدد اللويحات مع تركيز الفيروس.

يتم إنتاج كل لوحة بواسطة وحدة تشكيل البلاك (PFU). وهكذا ، إذا تم طلاء قسامة مقدارها 0.1 مل من 10-20 تخفيف لعينة الملتهمة وأنتجت ما معدله 40 لوحة لكل لوح ، فإن العيار يكون 40 / 0.1 × 10 20 PFU / ml. وتجدر الإشارة إلى أن عدد PFUs لا يمكن اعتباره مساويًا لعدد العاثيات ، لكن الاثنين يتناسبان مع بعضهما البعض.

كما تم استخدام طريقة البلاك مع التعديل اللازم لفحص فيروسات الحيوانات. بدلاً من البكتيريا ، يتم استخدام تعليق من خلايا الحيوانات المستزرعة كمضيف. يتم استبدال وسيط المغذيات البكتريولوجية بوسط مغذي مناسب لزراعة الخلايا الحيوانية.

كما في حالة مقايسة العاثية ، يتم تخفيف العينة الفيروسية بشكل متسلسل وتنتشر قسامات من التخفيفات المناسبة على طبقات أحادية من خلايا ثقافة المضيف التي تنمو على دعامة صلبة على سبيل المثال في بتريديش. يُسمح للفيريونات بالالتصاق بالخلايا المضيفة لمدة ساعة أو نحو ذلك ، ثم تُغطى الطبقة الأحادية بأجار ناعم أو بعض وسط التبلور الآخر لمنع الانتشار الأفقي الحر للجزيئات الفيروسية.

تبقى جزيئات النسل المعدية المنبعثة من تحلل الخلايا المصابة موضعية إلى حد ما لإنتاج بؤر أو لويحات. يمكن حساب اللويحات لتحديد معدل العدوى لعينة الفيروس. قد يتطلب تطوير اللويحات المرئية من يوم إلى يومين أو حتى عدة أسابيع حسب الفيروس. لتسهيل اكتشاف وإحصاء اللويحات ، قد يكون من الضروري تلطيخ طبقة الخلية بصبغة مثل اللون الأحمر المحايد الذي يلوث الخلايا الحية فقط ، أو بقعة مثل أزرق تريبان الذي يلوث الخلايا الميتة فقط. تعتمد دقة مقايسة البلاك على عدد اللويحات المحسوبة.

إذا ظهرت الكثير من اللويحات على الصفيحة ، فإن بعضها يميل إلى الاندماج. نتيجة لذلك ، يصبح العد أقل مما ينبغي أن يكون. تنتج العديد من الفيروسات لويحات حادة ، بينما ينتج البعض الآخر لويحات ذات هامش منتشر.

مرة أخرى ، تنتج بعض الفيروسات لويحات كبيرة والبعض الآخر ينتج عنه لويحات صغيرة. اعتمادًا على طبيعة الفيروس المراد تقييمه ، يتم تحديد التخفيف وفقًا لذلك للحصول على نتائج موثوقة. في حالة العاثيات ، يتناسب عدد اللويحات في اللوحات مع تركيز الفيروس ، أي أن العلاقة بين رقم البلاك والتركيز الفيروسي خطية.

طريقة أخرى لفحص فيروسات الحيوانات التي تم استخدامها سابقًا والآن تم التخلي عنها عمليًا واستبدالها بمقايسة البلاك وهي اختبار البلاك. في هذه الطريقة يتم تلقيح العينة الفيروسية المخففة بشكل مناسب في الطبقة الظهارية من الغشاء chrioallantoic (CAM) لجنين كتكوت في بيضة دجاج مضغ. تظهر آفات العدوى المميزة ، والتي تسمى البثور ، بعد فترة حضانة من 36 إلى 72 ساعة. البثور عبارة عن مناطق معتمة - عادة ما تكون بيضاء - ويمكن وضعها على CAM الشفاف.

