معلومة

علامات البروتين الفلوري والتلوين

علامات البروتين الفلوري والتلوين


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

نريد دراسة ما إذا كان هناك بروتينان A و B في موقع مشترك ، لذلك نستخدم 2 FTP (بروتينات العلامة الفلورية) لكل بروتين؟ وبعد انتهاء صلاحية هذين البروتينين FTP في نفس الموقع. هل هذا يعني بالضرورة وجود البروتينين A و B في نفس الموقع؟


"هل البروتين A و B موجودان في مكان واحد؟" والجواب هو أن ذلك يعتمد. نظرًا لأن سؤال الاختبار الخاص بك تضمن كلمة "بالضرورة" ، فهذا يعني أن الإجابة على سؤال الاختبار هي لا. كل ما عليك فعله هو التفكير في مثال مضاد واحد على الأقل.

هنا زوجان:

  • تم شد التركيبات ذات العلامات المتألقة بطريقة ما ، لذلك تم التعبير عن A و B وكل علامة من العلامات الخاصة بها على أنها 4 بروتينات منفصلة.

  • (وفقًا لتعليق BPinto) ، قد يتم ترجمة البنيات ذات العلامات بشكل مشترك حتى لو لم يكن A و B يقومان بذلك بشكل طبيعي. يمكن أن يحدث هذا ، على سبيل المثال ، إذا كانت العلامات مرتبطة ببعضها البعض ، أو إذا تسببت العلامات بطريقة ما في نقل كلا المركبين إلى عضية معينة.


علامات البروتين الفلوري

تم استخدام البروتينات الفلورية (FPs) كعلامات بروتين منذ منتصف التسعينيات بشكل أساسي لبيولوجيا الخلية والفحص المجهري الفلوري. لم تُحدث هذه العلامات ثورة في بيولوجيا الخلية فقط من خلال تمكين تصوير أي بروتين تقريبًا ، بل إنها تُستخدم أيضًا في التطبيقات البيوكيميائية. مثال مهم هو الترسيب المناعي وتنقية التقارب للبروتينات التي تحمل علامات FP ، والتي تم تمكينها من خلال تطوير راتنجات تقارب ذات إنتاجية عالية ونقاء وتقارب مثل ChromoTek's Nano-Traps (https://www.chromotek.com/products) / تفاصيل / تفاصيل المنتج / مصائد نانو /).

في هذه المدونة نقدم مراجعة

أنواع البروتينات الفلورية

يستخدم معظم الباحثين بروتينات الفلورسنت الجوهرية GFP أو mNeonGreen أو TurboGFP أو RFP أو mCherry. بدلاً من ذلك ، تم إدخال البروتينات الفلورية الخارجية أو البروتينات ذاتية الملصقات التي تتطلب الاقتران التساهمي لجزيء الفلورسنت بالبروتين غير الفلوري ، على سبيل المثال علامات البروتين SNAP و CLIP و Halo. تتمتع هذه البروتينات الفلورية ذاتية الملصق بمزايا أداء معينة على FPs جوهريًا نظرًا لخصائص أصباغها الفلورية.

شكل 1: تراكيب البروتينات الفلورية.

(أ) تشترك البروتينات الفلورية الداخلية (FPs) مثل EGFP و GFP و RFP و mNeonGreen و turboGFP وما إلى ذلك في عدد صغير فقط من المخلفات الشائعة ، ولكن يتم طيها كلها في هيكل برميل محفوظ. ينشأ تألقها من خلال دوران العمود الفقري وأكسدة ثلاث بقايا من الأحماض الأمينية في وسط هذا البرميل (مظللة على اليمين) ، مما ينتج عنه كروموفور ثنائي الحلقات. توصف هذه العملية الكيميائية على أنها نضج الكروموفور ، وهي متأصلة في طية البروتين ، وتعتمد فقط على المتغيرات البيئية مثل درجة الحرارة وتركيز الأكسجين ، ولكن ليس على الإنزيمات الإضافية. إن اللون ، والثبات الضوئي ، والمردود الكمي ، والخصائص الطيفية الأخرى للبروتينات الفلورية المتأصلة هي نتيجة للطفرات داخل الأحماض الأمينية التي تشكل الكروموفور أو الموجودة بالقرب من الكروموفور.

(ب) البروتينات الفلورية الخارجية مثل HaloTag ليست فلورية في شكلها الأساسي apo. فقط إذا تمت إضافة فلوروفور نشط مناسب إلى بروتين HaloTag ، فسيتم التقاط هذا الفلوروفور وربطه تساهميًا بواسطة بقايا HaloTag D106 ، مما يؤدي إلى تحويل الفلورسنت HaloTag. (معرّفات PDB للهياكل: EGFP ، 2y0g apo-HaloTag ، 5uy1 holo-HaloTag ، 5uxz.)

لا يزال بروتين قنديل البحر الأخضر الفلوري (GFP) ومشتقاته أكثر البروتينات الفلورية استخدامًا في البحوث الطبية الحيوية. في الآونة الأخيرة ، تم إدخال بروتينات فلورية خضراء إضافية مشتقة من كائنات حية أخرى. تمتلك FPs نفس الطية الأساسية مثل GFP ولكنها تتباعد على نطاق واسع على مستوى التسلسل. لذلك ، فهي تتطلب أدوات بحث جديدة ومخصصة مثل الأجسام المضادة.

الأصل: GFP

تم عزل البروتين الأخضر الفلوري لأول مرة من قنديل البحر ايكوريا فيكتوريا في عام 1962 بواسطة أوسامو شيمومورا. لديها مضان أخضر طويل من ستوكس (ex 395nm em 509 nm). بعد 30 عامًا ، تمكن دوغلاس براشر في النهاية من استنساخ تسلسل GFP وعبّر Martin Chalfie عن هذا التسلسل في الجسم الحي. في وقت لاحق ، طور مختبر Roger Tsien GFP إلى مجموعة من أدوات البحث الحقيقية. حصل كل من شيمومورا وشالفي وتسين على جائزة نوبل في عام 2008. شاهد محاضرة جائزة نوبل لروجر تسين هنا: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

طور العلماء عددًا كبيرًا من متغيرات GFP ذات الخصائص المختلفة. هذه FPs لها خصائص وظيفية وطيفية مختلفة. كان أول تحسن كبير في GFP طفرة (S65T) زادت من شدة واستقرار إشارة التألق. تم تحويل ذروة الإثارة الرئيسية إلى 488 نانومتر (Heim et al. ، 1995). المتغير الشائع EGFP هو نسخة هندسية من GFP ، مما يسهل الاستخدام العملي لـ GFP في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية والخلايا المختلفة.

يُعرف البروتين الفلوري الأخضر GFP أيضًا باسم avGFP و wtGFP و gfp10 EGFP باعتباره GFP و GFPmut1.

TurboGFP

تم الإبلاغ عن TurboGFP في عام 2004 ، وهو بروتين فلوري أخضر داكن سريع النضج ومشرق مشتق من CopGFP من مجدافيات الأرجل بونتيلينا بلوماتا. يعتبر Copepod TurboGFP بعيدًا تطوريًا عن البروتينات الفلورية المشتقة من قنديل البحر مثل EGFP ولا يشارك سوى حوالي 20 ٪ من هوية التسلسل مع متغيرات GFP شائعة الاستخدام. لذلك ، لا ترتبط معظم الأجسام المضادة لـ GFP بما في ذلك الجسم النانوي GFP المستخدم في GFP-Trap بـ TurboGFP.

MNeonGreen

مشتق mNeonGreen من بروتين أصفر متعدد الأسفار من lancelet Branchiostoma lanceolatum. ومن ثم ، فإن mNeonGreen بعيد تطوريًا عن FPs المشتق من قنديل البحر. تشترك مشتقات mNeonGreen و GFP الشائعة في حوالي 20 ٪ من هوية التسلسل. نظرًا لانخفاض تشابه التسلسل ، من المتوقع ألا ترتبط أدوات التقارب (أي الأجسام المضادة) لمتغيرات GFP بـ mNeonGreen. بالتأكيد ، تم عرض هذا بالنسبة لكواشف ChromoTek (الأجسام النانوية المضادة لـ GFP / VHH والأجسام المضادة).

نُشر لأول مرة في عام 2013 ، mNeonGreen أكثر سطوعًا بثلاث مرات من GFP. إنه بروتين فلوري أخضر / أصفر ناشئ متعدد الاستخدامات أحادي الاستخدامات لتطبيقات التصوير بما في ذلك الفحص المجهري فائق الدقة. علاوة على ذلك ، يعمل mNeonGreen كمستقبل للبروتينات الفلورية السماوية في تطبيقات نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET). يبدو أنه ألمع بروتين فلوري أخضر أحادي اللون معروف حتى الآن وله معدل نضج سريع.


