معلومة

Epitope المشروح البروتين

Epitope المشروح البروتين


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هو البروتين الحلقي المخرم ؟؟
الكتاب الذي حصلت منه على هذا المصطلح هو:
http://www.springer.com/biomed/immunology/book/978-1-4939-1114-1


أولاً ، عندما تسأل عن مصطلح صغير معين ، من الأفضل أن تتحقق من التهجئة. إذا نظرت بالفعل إلى الإحساس ، فستلاحظ أنك استبعدت واصلة مهمة جدًا:

قارن Pellequer العديد من طرق مقياس الميل باستخدام مجموعة بيانات 14 بروتينات حاتمة مشروحة. [تم اضافة التأكيدات]

تعني العبارة أن تسلسل البروتين (تسلسل الأحماض الأمينية) يحتوي على حواتم مميزة عليها. إذا ألقيت نظرة على الورقة المذكورة ، فسترى الجداول المختلفة وتفاصيل الحلقات المحددة. قامت مجموعة Pellequer بالكثير من العمل المبكر عندما كان الناس لا يزالون يعملون على تقنيات "لرسم خريطة" لمواقع الحواتم (التي غالبًا ما لا تكون في أجزاء خطية من تسلسل البروتين بسبب بنية البروتين).


12.2: المستضدات والحلمات

  • بمساهمة غاري كايزر
  • أستاذ (علم الأحياء الدقيقة) في كلية المجتمع في بالتيمور كونتري (كانتونسفيل)
  1. تحديد المستضد والمناعة.
  2. اذكر ما تتكون منه المستضدات كيميائيًا.
  3. قائمة 3 خصائص يجب أن يكون المستضد مناعيًا.
  4. تحديد حاتمة.
  5. صف بإيجاز كيف يتعرف الجسم على المستضد على أنه غريب.
  6. قارن بين مستقبلات الخلايا البائية ومستقبلات الخلايا التائية من حيث كيفية التعرف على الحواتم.
  7. فيما يتعلق بالأمراض المعدية ، قم بإدراج فئتين من المواد الميكروبية التي قد تعمل كمستضد.
  8. ضع قائمة بثلاث مجموعات من المواد غير المعدية التي قد تعمل كمستضد.
  9. عرف ما يلي:
    1. مستضد داخلي
    2. مستضد خارجي
    3. ذاتي
    4. استعجل

    يُعرَّف المستضد بأنه مادة تتفاعل مع جزيئات الجسم المضاد ومستقبلات المستضد في الخلايا الليمفاوية. المستضد هو مستضد يتعرف عليه الجسم على أنه غير ذاتي ويحفز الاستجابة المناعية التكيفية. من أجل التبسيط ، يُشار عادةً إلى كل من المستضدات والمناعة على أنها مستضدات.

    لكي يكون مستضد المناعة ، يجب أن يمتلك ثلاث خصائص:

    • تكون ذات وزن جزيئي مرتفع ،
    • تظهر التعقيد الكيميائي ، و
    • تظهر الغربة (التي يعترف بها الجسد على أنه غير ذاتي).

    كيميائيًا ، المستضدات عبارة عن بروتينات ذات وزن جزيئي كبير (بما في ذلك البروتينات المقترنة مثل البروتينات السكرية والبروتينات الدهنية والبروتينات النووية) والسكريات (بما في ذلك عديدات السكاريد الدهنية). توجد هذه البروتينات ومضادات السكاريد على أسطح الفيروسات والخلايا ، بما في ذلك الخلايا الميكروبية (البكتيريا والفطريات والأوليات) والخلايا البشرية.


    تحديد حاتمين مستضدين على بروتين السارس- CoV

    بروتين سبايك (S) لمتلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة - فيروس كورونا (SARS-CoV) هو بروتين هيكلي رئيسي للفيريون. يلعب دورًا مهمًا في التفاعل مع المستقبلات وتحفيز الأجسام المضادة المعادلة. في الدراسة ، تم توقع ستة حواتم مستضدية مؤقتة (S1 S2 S3 S4 S5 S6) لبروتين السارس لـ SARS-CoV من خلال تحليل المعلوماتية الحيوية ، وجين كيميري متعدد الحلقات من S1-S2-S3-S4-S5- تم تصنيع S6 ودمجها مع جين GST المصب في pGEX-6p-1. أظهر النشاف الغربي أن مصل النقاهة لمريض السارس يمكن أن يتعرف على بروتين الاندماج المؤتلف. تم تطوير عدد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد بروتين الاندماج. علاوة على ذلك ، تم دمج الجينات الحاتمة الستة المتوقعة بشكل فردي مع GST لـ pGEX-6p-1 وتم التعبير عنها في Escherichia coli BL21 ، على التوالي. من بين ستة ببتيدات اندماجية ، تفاعل S5 مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة D3C5 و S2 مع الجسم المضاد أحادي النسيلة D3D1 ضد بروتين سبايك لفيروس السارس. الحلقات التي تم التعرف عليها بواسطة الأجسام المضادة أحادية النسيلة D3C5 و D3D1 خطية ، وتتوافق مع 447-458 و 789-799 من الأحماض الأمينية لبروتين السارس لفيروس كورونا ، على التوالي. يمكن أن يوفر تحديد حاتمة مستضدية لبروتين السارس لفيروس السارس الأساس لتطوير تقنيات وقائية وعلاجية وتشخيصية قائمة على المناعة للسيطرة على متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة.