يمكن أيضًا تعديل طريقة البلاك بشكل مناسب لتعداد فيروسات النبات. لهذا الغرض ، يتم تطبيق حجم معروف من عينة مخففة بشكل صحيح من فيروس النبات على سطح ورقة نبات مضيف حساس بعد إصابة الورقة ميكانيكيًا بفرك السطح بشكل طفيف بمادة كاشطة مثل الكربوراندوم.

بعد الحضانة لعدة أيام تظهر آفات نخرية على الورقة. من عدد الآفات لكل وحدة مساحة ، عامل التخفيف للعينة الفيروسية المطبقة وحجم اللقاح ، يمكن حساب تركيز (عيار) الفيروس.

زراعة الفيروسات:

كطفيليات ملزمة ، لا يمكن أن تنمو الفيروسات في وسط صناعي غير حي مثل البكتيريا أو الفطريات. يمكن أن تتكاثر فقط في الخلايا الحية.

(ط) البيض الجنيني:

واحدة من أقدم الطرق - ولكنها لا تزال شائعة لزراعة فيروسات الحيوانات - هي استخدام بيض الدجاج المخصب أو البيض الجنيني الذي يحتوي على جنين صغير (6-12 يومًا). يمكن أن تتكاثر فيروسات حيوانية مختلفة في أجزاء مختلفة من هذا البيض.

يوضح الشكل 6.33 الأجزاء المختلفة من بيضة الدجاج المُضغّة:

من الأجزاء المختلفة من البويضة المُضغَغة ، يتم استخدام التجويف السقائي والغشاء المشيمي (CAM) لزراعة معظم فيروسات الحيوانات ، على الرغم من استخدام كيس الصفار والجنين أيضًا في بعض الفيروسات. يتم تلقيح CAM لنمو فيروسات الجدري. الآفات (البثور) هي بقع بيضاء رمادية مرئية. ينمو فيروس النكاف بشكل تفضيلي في التجويف السقائي. كما ينمو فيروس الأنفلونزا وداء الكلب في التجويف السقائي.

للتلقيح ، يتم تعقيم سطح البيض بعامل تعقيم السطح. يتم حفر ثقب من خلال القشرة وغشاء القشرة ويتم إدخال التعليق الفيروسي في الجزء المناسب من خلال إبرة حقنة تحت الجلد. ثم يتم سد الثقب بالبارافين ويتم تحضين البويضة الملقحة لمدة 5 إلى 12 يومًا.

(2) ثقافات الخلايا الحيوانية:

أدى تطوير طرق زراعة الخلايا الحيوانية في المختبر إلى تحسين انتشار فيروسات الحيوانات بشكل كبير. قدمت الخلايا الحيوانية المستزرعة تقنيات كمية لدراسة فيروسات الحيوانات مماثلة لتلك المطبقة في دراسة الفيروسات البكتيرية. يمكن استخدام الثقافات ذات الأصل المختلف لزراعة فيروسات معينة ، لأنه مثلما لا يمكن لجميع الفيروسات أن تصيب وتتكاثر في جميع الكائنات الحية المضيفة ، لذلك لا يمكن أيضًا نشر جميع الفيروسات في جميع مزارع الخلايا.

تختلف خلايا الحيوانات المستزرعة في نواح كثيرة عن مزارع الكائنات الحية الدقيقة. أحد أهم الاختلافات هو أن مزارع الخلايا المنتجة من الأنسجة الطبيعية لا تعيش بشكل عام عند النقل المتكرر. بعد مرور بعض الوقت لا ينقسمون ويموتون. تسمى مزارع الخلايا هذه المشتقة من الأنسجة المضيفة الثقافات الأولية. الثقافات الأولية المشتقة من الأنسجة الجنينية قادرة على الاستمرار في النمو لفترة أطول من مزارع الخلايا الناشئة من الأنسجة البالغة.

لإنشاء مزرعة أولية ، يتم معالجة قطعة صغيرة من نسيج الحيوان بالتريبسين لفصل الخلايا. تتم إزالة التربسين عن طريق الطرد المركزي ويتم تعليق الخلايا. يتم وضع المعلق في وعاء زجاجي أو بلاستيكي مع وسط سائل ، مثل وسيط Eagle & # 8217s.