توطين البروتين

تتوافق الأنشطة الوظيفية للبروتين مع التعبير الخلوي والتفاعلات الجزيئية المعقدة. يمكن إثبات التوطين بشكل فعال باستخدام تقنيات المجهر الفلوري أو إجراءات التجزئة. يمكن إنجاز مجموعة واسعة من التصوير الفلوري باستخدام بروتينات مراسل مؤتلف ، (بمعنى آخر. GFP أو SNAP-tag & reg) أو الأصباغ الفلورية (بمعنى آخر. Alexa) ، أو جزيئات الفلوروفور المسمى (بمعنى آخر. الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين). يمكن تعديل الخلايا وراثيًا لإفراط في التعبير عن أهداف البروتين ، أو المكونات التنظيمية للتسلسلات غير المشفرة ، لأغراض مثل تحديد العمليات الخلوية الأساسية ، وآليات المرض ، والعلاج الجيني ، والاستجابة للعلاجات. يمكن الكشف عن علامات بروتين الانصهار بواسطة الأجسام المضادة أو لها خصائص وظيفية لتمكين التوطين. تعد أنظمة وضع العلامات على البروتينات الحيوية والبروتينات الفلورية من أدوات التصوير البصري المهندسة وراثيًا ، مع خصوصية أكبر بتركيزات أقل من الطرق الأخرى. باستخدام هذا النهج ، يمكن أن يكون التصوير في الخلايا أو الأنسجة أو الحيوانات الثابتة أو الحية. من السمات الجذابة للغاية لوصف بروتينات الاندماج أن التسمية نفسها يمكن أن تقتصر على مواقع معينة من الخلية (بمعنى آخر. SNAP-Cell & reg أو SNAP-Surface & reg). لا يمكن تحقيق هذا التمييز بسهولة عند استخدام البروتينات الضيائية الحيوية. تمكّن بعض أنظمة وضع العلامات على البروتين الفلوريسنت الجزيئات الصغيرة غير الفلورية من أن تصبح فلورية عند ارتباطها بتسلسل ببتيد صغير مُدرج جينيًا في البروتين المستهدف محل الاهتمام (بمعنى آخر. فلاش). جعلت التطورات في أنظمة التألق المهندسة وراثيًا والآلات البصرية المجهرية التصوير طريقة أساسية لتوطين البروتين.

SNAP-tag & reg و SNAP-Cell & reg و SNAP-Surface & reg هي علامات تجارية مسجلة لشركة New England Biolabs، Inc.

اختر النوع:

  • أسئلة وأجوبة
  • البروتوكولات
  • ملاحظات طلب التقديم
  • الأدوات والموارد
  • المنشورات
  • ميزات SNAP-tag / CLIP-tag
  • تطبيقات SNAP-tag / CLIP-tag
  • مزايا علامة ACP / MCP
  • وسم البروتين بعلامة SNAP وعلامة CLIP
  • وسم البروتين بعلامة ACP
  • SNAP-tag & reg و CLIP-tag & trade و ACP / MCP-tag Substrate Selection Chart
  • المعلومات القانونية

مقالات

اقرأ عن مجموعة أدوات البروتين الخاصة بـ NEB لوضع العلامات المحددة (علامات SNAP- و CLIP- و ACP- و MCP) لبروتينات الاندماج.

كتيبات

أدوات التحديد

أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  • استنساخ والتعبير مرة واحدة ، ثم استخدم مع مجموعة متنوعة من الركائز
  • غير سام للخلايا الحية
  • مجموعة واسعة من ركائز الفلورسنت
  • العلامات التساهمية المحددة للغاية
  • وضع العلامات المزدوجة المتزامنة
  • وضع العلامات البروتينية المزدوجة المتزامنة داخل الخلايا الحية
  • توطين البروتين والانتقال
  • تجارب مطاردة النبض
  • دراسات استيعاب المستقبلات
  • وسم سطح الخلية الانتقائي
  • فحوصات البروتين المنسدلة
  • الكشف عن البروتين في SDS-PAGE
  • التدفق الخلوي
  • فحوصات ملزمة عالية الإنتاجية في لوحات ميكروتيتر
  • تجارب تفاعل المستشعر الحيوي
  • فحوصات الربط القائمة على الحنق
  • وسم جزيء واحد
  • الفحص المجهري فائق الدقة
  • العلامة الصغيرة & ndash المعبر عنها هي فقط 8 كيلو دالتون (77aa)
  • يمكن التعبير عن الاندماجات ذات العلامات متعددة الاستخدامات و ndash ACP و MCP بشكل مشترك وتسميتها بالتسلسل لتطبيقين من الألوان على أسطح الخلايا
  • تظل المكونات المحددة & ndash خارج الخلية بشكل حصري ، مما يمنع وضع العلامات داخل الخلايا
  • الدقة & ndash التسمية ملزمة تساهميًا في ظل الظروف البيولوجية في وضع محدد
  • ركائز - غير سامة - غير سامة للخلايا الحية
  • اختيار & ndash اختيار الركائز المتاحة ، بما في ذلك 488 ، 547 ، 647 نانومتر والبيوتين

هذا المنتج مغطى بواحدة أو أكثر من براءات الاختراع والعلامات التجارية و / أو حقوق النشر المملوكة أو الخاضعة لسيطرة New England Biolabs، Inc (NEB).

بينما تقوم NEB بتطوير منتجاتها والتحقق منها لتطبيقات مختلفة ، فإن استخدام هذا المنتج قد يتطلب من المشتري الحصول على حقوق ملكية فكرية إضافية لطرف ثالث لتطبيقات معينة.

لمزيد من المعلومات حول الحقوق التجارية ، يرجى الاتصال بفريق تطوير الأعمال العالمية في NEB على [email protected]

هذا المنتج مخصص لأغراض البحث فقط. هذا المنتج غير مخصص للاستخدام لأغراض علاجية أو تشخيصية في البشر أو الحيوانات.

أشرطة فيديو

برنامج تعليمي لإلقاء نظرة عامة على SNAP-TAG & reg

شاهد برنامجًا تعليميًا تفاعليًا يشرح آلية تقنيات وكواشف SNAP-tag & reg المتاحة للباحثين الراغبين في دراسة وظيفة البروتينات وتوطينها في الخلايا الحية أو الثابتة.

الملصقات الفلورية لـ COS-7 التي تعبر عن بروتينات الانصهار SNAP-TAG & reg للتصوير بالخلايا الحية

شاهد كريس بروفوست ، من New England Biolabs ، وهو يقوم بالتصوير الفلوري لخلايا COS-7 الحية التي تعبر عن بروتينات SNAP-tag & reg الانصهار.


نتائج ومناقشة

المتغيرات المصممة بشكل عقلاني من انقسام BFP و CFP

لتوسيع لوحة الألوان الخاصة بنا من FPs المنقسمة ، قمنا بتقسيم EBFP2 في نفس موقع GFP1-10/11 (لاحظ أن EBFP2 أكثر سطوعًا بمقدار 4 أضعاف وثبات ضوئي أكبر بمقدار 500 ضعف من EBFP 16). بينما الجزء القصير مطابق لتسلسل الأحماض الأمينية لـ GFP11، تم إدخال ستة بدائل في الجزء الكبير من خلال الطفرات الموجهة للموقع (N40I / T106K / E112V / K166T / I167V / S206T يتبع ترقيم الأحماض الأمينية رقم EBFP2). وقد سبق أن ثبت أن هذه البدائل تعزز كفاءة تكامل GFP1-10 المتغيرات 1. للتحقق من التكامل في الجسم الحي بين الجزأين ، استخدمنا GFP11- الموسومة β- أكتين وهيستون 2 ب. شارك في التعبير عن كل واحد مع EBFP21-10 في خلايا هيلا ، لاحظنا التألق الأزرق في صور ألياف إجهاد الأكتين والنيوكليوبلازم (الشكل 1 أ ، ب). في بعض الحالات (على سبيل المثال ، صورة الأكتين) ، يحد التألق الذاتي من فائدة هذا البناء المقسم لأن إشارة الفلورسنت الإجمالية ضعيفة للغاية. في الواقع ، غالبًا ما تُلاحظ خلفية عالية التألق الذاتي مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية في المنطقة المحيطة بالنواة (الشكل التكميلي 2). لتحسين سطوعها الكلي ، قررنا إضافة ستة بدائل أخرى إلى EBFP21-10 (S65T / Q80R / F99S / V128T / M153T / V163A تم وصف بعض هذه سابقًا لتعزيز الاستقرار ومعدل الطي لـ GFP 1،17). هذا الانقسام FP الجديد ، الذي يُطلق عليه اسم كابري المنفصل للون الأزرق السماوي ، له نفس طيف الامتصاص مثل EBFP2 المنقسم (الشكل التكميلي 3). ومع ذلك ، يتم إزاحة طيف الانبعاث باللون الأحمر من تقسيم EBFP2 بمقدار 20 نانومتر (λعضلات المعدة/λم = 379/469 نانومتر). علاوة على ذلك ، فإن ذروة معامل الانقراض البالغ 37300 م -1 سم -1 والعائد الكمي 0.13 ، أكبر من تلك الخاصة بـ EBFP2 المنفصل (الجدول التكميلي 1). عندما يرتبط بـ GFP11-الموسومة β-actin أو H2B ، كابري1–10 يُظهر مضانًا ساطعًا جدًا في خلايا هيلا (الشكل 1 ج ، د). لتقييم التحسن في السطوع الناتج ، شاركنا في التعبير عن GFP11-H2B في خلايا HEK 293T مع EBFP21-10 أو كابري1-10. عند قياس شدة تألق الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وجدنا أن كابري1-10/11 كان لديه مضان أكثر إشراقًا بأربعة أضعاف من EBFP21-10/11 (الشكل التكميلي 4).