    الأرقام

    رسم تخطيطي للموقع النسبي ...

    رسم تخطيطي للموقع النسبي لشرائح بروتين سبايك المحددة. يمثل الصندوق ...

    تحليل النشاف الغربي للحلقة المتعددة ...

    تحليل النشاف الغربي للببتيد الانصهار متعدد الحاتمة والحلقة S2 و S5. ضريبة السلع والخدمات ...

    تحليل النشاف الغربي للمادة المؤتلفة ...

    تحليل النشاف الغربي للببتيدات الاندماجية المؤتلفة مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. بكتريا قولونية مع…

    الكشف عن الانصهار المؤتلف الببتيدات ...

    الكشف عن الببتيدات الاندماجية المؤتلفة مع McAbs بواسطة ELISA. كانت الألواح الدقيقة المكونة من ستة وتسعين خلية ...

    الكشف عن S2 أو S5 ومشتقاتهما باستخدام McAbs عن طريق النشاف الغربي. ...


    نتائج

    نموذج كامل الطول S

    للبحث عن الحلقات المحتملة ، قمنا ببناء نموذج هيكلي مفصل من جليكوزيلاتيد كامل الطول S. في حين أن الهياكل عالية الدقة للرأس S متوفرة [6 ، 7] ، لم يتم حل مرساة الساق والغشاء حتى الآن في الذرة مستوى.

    قمنا ببناء نموذج لـ S الكامل من خلال الجمع بين البيانات الهيكلية التجريبية والتنبؤات المعلوماتية الحيوية. يتكون نموذجنا الكامل من قاطع S من النطاق الخارجي الكبير (المخلفات 1-1137) التي تشكل الرأس ، ومجالان ملفوفان (CC) ، يرمزان إلى CC1 (بقايا 1138-1158) وتكرار heptad 2 (HR2 ، بقايا 1167- 1204) ، وتشكيل القصبة ، و α- حلزوني TMD (بقايا 1212-1237) مع حلزونات أمفيباثية مرافقة (AH ، 1243-1255) وسيستين متعدد بالميتويليتيد ، ومجال C قصير الطرف (CTD ، المخلفات 1256-1273) ، انظر S1 (A) الشكل لتعريفات المجال . قمنا بنمذجة نمط الارتباط بالجليكوزيل كما تم الكشف عنه مؤخرًا من أجل S مفرط التعبير [30] (انظر S1 (B) الشكل). على الرغم من المرور عبر Golgi السليم ، فإن glycans المعبر عنها تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في SARS-CoV S الأصلي [31].

    كما هو موضح [23] ، يناسب النموذج بيانات كثافة الإلكترون عالية الدقة لـ cryoET لبروتينات S على سطح الفيروسات المستخرجة من مزرعة الخلايا المصابة بشكل جيد بشكل ملحوظ. كما أنه يلتقط مجال القصبة بمفصلاته المرنة الثلاثة بين رأس S و CC1 و CC1 و HR2 و HR2 و TMD. أكدت الخرائط المقطعية أيضًا الارتباط بالجليكوزيل الواسع للنموذج [23].

    تكشف عمليات محاكاة MD الذرية متعددة الميكروثانية عن ديناميكيات S ودرعها الجليكان

    أجرينا محاكاة MD ذرية طويلة 2.5 ميكرو ثانية لرقعة غشاء فيروسي بأربعة بروتينات S مرنة ، مدمجة على مسافة حوالي 15 نانومتر [32 ، 33] (الشكل 1). أثناء المحاكاة ، ظلت بروتينات S الأربعة مطوية (S2 (G) -S2 (J) Fig) ومثبتة بثبات في الغشاء باستخدام TMDs منفصلة جيدًا.