عند الحضانة ، تلتصق الخلايا بسطح الحاوية وتنقسم بشكل انقسامي لإنتاج خلايا ابنة تنتشر على شكل طبقة واحدة سميكة متكدسة النمو المستمر الذي يغطي سطح الحاوية (أحادي الطبقة).

يمكن تلقيح مزارع الخلايا الأولية في طبقات أحادية بفيروسات حيوانية مما يؤدي إلى تكوين لويحات. يمكن جمع الفيروسات وتنقيتها من اللويحات. يمكن تحضير الثقافات الأولية من أنسجة مختلفة من حيوانات مختلفة. الثقافات الأولية المستخدمة بشكل شائع هي زراعة خلايا الكلى لقرد الريس ، وزراعة الخلايا الليفية لجنين الفرخ ، وزراعة خلايا السلى البشرية ، إلخ.

تتمثل إحدى قيود مزارع الخلايا الأولية في أنها قصيرة العمر نسبيًا ولا يمكن الاحتفاظ بها إلى أجل غير مسمى في الثقافات الفرعية ، مثل تلك الموجودة في الكائنات الحية الدقيقة. تفقد الخلايا الفردية القدرة على الانقسام بعد عدة أجيال من الخلايا. تفقد معظم مزارع الخلايا البشرية قدرتها على الانقسام بعد حوالي 50 تكرارًا.

في بعض الأحيان ، يحدث أن يكتسب استنساخ مشتق من خلية طبيعية للثقافة الأولية القدرة على النمو إلى ما لا نهاية. مثل هذا الاستنساخ الذي له قدرة تقسيم غير محدودة يؤدي إلى ظهور خط خلوي. يمتاز الخط الخلوي المشتق من ثقافة أولية بعمر أطول من الثقافة الأم الأولية ، ولكنه ليس خالدًا حقًا.

أثناء النقل المتكرر لخط الخلية ، قد تنشأ نسخة من الخلايا المحولة تلقائيًا. هذه الخلايا هي خلايا سرطانية وقادرة على إنتاج السرطان عند إدخالها في الحيوان المناسب. تشكل هذه الخلايا المحولة خطوط الخلايا الدائمة. يمكن إنشاء خطوط الخلايا الدائمة مباشرة من مزارع الأنسجة الخبيثة للمضيفين ، أو يمكن إنتاجها لإصابة مزارع الخلايا الطبيعية بالفيروسات المسرطنة.

تختلف خلايا هذه الخطوط الخلوية الدائمة في التشكل واتجاه الخلية والتكوين الكروموسومي من خلايا الثقافات الأولية وخطوط الخلايا المشتقة منها. تم إنشاء خطوط خلايا دائمة مختلفة من أنسجة مختلفة ومصادر مختلفة على سبيل المثال عنق الرحم البشري ، والكبد ، والسلى ، والكلى القرد ، وكلى الهامستر ، والنسيج الضام للفأر وما إلى ذلك. واحدة من أشهر خطوط الخلايا البشرية الدائمة هي خلايا هيلا المشتقة من سرطان عنق الرحم لامرأة من أصل أفريقي تدعى هنريتا لاكس.

(3) الجراثيم:

لا تمثل زراعة العاثيات صعوبة ، لأنها تتكاثر في نمو البكتيريا المضيفة إما في المرق أو في وسط متصلب. عندما يتم إضافة لقاح يحتوي على ملقم ليتي إلى مزرعة بكتيرية سائلة نشطة النمو ، تنخفض درجة العكارة وتصبح الثقافة شبه واضحة بسبب تحلل الخلايا. عن طريق إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي ، يمكن الحصول على محصول غني من البكتيريا.

Similarly, when a bacterial culture growing in a petridish is inoculated with a phage suspension, the bacteria may be completely lysed, except a few phage resistant colonies. If the number of bacteria far exceeds the number of phages in the inoculum, then individual plaques are formed.

When a temperate bacteriophage Is inoculated into a liquid culture of the appropriate host bacterium, the turbidity decreases transiently and then increases. In agar cultures, the temperate phages produce turbid plaques. Turbid plaques result because a small proportion of the host bacteria undergo the lytic cycle, while the rest enters into lysogenic relationship.