أF صور متحد البؤر لخلايا هيلا. الخلايا تشارك في التعبير عن EBFP21-10 (أ, ب) ، كابري1-10 (ج, د) ، و Cerulean1-10 (ه, F) مع GFP11- الموسومة β- أكتين أو هيستون 2B.

بالإضافة إلى المتغيرات BFP ، تمت دراسة FPs ذات اللون السماوي على نطاق واسع. عندما قدمنا ​​البدائل في GFP1-10 (Y66W لجعل CFP1-10) ، لوحظ تكملة مضان ل GFP11-β-أكتين أو GFP11-اندماج H2B معربا مشتركا مع CFP1-10 في خلايا هيلا (الشكل التكميلي 5). ومع ذلك ، فمن الملاحظ في الشكل أن السطوع الكلي لـ CFP1-10 ضعيف نسبيًا ، مما يجعل من الصعب تصور خيوط الأكتين الرقيقة (أفاد تقييم أخير في المختبر أيضًا أن CFP المنقسم لديه سطوع منخفض 10). لذلك ، سعينا لإنتاج FP بلون سماوي يعزز السطوع. أدى التحسين الأخير لـ CFP كامل الطول ، المسمى Cerulean ، إلى زيادة السطوع بمقدار

1.6 ضرب 18. لأن البدائل المعروفة موجودة فقط على GFP1-10 (Y66W / S72A / Y145A / H148D لـ Cerulean) ، سيرولين1-10 يمكن أن يرتبط مع GFP11. لتقييم التحسن في سطوعه العام للفحص المجهري الخلوي ، قمنا بإعداد البلازميدات التي ترميز Cerulean1-10 أو CFP1-10. شاركنا في نقل كل واحدة من هذه البلازميدات باستخدام GFP11-بلازميد H2B في خلايا HEK 293T. بالتصوير عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، قمنا بتحديد مستوى إشارة هذه FPs المنقسمة. وجدنا أن Cerulean1-10 كانت الإشارة

1.7 مرة أكثر سطوعًا من CFP1-10 (ص & lt 0.0001 ، طالب ر- الاختبار التكميلي الشكل 6). قمنا بعد ذلك بتقييم أداء Cerulean1-10 عند استخدامها كعلامة اندماج. استخدمنا GFP11-مصهر β-actin أو H2B وشارك في التعبير عن كل واحد مع Cerulean1-10 في خلايا هيلا (الشكل 1 هـ ، و). على الرغم من أننا لاحظنا تكملة Cerulean1-10 في المواقع المناسبة ، أظهرت بعض الخلايا حزم أكتين أكثر سمكًا ، والتي لم نرها من قبل في الخلايا التي تعبر عن اندماج Cerulean كامل الطول (الشكل 1 هـ والشكل التكميلي 7). نظرًا لأن هذه الأداة شائعة بالنسبة إلى FPs ثنائية الأبعاد أو رباعية الأبعاد عندما تكون مستهدفة لهياكل ثنائية الأبعاد 19،20 ، فإننا نشك في أن Cerulean1-10/11 هو FP انقسام قليل القسيمات. ومع ذلك ، يلزم إجراء تحقيق متعمق للتحقق من صحة هذه الخاصية في تقسيم Cerulean وفي ظل ظروف تجريبية مختلفة أكثر.

هندسة متغير FP مقسم باللون الأحمر يعتمد على mRuby3

على الرغم من أن الجهود التنموية جارية لتحسين سطوع تقسيم sfCherry 2،13،14 ، فإن وجود FPs الحمراء المنقسمة طيفيًا من شأنه أن يعزز الفائدة الإجمالية لـ FP11-العلامات. نظرًا لأن sfCherry2 له ذروة انبعاث متغيرة للغاية عند 610 نانومتر ، فقد سعينا لاستكشاف تطور FPs البرتقالي والأحمر مثل mKO2 و mRuby3 و mApple و mScarlet-I 15،21،22،23 بوصة بكتريا قولونية. باتباع النهج المحدد مسبقًا 13 ، قمنا بإدخال 30 فاصل حمض أميني بين 10 و 11 β حبلا من أربعة FPs. قلل إدخال الفاصل الطويل بشكل كبير من تألق مستعمرة mKO2 و mApple و mScarlet-I ، بينما ظلت المستعمرات التي تعبر عن فاصل mRuby3 الفلورية (الشكل التكميلي 8). لتحسين سطوع mRuby3 الذي تم إدخاله في المباعد ، قمنا بتحويله باستخدام PCR المعرض للخطأ ثم تحويله إلى بكتريا قولونية تم تجميع ألمع المرشحين الثلاثة وخضوعهم لجولة أخرى. بعد ثلاث جولات ، تم تجديد سطوع أفضل مرشح بستة أضعاف مقارنةً بسطوع mRuby3 المُدرج بالفاصل (الشكل التكميلي 9). وجدنا سبعة تبديلات في mRuby31-10 (M15T / Q27H / T31I / V106I / S113C / R126S / A154V) ووصف هذا الانقسام المتغير mRuby4 (λعضلات المعدة/λم = 557/592 نانومتر ، انظر أيضًا الشكل التكميلي 3 لطيف الامتصاص الخاص به). مقارنةً بتقسيم mRuby3 ، أنشأنا متغيرًا ساطعًا بشكل خاص له معامل انقراض أعلى وعائد كمي متزايد (الجدول التكميلي 1).

لتقييم ما إذا كان mRuby4 المنفصل يمكن أن يتألق في الخلايا البشرية ، قمنا بالتعبير عن mRuby4 بشكل مفرط11-β- أكتين مع mRuby41-10 في خلايا هيلا. لاحظنا أن mRuby4 الانقسام المكمل له إشارة ساطعة في الصور الفلورية للأكتين وبروتينات الاندماج المختلفة (الشكل 2 أ-و). لتحديد مستوى إشارة الانقسام mRuby4 ، أجرينا قياس التألق الخلوي عن طريق قياس التدفق الخلوي وقارننا الإشارة إلى mRuby كامل الطول. مع التعبير عن mRuby4 الذي تم إدخاله في المباعد في خلايا HEK 239T ، وجدنا أن مستوى إشارته أصبح حوالي 69 ٪ من mRuby3 كامل الطول (الشكل التكميلي 10). لقد أظهرنا أيضًا أن mRuby41-10/11 لديه كفاءة كافية للكشف عن البروتينات المعبر عنها في المستويات الداخلية. استخدمنا تقنية HDR بوساطة CRISPR / Cas9 وقدمنا ​​مانحًا لـ 200 نيوكليوتيد ssDNA في HIST2H2BE موضع خلايا HEK 293FT التي تعبر عن mRuby41-10. بعد ذلك ، وجدنا أن تكملة mRuby4 المنقسمة لها إشارة بارزة في صور mRuby411 knock-in (الشكل التكميلي 11).

أF تشارك الخلايا في التعبير عن mRuby41-10 مع mRuby411- بروتينات خلوية مصهورة. لكل منها ، يشار إلى اسم شريك الاندماج وموقعه الخلوي الطبيعي ، على التوالي β-actin ، ألياف إجهاد الأكتين (أ) زيكسين ، التصاق بؤري (ب) هيستون 2 ب ، نوى (ج) ، سلسلة Clathrin الخفيفة ، حفر مطلية بالكالذرين (د) كيراتين شعيرات وسيطة (ه) Lamin A / C ، مغلفات نووية (F). ز أطياف انبعاث الفلورة الطبيعية لـ FP1-10/11 المتغيرات في خلايا هيلا. (ح) HEK 293 خلية تعبر عن H2B المسمى بـ EBFP21-10/11، كابري1-10/11، سيرولين1-10/11، GFP1-10/11، mRuby41-10/11أو sfCherry21-10/11 تمت تربيتهم في نفس الطبق. يتم تمثيل الصور غير المختلطة طيفيًا في المراحل المختلفة من الانقسام (انظر أيضًا الشكل التكميلي 14). أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر.