(iv) Plant Viruses:

Plant viruses are generally propagated by direct inoculation of susceptible host plants. Viral inoculum is introduced into the leaf cells by causing artificial mechanical injury, such as rubbing with an abrasive. The viral particles enter through the disrupted cell walls into the cytoplasm of leaf cells where they multiply.

Some viruses, like TMV, may multiply in such great numbers that the progeny TMV particles may account for as much as 10% of the dry weight of the infected tobacco leaves. By disruption of the plant cells and by differential centrifugation TMV can be isolated in mass.

In more recent times, some success has been obtained in cultivating plant viruses in plant protoplast cultures. For example, protoplasts prepared from tobacco leaf mesophyll cells can be infected with TMV. Some plant viruses, like the Rhabdovirus causing necrotic yellow disease of lettuce, can multiply both in the plant host as well as in the insect vector. Such viruses can be grown in the vector cell culture. Lettuce necrotic yellow virus has been successfully grown in monolayers of cell cultures derived from leaf hopper giving an yield of about 10,000 virions per cell.


Cardiovascular Infections

إدارة

One should attempt virus identification by viral cultures from the blood, stool, or throat washing. Acute and convalescent sera should be compared for serologic titer rise.

Bed rest and limitation in activities are recommended during the acute phase (because exercise intensifies the damage from myocarditis in experimental animals).

Anticongestive measures include the following: a.

Rapid-acting diuretics (furosemide or ethacrynic acid, 1 mg/kg, each one to three times a day).

Rapid-acting inotropic agents, such as dobutamine or dopamine, are useful in critically ill children.

Oxygen and bed rest are recommended. Use of a “cardiac chair” or “infant seat” relieves respiratory distress.

Digoxin may be given cautiously, using half of the usual digitalizing dose (see Table 27-5 ), because some patients with myocarditis are exquisitely sensitive to the drug.

Beneficial effects of high-dose gamma globulin (2 g/kg, over 24 hours) have been reported. The gamma globulin was associated with better survival during the first year after presentation, echo evidence of smaller LV diastolic dimension, and higher fractional shortening compared with the control group. Myocardial damage in myocarditis is mediated in part by immunologic mechanisms, and a high dose of gamma globulin is an immunomodulatory agent, shown to be effective in myocarditis secondary to Kawasaki disease.

Angiotensin-converting enzyme inhibitors, such as captopril, may prove beneficial in the acute phase (as demonstrated in animal experiments).

Arrhythmias should be treated aggressively and may require the use of IV amiodarone.

The role of corticosteroids is unclear at this time, except in the treatment of severe rheumatic carditis (see Chapter 20 ).

Specific therapies include antitoxin in diphtheritic myocarditis.


Isolation and Cultivation of Microorganisms

Microorganisms occur in natural environment like soil. They are mixed with several other forms of life. Many microbes are pathogenic. They cause a number of diseases with a variety of symptoms, depending on how they interact with the patient. The isolation and growth of suspected microbe in pure culture is essential for the identification and control the infectious agent.

The primary culture from natural source will normally be a mixed culture containing microbes of different kinds. But in laboratory, the various species may be isolated from one another. A culture which contains just one species of microorganism is called a pure culture. The process of obtaining a pure culture by separating one species of microbe from a mixture of other species, is known as isolation of the organisms.

Methods of Isolation:

There are special techniques employed to obtain pure cultures of microorganisms. In few cases it is possible to secure pure culture by direct isolation or direct transfer. This can be done only in those situations in which pure culture occurs naturally. Kinds of specimens taken for culturing will depend on the nature and habitat of microbes.

Different pathogens can be isolated from body tissues and fluids such as blood, urine, sputum, pus, faces, spinal fluid, bile, pleural fluids, stomach fluids etc. In the blood stream of a patient suffering with typhoid fever, the bacteria Salmonella typhosa may be present.

A pure culture of this bacterium may be obtained by drawing blood sample using a sterilized hypodermic syringe and treating the blood with anticoagulant such as heparin and potassium oxalate. The presence of the anticoagulant prevents the pathogenic microbe from entrapping in fibrin clot. The sample of the blood may be inoculated into a suitable medium.

Following isolation methods are employed to isolate microbes from mixed cultures:

This is most widely used method of isolation. The technique consists of pouring a suitable sterile medium into sterile petriplate and allowing the medium to solidify. By means of a sterile loope or straight needle or a sterile bent glass-rod a small amount of growth preferably from a broth culture or bacterial suspension is streaked back and forth across the surface of agar until about one third of the diameter of the plate has been covered.

The needle is then flamed and streaking in done at right angles to and across the first streak. This serves to drag bacteria out in a long line from the initial streak. When this streaking is completed the needle is again flamed and streaking is done at right angles to the second streak and parallel to the first.

It includes diluting of a mixture of microorganisms until only a few hundred bacteria are left in each millilitre of the suspension. A very small amount of the dilution is then placed in a sterile petriplateby means of a sterile loop or pipette. The melted agar medium is cooled to about 45°C and is poured into plate. The microorganism and agar are well mixed. When the agar is solidified the individual bacterium will be held in place and will grow to a visible colony.

This method is used for the microorganisms which cannot be easily isolated by streaking or plating method. Sometimes when several organisms are present in a mixture, with one organism predominating, the predominating form may be isolated by this method. For example, when raw milk is allowed to sour at room temperature it will, at the time of curding, have a mixture of microorganisms with high percentage of Streptococcus lactis.

If 1 ml of the sour milk is taken into a tube containing 9 ml. of sterile milk (in which no organisms are present) then 1 ml. of this mixture is transferred with a sterile pipette into a second tube of sterile milk and the procedure is repeated i.e. from second to third tube, third to fourth tube until a series of about 10 tubes are inoculated. By this serial dilution, the chances are that a pure culture of S. lactis will be obtained.

4. Enrichment Procedure:

This procedure involves the use of media and conditions of cultivation which favour the growth of the desired species. For example, when a man suffers with typhoid, the intestinal discharge posses small number of Salmonella typhosa when compared with E. coli and other forms.

It is almost impossible to isolate the typhoid organisms because they represent only a fraction of a per cent of the total microorganisms present. The media are therefore derived, which allow the rapid growth of the desired organisms, at the same time inhibiting the growth of other microorganisms.

This is one of the most ideal and difficult method of securing pure culture. In this method a suspension of the pure culture is placed on the under-side of a sterile cover-glass mounted over a moist chamber on the stage of the micros­cope.

While looking through the microscope, a single cell is removed with the help of sterile micropipette and transferred to a small drop of sterile medium on a sterile cover-glass and is mounted on a sterile hanging drop slide, which is then incubated at suitable temperature. If the single cell germinates in this drop, few cells are transferred into a tube containing sterile culture medium which is placed in the incubator to obtain pure culture originated from single cell.

The isolation of anaerobic microorganisms is very difficult. There are certain special techniques by which these organisms are isolated.

Cultivation of Microorganisms:

For cultivating microbes in laboratory, we require culture media. The various mixtures of nutritive substances used for the laboratory cultivation of microorganisms are collectively known as culture media. The culture media serve as soil in which bacteria are planted for the purpose of study.

Culture Media:

Culture media must contain all the essential nutrients required by the organism for its growth and reproduction. A suitable source of energy, building materials and growth factors must be supplied in adequate amounts.

So a culture medium must contain:

Since microorganisms show a considerable variation in their nutritional requirements, no single medium is suitable for growth of all of them.

The different types of culture media employed fall into three groups:

1. Defined or synthetic media:

These are the media prepared from chemical compounds. They are highly purified and specific, an investigator working in another laboratory can duplicate them.

2. Complex or non-synthetic media:

Media that are prepared from ingredients that have not been precisely defined. It contains hydrolysed proteins and vitamin extracts. This type of medium cannot be duplicated by another worker in another laboratory. Peptone is usually produced by boiling beef, by the hydrolysis of its protein. Casein peptone and milk peptone are also used in complex media as the source of amino acids and nitrogen.