كما هو مبين في الشكل 2g ، فإن قمم الانبعاث الخاصة بتقسيم mRuby4 و sfCherry2 المنقسمة لا تفصل بينهما سوى 20 نانومتر ولكن لا يزال من الممكن تمييزها بصريًا (الشكل التكميلي 12). لمزيد من التقييم لعدد FPs المنقسمة التي يمكن تصورها في وقت واحد في خلايا مختلفة ، أجرينا التصوير الطيفي لخلايا HEK 293 التي تعبر عن بروتينات H2B المدمجة (الشكل 2g). شاركنا في زراعة ستة أنواع من خلايا HEK 293 ، كل منها يعبر عن H2B المسمى بـ EBFP21-10/11، كابري1-10/11، سيرولين1-10/11، GFP1-10/11، mRuby41-10/11أو sfCherry21-10/11. بعد أن قمنا بالمزامنة في مرحلة G2 / M بالإفراج عن مثبط كيناز المعتمد على السيكلين ، قمنا بتصوير الخلايا (الشكل التكميلي 13). في غضون ساعتين ، كان 20 ٪ من السكان في الخلايا الخلوية ، وهو ما يتوافق مع الأدبيات السابقة 24. ثم قمنا بالتقاط الخلايا مع كل انصهار FP منقسم في مراحل مختلفة من الانقسام (الشكل 2 ح). بشكل عام ، توضح هذه التجارب التصوير الطيفي بستة ألوان للبروتينات الخلوية.

تقييم الانقسام FP1-10/11 أنظمة للتصوير المتعدد في الخلايا المفردة

تفاعل متعامد بين GFP1-10/11 و sfCherry21-10/11—يعني GFP11 يمكن أن تتفاعل مع GFP1-10، ولكن لا يمكن التفاعل مع sfCherry21-10- هو أساس الوسم المتزامن لبروتينين اندماج مختلفين في خلية مفردة. مع مجموعة من FP1-10/11 تم تطوير أزواج ، سعينا إلى اختبار خصوصيات الربط الخاصة بهم بشكل منهجي عن طريق قياس التدفق الخلوي. GFP1-10/11، sfCherry21-10/11، mNeonGreen21-10/11 13 و mRuby41-10/11 تم فحصها للتكامل في خلايا HEK 293T. كل FP1-10 تم التعبير عن جزء مع أي واحد من أربعة FP11- الأكتين المصهور ، وتم اختبار التفاعلات على طول قطري الشبكة (الشكل 3 أ). كما هو مبين في الشكل 3 أ ، كل أربعة FP1-10 شظايا أعيد تشكيلها مع شركائها المقابلة. ومن المثير للاهتمام أن mRuby41-10 و sfCherry211 شكلت إشارة تكميلية كما فعلت mRuby411 و sfCherry21-10. لأن FP1-10/11 شظايا مشفرة بواسطة FPs وثيقة الصلة ، توقعنا أن يكون هناك بعض الحديث المتبادل (الشكل 3 ب). استخدمنا خلايا هيلا التي تشارك في التعبير عن GFP1-10/11-β- أكتين مع Zyxin-mRuby41-10/11، أو mNeonGreen21-10/11-β- أكتين مع mRuby41-10/11-Clathrin للتحقق من الملصقات ثنائية اللون باستخدام mRuby411 في خلايا مفردة. وجدنا أن قناتي التألق المتميزتين لا تتداخلان في الخلايا (الشكل 3 ج ، د).

أ توصيف خصوصيات الربط لـ GFP1-10/11، sfCherry21-10/11، mNeonGreen21-10/11و mRuby41-10/11 عن طريق قياس التدفق الخلوي (انظر أيضًا الشكل التكميلي 15). كل من FP11 تم اختبار شظايا لتكملة كل من FP1-10 فتات. تتم الإشارة إلى التكامل كنسبة مئوية من الخلايا الفلورية بمقياس اللون والرقم في كل كتلة. ب, ج صور مضان ثنائية اللون لخلايا هيلا معبرة عن GFP1-10/11-β-أكتين و Zyxin-mRuby41-10/11 (ب) و mNeonGreen21-10/11-β- أكتين و mRuby41-10/11-الكلاذرين (ج). د يعتمد مخطط dendrogram هذا على أوجه التشابه بين تسلسل البروتين الفلوري التالي: EBFP2 و Capri و Cerulean و CFP و GFP و mNeonGreen2 و mRuby4 و sfCherry2. يتم فصل البروتينات التي تشترك في التسلسل بأطوال فروع أصغر. شريط مقياس ، اختلاف 20٪. تم إنشاء مخطط dendrogram باستخدام برنامج MEGA 7.0. أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر.

إستراتيجية لإنشاء FPs متعامد جديد باستخدام شظايا FP متناوبة دائريًا

من أجل توفير المزيد من المتغيرات من FPs المنقسمة المتعامدة إلى FP الحالي1-10/11، استفدنا من متغيرات GFP المتغيرة دائريًا 25. من خلال ربط N-termini و C-termini وقطع حبلا منفردًا ، يمكن أن يكون أي واحد من أحد عشر خيوطًا علامة GFP مقسمة. لقد اخترنا قياس الإشارة التكميلية للخيوط 7 و 8 و 9 و 10. (تم استبعاد-strands 1-6 لأن الأجزاء التكميلية لهذه الخيوط من غير المحتمل أن تكون قابلة للذوبان في الماء 26). تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بإعداد بنيات الحمض النووي التي ترميز كل من خيوط المدمجة في β-actin وقمنا بقياس الإشارة التكميلية الإجمالية لكل بناء في خلايا HEK 293T عن طريق قياس التدفق الخلوي. لاحظنا إعادة تشكيل إشارة التألق من السلاسل β 7 و 8 و 10 (يشار إليها فيما بعد باسم GFP8-6/7، GFP9-7/8و GFP11-9/10) مع شركائهم المناظرين (الشكل 4 أ). احتفظت أشكال GFP المنقسمة هذه بنسبة 7 إلى 57٪ من سطوع GFP1-10/11، على الرغم من ترك مجال للتحسين. للتحقق من صحة وضع العلامات على البروتين باستخدام خيوط β ، أنشأنا بنيات ترميز بروتينات خلوية مختلفة مدمجة مع GFP8 وشارك في التعبير عن كل واحد منهم مع GFP9-7 في خلايا هيلا. بالنسبة لثلاثة بروتينات تم اختبارها ، لاحظنا مواقعها المتوقعة (الشكل 4 ب-د).

أ شدة الإسفار لخلايا HEK 293T التي تعبر عن الأكتين المسمى بمتغيرات GFP المنقسمة دائريًا ، مقاسة بواسطة قياس التدفق الخلوي (انظر أيضًا الشكل التكميلي 16). ن = 698 خلية لـ GFP8-6/7 ن = 7792 لـ GFP9-7/8 ن = 274 لـ GFP11-9/10 ن = 11017 لـ GFP1-10/11. أشرطة الخطأ هي SEM. بد صور متحد البؤر لخلايا هيلا التي تشارك في التعبير عن GFP9-7 مع GFP8 الاندماج β-actin (ب) ، سلسلة Clathrin الخفيفة (ج) وبيتا توبولين (د). ه خصوصيات ربط GFP8-6/7، GFP9-7/8، GFP11-9/10و GFP1-10/11 تتميز بقياس التدفق الخلوي (انظر أيضًا الشكل التكميلي 17). F صور مضان ثنائية اللون لخلية U2OS تعبر عن اندماجين مختلفين ، GFP11-H2B و GFP8-لامين A / C. ز صور بأربعة ألوان لخلية U2OS تشارك في التعبير عن GFP11-H2B ، GFP8-LaminA / C ، mNeonGreen211-β- أكتين ، و mRuby411-Zyxin مع GFP1-10، GFP9-7، mNeonGreen21-10و mRuby41-10. أشرطة مقياس ، 10 ميكرومتر.