All liquid media, whether complex or synthetic may be converted to solid media by adding either gelat in (a protein) or agar-agar, (a complex polysaccharide) extracted from red marine algae. The use of agar has an advantage. The most bacteria are unable to hydrolyze this molecule into more simple components. Since gelatin is a liquid at room temperature, the use agar allows the medium to remain in a solid form while microbes are growing on its surface.

These are used for the cultivation of viruses. For example, fertilized eggs incubated for 8 to 12 days are able to support the growth of many viruses.

In another classification culture media are grouped into following four types:

1. Natural media:

Includes substances occurring in nature, as 1) Milk 2) Eggs 3) Blood 4) Extract of plant and animal tissues.

2. Derived media:

Includes known substances but the chemical composition of each is unknown. Examples are 1. Nutrient broth (prepared by boiling beef to extract nutrients and adding an amino acid-nitrogen source.) 2. Nutrient agar 3. Nutrient gelatin.

3. Chemically defined media:

Exact chemical composition known.

4. Special media:

Include combinations of the other three types of media.

There are four categories of media used in laboratory:

They are prepared with ingredients that will enhance the growth of certain microbes. Enrichment media encourage the growth of the suspected pathogen so that it will become the most pre-dominant type of microbe in the culture. Two types of enrichment media are blood agar and chocolate agar.

They are prepared with ingredients that inhibit the growth of unwanted microbes which might be in the specimen. The inhibitor may be an antibiotic, salt or other chemical. Mixed culture of microbes originally grown in enrichment media may be inoculated into selective media to isolate the desired microbe.

They are designed to differentiate among microbes. Different bacterial species may produce dissimilar colony colours when grown on differential agar. While in differential broth cultures, the media change colour. Differential media are used to confirm the identity of a microbe that has already been isolated by culturing in enrichment and selective media.

They are used to propagate, or keep microbes growing for a long lime. Samples grown on these media may be taken for analysis. The most common propagation media are nutrient broth and agar.

Preparation of Media:

There are three main steps in the preparation of media:

(a) Preparation as solutions of chemicals and adjusting the pH.

(b) Dispensing the media, and

A broth is prepared by dissolving the appropriate amount of the components in distilled water and pH is adjusted by the addition of either dilute NaOH or Hcl. The broth is dispensed into clean rimless ‘Pyrex’ test tubes which are plugged with non-absorbant cotton wool plugs. The test tubes are placed in wire baskets which are covered with grease proof paper.

The media are sterilized by autoclaving at a temperature of 121 °C and a pressure of 151 b/in 2 for 15 minutes. But medium containing heat- sensitive substances are sterilized either by filtering the solution at room temperature, using bacteria-proof filter or by a process called Tyndallization.

In this method, the liquids are steamed for one hour a day on three consecutive days and the liquids are incubated at 25-30°C. During the first steaming, all the heat sensitive vegetative cells are killed, leaving only the spores. During the first incubation period, most of the spores germinate in to vegetative cells. These vegetative cells are killed by the second steam period.

In the second incubation period, the rest of the spores germinate into vegetative cells which are killed by the third steaming period. In this way, the liquids are sterilized without temperature rising above 100°C.

Maintenance of Pure Culture:

After obtaining the pure culture of a particular microbe, it may be grown and maintained as a pure culture in different ways:

1. The most common practice is to grow the culture on suitable medium until it reaches the stationary phase of growth, and then store in a refrigerator. If they are to be kept alive for a long period all culture must be transferred to a fresh sterile medium. Thus by successive transfer, a culture may be kept for an indefinite period.

2. A second method involves freezing of young culture and desiccating it under vaccum. The cells of a pure culture will remain viable for a long period of time if they are mixed with sterile blood serum, sterile skimmed milk, before freezing and drying. They dried cultures are kept in the sealed, evacuated tubes and are stored in cool places.

3. This method of maintaining pure culture is most suitable for spore forming species. The microorganisms are grown in pure culture in suitable media. A suspension of microorganisms is then transferred to cotton stoppered tubes of sterilized dry soil. The spores remain viable, though dormant, for long periods of time, in dry soil. The organism can be grown after a desired period, by transferring the soil into a suitable medium and incubating it under suitable temperature.


Inoculation of Live Animals

Live animal inoculation is a method used to cultivate viruses.

أهداف التعلم

Describe live animal innoculation

الماخذ الرئيسية

النقاط الرئيسية

  • Live inoculation was first used on human volunteers for the study of yellow fever virus.
  • Animals of choice for cultivating viruses include monkeys, rabbits, guinea pigs, rats, hamsters, and mice.
  • Live animal inoculation requires an experienced personnel to perform various inoculation techniques.

الشروط الاساسية

  • كامن: Existing or present but concealed or inactive.
  • oncogenesis: The formation and development of tumors
  • تحصين: The introduction of an antigenic substance or vaccine into the body to produce immunity to a specific disease.

Yellow fever virus: A micrograph of the yellow fever virus.

Viruses are obligate intracellular parasites and cannot grow on inanimate media. They need living cells for replication, which can be provided by inoculation in live animals among other methods used to culture viruses (cell culture or inoculation of embryonated eggs). Inoculation of human volunteers was the only known method of cultivation of viruses and understanding viral disease. In 1900, Reed and his colleagues used human volunteers for their work on yellow fever. Due to serious risk involved, human volunteers are recruited only when no other method is available and the virus is relatively harmless. Smallpox was likely the first disease people tried to prevent by purposely inoculating themselves with other infections and was the first disease for which a vaccine was produced. Today, studying viruses via the inoculation of humans would require a stringent study of ethical practices by an institutional review board.

In the past few decades, animal inoculation has been employed for virus isolation. The laboratory animals used include monkeys, rabbits, guinea pigs, rats, hamsters, and mice. The choice of animals and route of inoculation (intracerebral, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, or intraocular) depends largely on the type of virus to be isolated. Handling of animals and inoculation into various routes requires special experience and training. In addition to virus isolation, animal inoculation can also be used to observe pathogenesis, immune response, epidemiology, and oncogenesis. Growth of the virus in inoculated animals may be indicated by visible lesions, disease, or death. Sometimes, serial passage into animals may be required to obtain visible evidence of viral growth. Animal inoculation has several disadvantages as immunity may interfere with viral growth, and the animal may harbor latent viruses.


Definition of Bacterial Isolation

Bacterial isolation is defined as the technique of separating one species of bacteria from the bacteria’s mixed culture by different plating methods like pouring, spreading, streaking, and serial dilution. The growth of bacteria can be observed over the solid nutrient medium, in the liquid broth medium and some automated liquid culture medium. To visualize and isolate the bacteria in solid media, we need to add the bacterial suspension into or on the media.

Oppositely, the bacterial inoculum in the liquid broth is characterized by the turgid media. ال automated liquid culture medium also detects bacteria’s presence through various characteristics like production of carbon dioxide. Therefore, bacterial isolation provides an important tool to study the morphological, physiochemical and pathogenic properties of the bacteria that has been isolated.


Isolation and characterization of SARS-CoV-2 from the first US COVID-19 patient

The etiologic agent of the outbreak of pneumonia in Wuhan China in January-2020, was identified as severe acute respiratory syndrome associated coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The first US patient was diagnosed by the State of Washington and the US Centers for Disease Control and Prevention on January 20, 2020. We isolated virus from nasopharyngeal and oropharyngeal specimens, and characterized the viral sequence, replication properties, and cell culture tropism. We found that the virus replicated to high titers in Vero-CCL81 cells and Vero E6 cells in the absence of trypsin. We also deposited the virus into two virus repositories, making it broadly available to the public health and research communities. We hope that open access to this important reagent will expedite development of medical countermeasures.

Article Summary Scientists have isolated replication competent virus from the first US COVID-19 patient. The isolated virus described here will serve as the US reference strain to be used in research, drug discovery and vaccine testing.


شاهد الفيديو: #4 Classification of Medically Important Viruses #Virology شرح بالعربي (شهر نوفمبر 2022).