بعد ذلك ، قمنا بتقييم الخصائص الملزمة لـ GFP8-6/7، GFP9-7/8، GFP11-9/10و GFP1-10/11. أجرينا فحص التدفق الخلوي الذي تم إجراؤه في شكل شبكة كما هو موضح سابقًا. إما GFP8-6، GFP9-7، GFP11-9، أو GFP1-10 تم التعبير عنه بالاشتراك مع β-actin مدمجًا مع-strands 7 أو 8 أو 9 أو 11 في خلايا HEK 293T. في هذه التجربة ، يرتبط كل من خيوط فقط بشريكها المقابل (الشكل 4 هـ). على سبيل المثال ، GFP8 يتفاعل مع GFP9-7، ولكن ليس GFP1-10. تم التحقق من صحة هذا التفاعل المتعامد من خلال التصوير ثنائي اللون لخلايا U2OS ، حيث يتم GFP11-H2B و GFP8- تم التعبير عن Lamin A / C مع كابري1-10 و GFP9-7. لاحظنا استبعاد GFP8- لامين A / C من النيوكليوبلازم حيث GFP11-H2B المترجمة في الغالب (الشكل 4f). مجتمعة ، يمكن استخدام شظايا FP التي يتم تبديلها دائريًا لإنشاء أزواج متعامدة إضافية لتقسيم FP متعدد الإرسال.

تكشف الصور متعددة الألوان عن التوطين النووي لـ Zyxin

أخيرًا ، قمنا بتقييم إمكانات أنظمة FP المنقسمة لوضع العلامات المتعددة للبروتينات في الخلايا المفردة. كدليل على المبدأ ، استخدمنا أربعة FPs متعامدة منقسمة قمنا بالتحقيق فيها بدقة في هذا التقرير (Capri1-10/11، GFP9-7/8، mNeonGreen21-10/11و mRuby41-10/11) ، والتي يمكن تمييزها عن بعضها باستخدام منهجية التصوير الطيفي (الشكل 4 ز). تم نقل خلايا U2OS للتعبير عن FPs المنقسمة التي تستهدف أربعة بروتينات متميزة (H2B و Lamin A / C و-actin و Zyxin) ، ولاحظنا توطينها الصحيح. اللافت للنظر ، أن عددًا قليلاً من الخلايا عرض جزءًا من بروتينات Zyxin المترجمة إلى النواة ، على الرغم من أن البروتينات تتركز في الغالب عند التصاقات البؤرية في هذه الخلايا. من خلال الفحص البصري لما مجموعه 145 خلية ، وجدنا أن 37 من هذه الخلايا أظهرت توطين نووي للزيكسين أثناء الطور البيني (الشكل التكميلي 18). نظرًا لأن Zyxin جزيء كبير نسبيًا (& gt80 كيلو دالتون) ولكن ليس لديه إشارة توطين نووي ، يجب أن يدخل Zyxin النواة في اتصال مع المكونات الأخرى. لاحظنا نمط توطين نووي مشابه لـ Zyxin الموسوم بعلامة FP كاملة الطول في خلايا U2OS (50 من أصل 174 خلية) ، ووجدنا أنه تم تأكيد هذه الملاحظة أيضًا في خطوط الخلايا الأخرى 27،28،29.

من أجل العرض التوضيحي الأولي للوسم متعدد الإرسال ، تم التعبير عن FPs المنقسمة بشكل مفرط على أنها اندماج لاستهداف البروتينات في الخلايا المفردة (الشكل 4g). ومع ذلك ، قد تخضع بروتينات الاندماج هذه لقيود بسبب احتمالية وجود آثار مفرطة في التعبير (على سبيل المثال ، عضية شاذة و / أو مورفولوجيا خلوية). لمزيد من التحقق من ملاحظتنا في المستقبل ، سيتم توسيع هذا النهج ليشمل تسمية البروتينات الذاتية من خلال طرق مثل ضرب الجين 12 بوساطة كريسبر / كاس 9. لأن علامة FP المنقسمة هي

42-63 نيوكليوتيدات طويلة (وهي

أصغر بعشر مرات من حجم FP السليم) ، يمكن تصنيع قلة مانحة قصيرة مباشرة ، مما يجعل هذا نهجًا مجانيًا للاستنساخ (انظر أيضًا الشكل التكميلي 11) 2،12. بالإضافة إلى ذلك ، علامة صغيرة مثل GFP11يمكن إدخال العلامة -tag في جينوم الخلية المضيفة بكفاءات إعادة تركيب متجانسة عالية 11. مثل هذا النهج البسيط والفعال من شأنه أن يسهل توليد إدخالات متعددة في خلايا مفردة. وبالتالي ، يمكن بعد ذلك إدراج التسلسلات الخاصة بعلامات FP المنقسمة المتعددة إما بالتسلسل أو في وقت واحد في المواضع المستهدفة في الخلايا الفردية التي تعبر بشكل ثابت عن الأجزاء التكميلية ، مما يتيح التصور متعدد الإرسال للبروتينات الذاتية.


نتائج

نظرة عامة على سير عمل EzColocalization

ينقسم سير العمل الخاص بـ EzColocalization إلى أربع وحدات لكل منها علامة تبويب خاصة بها في واجهة المستخدم الرسومية. علامات التبويب هي: (1) "المدخلات" حيث يتم تحديد ومواءمة قوائم الصور أو الأقنعة أو المناطق محل الاهتمام (2) "مرشحات الخلايا" حيث يمكن تحديد الخلايا بناءً على الميزات المادية وكثافة الإشارة (3) "التصور "حيث يتم إنشاء خرائط الحرارة ، ومخططات التشتت ، والمصفوفات المترية (المحددة أدناه) و (4)" التحليل "حيث يتم اختيار مقاييس التنسيق والمخرجات. لا يلزم استخدام جميع الوحدات وليس كل العمليات داخل الوحدة النمطية. تحتوي بعض علامات التبويب على زر "معاينة" لتشغيل وحدة معينة بدلاً من زر "تحليل" الذي يقوم بتشغيل جميع العمليات المحددة في جميع الوحدات.

المدخلات

يجب أن تكون ملفات الصور التي يتم اختيارها في علامة التبويب "المدخلات" (الشكل 1 أ): (1) أحادية اللون (أي. ليس بتنسيقات RGB أو CMYK) (2) 8 بت أو 16 بت أو 32 بت و (3) بتنسيق مثل TIFF الذي يحتفظ بقيم كثافة البكسل الأصلية. يمكن ضغط الصور الكبيرة لنقل الملفات باستخدام تنسيق غير ضياع مثل ZIP أو LZW ، ثم يتم فك ضغطها لإجراء التحليلات. بالإضافة إلى الصور ، يمكن لـ EzColocalization قبول الأقنعة وقوائم العائد على الاستثمار لتحديد هوية الخلية (انظر أدناه). إذا كانت هناك صور متعددة لكل قناة ، فيجب تكديس الصور لتحليل أكثر كفاءة في قائمة "Stack" (انظر دليل ImageJ لمزيد من التفاصيل 24). قد تكون الصور في المكدس مجالات عرض مختلفة أو سلسلة زمنية ، ولكن يجب أن يكون لها نفس الأبعاد والتكبير وترتيب الصور لكل قناة. توفر علامة تبويب الإدخال أيضًا خيارات لتحديد عتبات كثافة الإشارة ومحاذاة الصور المنحرفة من قنوات مختلفة (الشكل 1 ب والمعلومات التكميلية). يتم توفير توصيات للحصول على صور مناسبة لتحليل التلاحم في المعلومات التكميلية. ملاحظة: تعمل المحاذاة على افتراض أنه يمكن اختيار عتبة مناسبة لشدة الإشارة للتمييز بين وحدات البكسل داخل وخارج الخلايا إذا كانت العتبة تتضمن مناطق خارج الخلية أو منطقة محدودة فقط داخل الخلايا ، فقد لا تعمل المحاذاة بشكل صحيح. لهذا السبب ، يجب فحص جميع المحاذاة بصريًا عن طريق فحص ROIs لتأكيد تحديد مناطق الخلايا المناسبة.

تم تصميم EzColocalization بشكل أساسي لقناة واحدة "لتعريف الخلية" واثنتين أو ثلاث صور لقناة "مراسل". ومع ذلك ، يمكن أن تعمل مع مجموعات المدخلات الأخرى (الجدول S1). تُستخدم قناة تعريف الخلية لتحديد الخلايا الفردية ، وبالتالي التمييز بين وحدات البكسل داخل الخلايا وخارجها. يمكن أن تكون قناة تعريف الخلية أي نوع من الصور التي تسمح بتحديد حدود الخلية بما في ذلك: صور المجهر الضوئي (على سبيل المثال. تباين الطور 25،26 والمجال الساطع) ، صور مع مراسل يقوم بتسمية غشاء الخلية أو الموجود في جميع أنحاء السيتوبلازم (على سبيل المثال. Cy5، Fig. 1B) ، والصور ذات الصبغة خارج الخلية التي تحدد الخطوط العريضة للخلايا. تُنشئ صور تباين التداخل التفاضلي (DIC) ظلالًا تجعل من الصعب التحديد التلقائي للخلايا باستخدام طرق العتبة 27 لذلك بالنسبة لصور مدينة دبي للإنترنت ، نوصي بإنشاء عائد استثمار باستخدام "أدوات التحديد" في ImageJ لتحديد مناطق الخلايا يدويًا ، ثم إضافتها إلى قائمة عن طريق اختيار "إضافة إلى المدير" (في القائمة الفرعية "تحديد" من قائمة "تحرير"). بمجرد تحديد ROIs لجميع الخلايا ذات الأهمية في صورة ما ، يمكن إنشاء قناع ثنائي باستخدام وظيفتي "Clear Outside" و "Autothreshold" في ImageJ.

مرشحات الخلايا

تُستخدم علامة التبويب "عوامل تصفية الخلية" للمساعدة في تحديد الخلايا في الصور (الشكل 2 أ) وتمييز البكسل داخل الخلايا وخارجها. يتم تحديد الخلايا من خلال: (1) اختيار إحدى خوارزميات عتبة ImageJ 24 ، أو تحديد العتبات يدويًا (يتم ذلك عن طريق تحديد "* يدوي *" من القائمة المنسدلة في علامة تبويب المدخلات والضغط على "إظهار العتبة ( s) ") ، لتحديد المناطق المقابلة للخلايا في قناة تعريف الخلية (الشكل 2 ب) (2) باستخدام تجزئة مستجمعات المياه لفصل الكائنات التي تعمل باللمس في صور قناة تعريف الخلية (اختياري) (الشكل 2 ب) (3) اختيار الكائنات من صور قناة تعريف الخلية بناءً على المعلمات المادية (الشكل 2C) وشدة الإشارة (الشكل 2D). سيحاول موقع EzColocalization الكشف تلقائيًا عما إذا كانت صور الإدخال ذات خلفية داكنة أو فاتحة باستخدام الانحراف. بافتراض وجود عدد أكبر من وحدات البكسل في الخلفية مقارنة بالخلايا ، تشير الصورة ذات الانحراف الإيجابي إلى خلفية داكنة ويشير الانحراف السلبي إلى خلفية فاتحة. يمكن للمستخدمين أيضًا تحديد ما إذا كانت صور الإدخال ذات خلفية داكنة أو فاتحة يدويًا في خيارات "المعلمات ..." من قائمة "الإعدادات". تتم إزالة الخلايا الموجودة جزئيًا فقط داخل الصورة ، وبالتالي يمكن أن توفر قيمًا مضللة ، من التحليلات تلقائيًا.

يحتوي EzColocalization على "مرشح مسبق لمستجمعات المياه" وثمانية مرشحات اختيارية لما بعد مستجمعات المياه (مع خيار تحديد المزيد). Watershed segmentation can aid the separation of dividing and touching cells 28 but it can also divide large objects such as aggregates of extracellular material into smaller fragments that are the same size as cells. To avoid the latter, the Pre-watershed filter can be used to exclude objects with large areas from the analysis. The Preview button in the Cell Filters tab allows users to see which objects on the current image will be selected when the minimum and maximum bounds of all the filters are adjusted. There are two classes of parameters for the post-watershed cell filters (Table S2): (i) physical parameters based on measurements from the cell identification channel and (ii) signal intensity parameters from the reporter channels. Physical parameters apply to all channels whereas signal intensity parameters apply only to the reporter channel for which they are selected (because reporters may have very different levels of signal). In addition to filtering based on predefined options in ImageJ, EzColocalization has filters for the “MeanBgndRatio” or “MedianBgndRatio”, which are calculated by dividing the mean or median signal intensity of pixels inside an object by the respective mean or median signal intensity of extracellular pixels.

التصور

The “Visualization” tab displays signals or metrics in cells as: (i) “heat maps” (ii) scatterplots and (iii) “metric matrices” (Fig. 3A).

Heat maps are pseudocolor images that show the relative magnitude of reporter signals (Fig. 3B). They are generated by normalization and rescaling so that the minimum and maximum pixel values are 0 and 255 respectively in each cell, image, or stack. There are eight options for coloring the heat maps, and the intensity values for each color are obtained from the “Show LUT” function (within the “Color” submenu of the “Image” menu in ImageJ). Cell heat maps are suited for determining where each reporter occurs with highest intensity in cells. Image heat maps can show if different cells within a field of view have substantially different intensities, which may indicate biological heterogeneity or unevenness in labeling. Stack heat maps can show if cells in different images have substantially different levels of signal intensity, which may indicate unevenness in labeling or measurements across a slide (على سبيل المثال. due to photobleaching) or changes in signal over time (if the stack is a time series). Note: heat map appearances are affected by brightness and contrast settings.

Scatterplots show the relationship between the signal intensity for two or three reporter channels for individual cells and images (Fig. 3C). This relationship is important in choosing the appropriate colocalization metric (Supplementary Information). Scatterplots can also reveal heterogeneity in the localization patterns 8 , which may require removal of background pixels or separate analyses for different cell types.

Metric matrices provide an overview of localization patterns by showing the calculated values of a colocalization metric for many threshold combinations. Metric matrices for the threshold overlap score (TOS) have been shown to be useful for the analysis of localization patterns for two reporter channels 8,15 (Fig. 3D). For completeness, EzColocalization has the option to calculate metric matrices for two reporter channels using five other metrics: threshold overlap score with logarithmic scaling 8 , Pearson correlation coefficient (PCC), Manders’ colocalization coefficients (M1 and M2), Spearman’s rank correlation coefficient (SRCC), and intensity correlation quotient (ICQ) 8,15 . Colocalization for three channels can also be measured using ICQ, Manders’ colocalization coefficients and TOS 29 (Supplementary Information).

Thresholds for all metrics are measured as the top percentile (Fتي) of pixels for signal intensity 8,15 . For example, Fتي = 0.1 is the 10% of pixels with the highest signal. For the metric matrices, Fتي is also used to specify the step size for the threshold combinations. That is, Fتي = 0.1 also selects thresholds for the 10%, 20%, …, and 100% of pixels with the highest signal. If Fتي does not divide evenly into 100, then the remaining percent is the last step size. For metrics that do not need a threshold (i.e. PCC, SRCC, and ICQ) the values are calculated assuming that only the pixels above the thresholds exist. The metric matrix window has options for the results to be saved as text or image, for changing the Fتي or type of metric, viewing individual cell metric values as a list, and calculating the mean, median or mode of the metric for each threshold combination. The “Proc” (processed) and “Raw” button determines whether the list of data displayed, copied, or saved with the “List”, “Copy”, or “Save…” buttons respectively is the average value for the sample for each threshold combination (على سبيل المثال. median value) or all values for each cell in the sample for all threshold combinations.

التحليلات

The “Analysis” tab has three subtabs (“Analysis Metrics”, “Metrics Info” and “Custom”). The Analysis Metrics subtab has six metrics for measuring colocalization for two reporters (Fig. 4A) and three metrics for three reporters (see previous section). Users may choose a threshold or no threshold for PCC, SRCC and ICQ. TOS and Manders’ colocalization coefficients must have a threshold to be calculated. The Metrics Info subtab contains information and resources about the metrics used in the Analysis Metrics subtab (more details in the Supplementary Information). Thresholds can be selected using Costes’ method 30 or manually. In the Custom subtab (see Supplementary Information for additional information), users can write their own code in Java TM to analyze images (note: the example provided is for calculating PCC) (Fig. 4B). The “Compile” button tests the code and creates a temporary file in the Java temporary directory and displays the outcome of the compiling with a “Succeeded” or “Failed” label. If successful, the compiled custom code is read to the memory again and applied to the selected cells.

The output of every analysis is a table that specifies the image and an identifier number for every cell (Fig. 4C), and for each cell, values are provided for: (i) the selected metric (ii) physical parameters and (iii) average signal intensity for each channel (if selected). Note: “NaN” in the output table indicates the failure to calculate a value. Users can also generate summary windows (with the cell number, mean, median and standard deviation for the selected metric) (Fig. 4D), histograms of metric values (Fig. 4E), binary mask images, and a list of ROIs that represent each cell’s position and number on each image in the ROI manager. ROI lists and binary mask images can be saved for re-analysis of the same cells.

Applications of EzColocalization

EzColocalization is designed to be used in a modular manner to facilitate customization of analyses for a wide variety of experiments and researcher needs. This section focuses on demonstrating specific tools in EzColocalization to solve real-world problems in diverse image sets.

In the first application of EzColocalization, images of rat hippocampal neurons from the Cell Image Library (CIL:8773, 8775–8788, which are attributed to Dieter Brandner and Ginger Withers) are used to demonstrate: (i) the use of a reporter channel for cell identification when an experiment does not have separate non-reporter images for cell identification (ii) cell filters for selecting cells and (iii) visualization tools for choosing metrics. The workflow of the analysis is outlined in Fig. 5A. In the first step, two reporter image stacks were created: one stack with images where F-actin is labelled (using a phalloidin peptide conjugated to rhodamine) and the second stack with images where tubulin is labelled (using an antibody conjugated to Alexa 488) (Fig. 5B). The interaction of F-actin and tubulin is important for the growth and migration of neurons 31,32 . We used the F-actin images for cell identification because it is present in all cells and it shows the cell boundaries 8 . Individual cells were selected from the F-actin images by applying a threshold to identify cells 24 and using a cell filter to remove cell debris (note: parameter values in Fig. 5A).

After the cells were selected, the intensity of reporter signals were examined using cellular heat maps and scatterplots. We found the reporters did not colocalize at high signal levels and there was a complex relationship between the signal intensities (Fig. 5C,D). Due to the latter, localization was quantified using Manders’ M1 and M2 and TOS (Supplementary Information). M1 and M2 were evaluated at thresholds selected by Costes’ method for the cell outlined in Fig. 5B, and the values were 0.289 and 0.995 respectively. These values are usually interpreted as indicating that tubulin has high colocalization with F-actin, and F-actin has low colocalization with tubulin. TOS values were evaluated by generating a metric matrix with median TOS values. The matrix showed colocalization, anticolocalization and noncolocalization at different thresholds for the signal intensities of tubulin and F-actin (Fig. 5E). At sites in cells where F-actin and tubulin have the highest intensity signal (top 10% of pixels for each channel), the median TOS value is −0.36 (ن = 20). This negative value indicates anticolocalization, which is consistent with the impression obtained from the heat maps and scatterplots, and with other reports 8 .

In the second application, images of خميرة الخميرة undergoing mitosis were obtained from the Cell Image Library 33 to demonstrate: (i) cell identification via hand-drawn outlines (for experiments where automated methods of cell identification cannot be applied) and (ii) image alignment. The reporter inputs were an image from a wild type strain (“control” CIL: 13871) that has the BFA1 protein that loads TEM1 onto the spindle pole body, and an image from a strain without the BFA1 protein (∆bfa1 deletion mutant CIL: 13870). In these reporter images, cells expressed TEM1 protein fused to GFP and the DNA was labelled with DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole). TEM1 localizes to spindle pole bodies during mitosis and is implicated in triggering exit from mitosis 33 . The workflow is shown in Fig. 6A. In this application, ROIs were manually drawn around cells using the “Freehand” selection tool in ImageJ on DIC images. Binary masks, which were used to select cell areas, were created by selecting the ROIs and using the “Clear Outside” and then “Auto Threshold” functions of ImageJ 24 (Fig. 6B). The cell areas were used for cell identification and to correct alignment between the DIC images and the reporter channels using the “Default” threshold algorithm (Fig. 6C). Following this cell identification and image alignment, the images are now ready for visualization and analysis as described in the previous example.

In the third application, images of whole adult أنواع معينة انيقة obtained from the Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14) 34 were used to demonstrate that: (i) EzColocalization can analyze colocalization in whole organisms and (ii) “cell” filters can select individual organisms based on reporter signal intensity. The images in this example are from the same dataset used in our study describing TOS (but they are not the same images) 8 . The workflow is shown in Fig. 7A. Outlines of individual C. ايليجانس were drawn in ImageJ on bright-field images to create ROIs, and the ROIs were added to the ROI manager for “cell” identification. GFP expressed from the clec-60 promoter in the anterior intestine was reporter 1 and mCherry expressed from the myo-2 promoter within the pharynx, which is an organ next to the anterior intestine 35 , was reporter 2. Cell filters for physical parameters were unnecessary because only those objects considered to be suitable C. ايليجانس had outlines drawn around them in the first place. However, cell filters for signal intensity were necessary because some C. ايليجانس had low GFP signal, possibly due to transgene silencing 36,37 (Fig. 7B). Subsequent visualization and analysis can be performed as described in the first application.

In the fourth application, we demonstrate the analysis of colocalization for three reporter channels. The workflow was the same as for two reporter channels except “3 reporter channels” was first selected in the “Settings” main menu (Fig. 8A). Images were obtained from the Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Version 1, Image set: 37983, image: p23_s9) of U2OS bone cancer cells (ن = 66) 38 . The three reporter images had DNA, endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria respectively stained with Hoechst 33342, concanavalin A/Alexa Fluor488 conjugate, and MitoTracker Deep Red (upper row, Fig. 8B). Cell identification was performed with an image of the plasma membrane labeled with wheat germ agglutinin (WGA)/Alexa Fluor 555 conjugate (upper left, Fig. 8B). Note: the image also had the Golgi apparatus and F-actin network labeled 38 . The plasma membrane was traced using the polygon selection tool in ImageJ to create ROIs for the individual cells, and the ROI manager containing the ROIs was selected for cell identification.

The localization patterns were visualized in the same manner as for two reporters except that: (i) there are three sets of heat maps for the reporters instead of two (lower row, Fig. 8B) and (ii) scatterplots and metric matrices are in three dimensions (Fig. 8C–F). There is the option in the Visualization tab and the Analysis tab (Fig. 8G) to measure colocalization for the three reporters using ICQ, TOS or Manders’ M1, M2 and M3 metrics. Of the three metrics, we found that TOS was the easiest to interpret. TOS has a single value for measuring the colocalization of all three reporter signals, and it clearly showed the reporter signals for the nucleus, mitochondria and ER overlapped at low thresholds (بمعنى آخر. at high Fتي values there is colocalization red color in Fig. 8E) and did not overlap at high thresholds (بمعنى آخر. at low Fتي values there is anticolocalization blue color in Fig. 8E). These observations are consistent with the nucleus, mitochondria and ER organelles overlapping at their edges (where the signal from their reporters is typically lower) due to known physical interactions, but not at their centers (where the signal from their reporters is typically higher) because they are distinct structures in cells 39,40,41 .


مناقشة

الوظيفة الأساسية لـ slam RNA is encoding Slam protein. In addition to coding information, slam RNA contains 2 more pieces of noncoding information: (1) information for specific subcellular localization of the RNA at the FC, which is at least partially mediated by an interaction with Slam protein, and (2) information for spatial and temporal control of translation, which is high at the FC during the onset of cellularization. By comparing wild-type RNA with a variant RNA, slam[ACU] with the same coding information, the relevance of the noncoding information was uncovered. slam[ACU] RNA is widely distributed in the cell and gives rise to much less Slam protein. Containing coding and noncoding information distinguishes slam RNA from generic mRNAs, which contain only coding information. slam RNA may be related to the growing class of mRNAs with coding and noncoding functions (cncRNA) [26].

Using the injection assay with synthetic RNA transcribed from truncation constructs, we identified several regions of slam RNA that are sufficient for localization to the FC in wild-type embryos. This includes the 5′ untranslated region and at least 2 large regions within the coding sequence, which we have so far not further defined. Each of these regions is able to localize to the FC on its own in wild-type embryos, which indicates redundancy in the mechanism of RNA localization. Interpretation of these data is difficult, however, given that endogenous slam RNA and protein were present in our assay, which may lead to localization by oligomerization or other indirect binding mechanisms.

slam RNA is subject to spatiotemporal control of translation. Although the RNA is present in high levels during the first half of cellularization, translation is restricted to the initial minutes of cellularization. The almost constant protein levels throughout cellularization are due to the stability of Slam protein, as inhibition of new synthesis by cycloheximide leads only to a weak decrease of GFP-slam fluorescence. In contrast to these constant levels during cellularization is the sharp increase in protein levels during the onset of cellularization.

This initial rise in protein levels is partly due to the transcriptional up-regulation of slam. The transcriptional regulation appears not to be sufficient, as we observed a striking difference between slam[wild-type] RNA with slam[ACU] RNA. Although both RNAs contain the same coding information and give rise to similar amounts of Slam protein in cultured cells, slam[wild-type] RNA is more efficiently translated than slam[ACU] RNA in blastoderm embryos. Based on the correlation of impaired RNA localization and reduced translational efficiency, we favor the model that efficient translation is linked to RNA localization or interaction with Slam protein at the FC. However, the embryo-specific lower efficiency of slam[ACU] translation may alternatively be due to secondary RNA structures or disadvantageous codons, which were introduced in our mutagenesis.

A particular feature of slam is that the encoded protein is required for the elaboration of noncoding features. slam RNA requires Slam protein for accumulation at the FC. Not only do we observe a functional interaction of the RNA and protein but also colocalization and biochemical association, indicating molecular interactions. These molecular interactions between RNA and protein may be direct or indirect. They are likely to be indirect, as Slam protein does not contain a canonical RNA binding domain or does not share any detectable sequence homology to RNA binding proteins. Analysis of transcripts associated with Slam protein provided distinct lists depending on the experimental procedure. الأهم ، slam RNA was identified by both approaches, which is consistent with our quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis for a few selected genes. The list of associated transcripts contained transcripts with high and low abundance, indicating that the procedure was sufficiently sensitive to also detect weakly expressed genes. Screening through the gene functions, we did not detect a specific set of genes, such as genes involved in cellularization or cytoskeletal organization.

The biological function of the intimate relationship of slam mRNA and its protein has been unclear. Given the observed specific spatiotemporal profile of slam translation and Slam dynamics, we propose the following model (Fig 8A). Initially, Slam protein accumulates in low levels at the FC independently of its mRNA. Starting with the onset in zygotic transcription, slam mRNA exits the nucleus as part of a complex that is not competent for efficient translation. At least a fraction of slam RNA molecules accumulates at the basal domain forming the FC prior to the first round of translation. At the basal domain, slam mRNA becomes competent for efficient translation, which leads to an increase in Slam protein at the FC. The increased amounts of Slam protein further promote accumulation of slam mRNA, leading to even more Slam protein. Such a mechanism constitutes a positive feedback loop, which provides an explanation for the observed switch-like profile of Slam protein staining at the FC (Fig 8B). Some minutes later, when full Slam levels have been reached, translation is turned off. Slam protein then functions in spatially restricted activation of Rho signaling, actomyosin organization, Patj recruitment, cortical compartmentalization, and furrow invagination (Fig 8) [10, 17, 25]. كما slam is a key regulator of cellularization, the rapid increase of Slam protein may be important for a coordinated and timely onset of its downstream processes.


Where Can I Buy Fluorescent Probes?

Most major chemical suppliers sell specific fluorophores. Organic fluorescent dyes are the most commonly available types but now more unusual types like quantum dots are becoming available. Many suppliers produce protein labeling kits that contain everything needed to complete the process in a short time. Some offer the ability to label up to 10 mg of protein.

Fluorescent probes can be bought from most life science suppliers such as Anaspec, ThermoFisher, and LiCor.

Here are some examples of protein labeling kits found on the market:

AnaTag 5 microscale protein labeling kits. These labeling kits use fluorescein isothiocyanate (FITC) as a fluorophore. The kit is suitable for biological applications and can label 3 x 200 ug of protein.

Alexa Fluor protein labeling kits from ThermoFisher. These kits offer a very straightforward way to covalently label 1 – 10 mg of protein with a fluorescent dye. They offer a range of dyes with a broad range of excitation and emission wavelengths.

LI-COR IR Dye protein labeling kits. These kits are designed for labeling antibodies for use in flow cytometry where fluorophore-conjugated antibodies are required.


The fluorescent protein color palette

Because fluorescence is intrinsically a color-resolved technique, the most important consideration in choosing a FP is its spectral profile, that is, the color of its fluorescence. A broad range of FP variants that span nearly the entire visible spectrum has been developed and optimized (see poster panel ‘Excitation and emission spectral properties of the brightest FPs’). The poster highlights the spectral and imaging properties of a few widely used FPs from across the spectrum. The FPs were purified and their extinction coefficients, quantum yields and spectral properties measured as previously described (Patterson et al., 1997). To compare the brightness of various FPs, each normalized excitation spectrum was multiplied by its peak molar extinction coefficient, and then divided by the peak molar extinction coefficient of EGFP. Similarly, each normalized emission spectrum was multiplied by its molecular brightness (molar extinction coefficient × quantum yield) and then divided by the brightness of EGFP.

The choices for the current best-performing FPs in each color class are based on a number of crucial factors, including maturation efficiency, spectral properties, photostability, monomeric character, brightness, fidelity in fusions and potential efficiency as a Förster resonance energy transfer (FRET) donor or acceptor. There are several key mutations that are repeatedly used in different FPs to enhance function as assayed by these parameters (see ‘Critical mutations’ in the poster). On the basis of overall performance, we consider mTagBFP (Subach et al., 2009) and mTurquoise (Goedhart et al., 2010) the brightest and most photostable blue and cyan FPs, respectively. mEGFP was the first generally reliable FP yet, because of its combination of positive attributes, it remains the gold standard with which to compare the performance of all other FPs. In the yellow and orange spectral regions, mVenus (Nagai et al., 2002) and mKO2 (Sakaue-Sawano et al., 2008) are useful because they mature rapidly and are both bright monomeric variants, even though they lack the level of photostability exhibited by mEGFP. In the orange-red spectral region, mCherry (Shaner et al., 2004) is widely used for many applications, but has been reported to aggregate when expressed within some fusions (Katayama et al., 2008). mApple (Shaner et al., 2008) can be used as an effective substitute for mCherry in most proteins fusions (such as connexins, α-tubulin and focal adhesions). Use of mApple helps to reduce artifacts, but its emission is blue-shifted by

18 nm, which increases its spectral overlap with the yellow and orange FP variants. In the red to far-red region, mKate2 (Shcherbo et al., 2009) is currently the best choice in terms of brightness, photostability and performance in fusion proteins. The important photophysical properties of the selected FPs are summarized in the poster panel ‘Fluorescent protein properties’.

By using multi-color fluorescence microscopy, FPs are often used in combination to examine interactions between their fusion partners (see poster panel ‘Multi-color imaging with fluorescent protein fusions’). In the 2-color image shown here, pig kidney epithelial cells (the LLC-PK1 cell line) express mApple fused to human histone H2B, and mEGFP fused to human α-tubulin. The 3-color image shows HeLa cells that express mVenus fused to the SV40 T-antigen nuclear targeting signal to stain the nucleus, whereas mTurquoise and mCherry are fused to peptides targeted to the Golgi complex and mitochondria, respectively. In the 4-color panel, rabbit kidney (RK-13) cells are shown that express mCherry (fused to pyruvate dehydrogenase), mEGFP (fused to Lifeact), mTurquoise (fused to peroxisomal membrane protein), and mTagBFP (fused to H2B) to visualize the mitochondria, filamentous actin, peroxisomes, and nucleus. Finally, the 5-color assay combines the expression of mTagBFP, mTurquoise, mEGFP, mKO2 and mKate2 to label the nucleus, peroxisomes, endoplasmic reticulum, focal adhesions and mitochondria, respectively.


Choosing compatible fluorescent proteins

To choose a set of fluorescent proteins to be imaged together, you will need to consider the same factors as when choosing an individual fluorescent protein (brightness, photostability, and so on see the previous blog post for more discussion of these factors). In addition, you will also need to choose fluorescent proteins that can be distinguished from one another and that can be imaged with the optics on the microscope(s) you intend to use. An accurate determination of whether two fluorescent proteins can be separated from each other requires knowledge of their excitation and emission spectra, but a good rule of thumb is that both the peak excitation wavelengths and peak emission wavelength of the two proteins should be separated by 50-60 nm. For example, CFP (ex 430 nm / em 474 nm) and YFP (ex 514 nm / em 527 nm) can be imaged together but CFP and GFP (ex 488 nm / em 507 nm) show some crosstalk between the two fluorescent proteins. If you must image fluorescent proteins whose spectra overlap, there are techniques, like spectral unmixing, which can be used to separate the fluorescent proteins, but these are beyond the scope of this post.


The Future of SNAP- and CLIP-Tag protein?

The aforementioned examples from the literature demonstrate the potential of specific chemical labeling of fusion proteins, in particular the SNAP- and CLIP-tags, to address central questions in cell biology and protein science. Innovation in chemistry via the synthesis of new labeling substrates with advantageous properties will open up completely new ways to study protein function: the recently introduced optical switches for increased sensitivity in FRET experiments (18) or the use of environmentally sensitive dyes (19) are good examples. The simplicity of the synthesis of such substrates and the availability of the necessary building blocks from NEB permit even those scientists with little background in chemistry to assemble their own substrates. Whereas advances in the development of new intrinsically fluorescent proteins force their users to go through continuous cycles of subcloning and characterization, users of the SNAP-tag and its relatives can be assured to directly benefit from such future inventions.


شاهد الفيديو: طريقة عمل البروتين او التسريح بمادة الاجاليز في البيت (شهر فبراير 2023).