    تظهر ثلاثة بروتينات في التمثيل السطحي مع تمثيل الجليكان على شكل أعواد خضراء. يظهر بروتين واحد في التمثيل الكرتوني ، مع السلاسل الثلاث الملونة بشكل فردي وحذف الجليكانات من أجل الوضوح. يظهر الماء كسطح أزرق شفاف ويتم حذف الأيونات من أجل الوضوح. لم يتم رسم حافتين لصندوق المحاكاة من أجل رؤية أفضل.

    تميل رؤوس S بشكل ديناميكي وتفاعلت مع جيرانهم (فيلم S1). كشفت الصور عالية الدقة بتقنية cryoET [23] ودراسة MD حديثة [26] بشكل مستقل عن إمالة كبيرة للرأس مرتبطة بانثناء المفاصل في القصبة ، في دعم قوي لملاحظاتنا. نظرًا لكونها عالية الحركة ، فإن الجليكانات تغطي معظم سطح S (الشكل 2A-2C).

    تظهر كثافة إلكترون الجليكان متوسط ​​الوقت على أسطح متساوية على ارتفاع (أ)، واسطة (ب)، و منخفض (ج) مستويات كفاف ، على التوالي. يشير سطح البروتين الأزرق إلى الأبيض إلى إمكانية وصول عالية إلى منخفضة في تحليل الأشعة. (أقحم) لقطات (العصي) من البانتيناري ، ولب fucosylated و sialylated glycan في الموضع 1098 على طول مسار MD.

    تنبأت مواقع ربط الأجسام المضادة من إمكانية الوصول والصلابة وحفظ التسلسل والتوقيع المتسلسل

    إمكانية الوصول إلى النطاق S ectodomain.

    يتطلب ربط الجسم المضاد وصولًا عابرًا على الأقل إلى الحلقات. يمكن لدرع الجليكان الذي يغطي البروتينات السطحية للفيروسات المغلفة أن يعيق الوصول إلى مواقع الارتباط هذه ، مما يساعد SARS-CoV-2 على التهرب من استجابة مناعية قوية [34]. قمنا بتقييم إمكانية الوصول إلى S على الغشاء الفيروسي وتغطية السطح بواسطة glycans بواسطة (1) الأشعة و (2) تحليلات الالتحام (Fab) لجزء ربط المستضد لتكوينات S في عمليات محاكاة MD الخاصة بنا. في تحليل الشعاع ، قمنا بإضاءة نموذج البروتين عن طريق الضوء المنتشر في تحليل الإرساء Fab ، أجرينا محاكاة مونت كارلو للجسم الصلب لتكوينات S مأخوذة من محاكاة MD جنبًا إلى جنب مع الجسم المضاد SARS-CoV-2 CR3022 Fab لتحديد مدى سهولة يمكن لجسم مضاد Fab الوصول إلى سطح S. لمراعاة تنقل البروتين والجليكان ، أجرينا كلا التحليلين بشكل فردي لـ 4 × 250 لقطة مأخوذة على فترات زمنية 10 نانوثانية من محاكاة 2.5 ميكرومتر MD مع أربعة بروتينات S جليكوزيلاتي.

    يغطي درع الجليكان الديناميكي بشكل فعال سطح S (الشكل 3 أ و 3 ب). على الرغم من أن الجليكانات لا تغطي سوى جزء صغير من سطح البروتين في أي لحظة معينة (الشكل 1) ، فإن حركتها العالية تؤدي إلى حماية فلكية قوية لـ S (الشكل 2). توضح مقارنة الشعاع (S3 (A) - S3 (C) Fig) ونتائج الإرساء Fab (S3 (D) -S3 (I) Fig) للجليكوزيلاتي وغير الغليكوزيلاتي هذا التأثير. نحن نعتبر تحليلات الأشعة وتحليلات الإرساء مكملة: يوفر تحليل الشعاع حدًا أعلى لإمكانية الوصول لأن الأشعة الرقيقة يمكن أن تخترق بسهولة أكبر من خلال درع الجليكان مقارنة بالأجسام المضادة ، في حين أن الالتحام بالجسم الصلب يعطي حدًا أدنى لأنه لا يأخذ في الاعتبار أي ملاءمة مستحثة من التفاعلات بين الجليكان والأجسام المضادة. الأهم من ذلك ، أن الطريقتين متسقتان في تحديد المناطق ذات إمكانية الوصول المرتفعة والمنخفضة (الشكل 4 أ و 4 ب). تُظهر تحليلات الشعاع والرسو أن الجليكانات تسبب انخفاضًا في إمكانية الوصول بحوالي 34٪ و 80٪ على التوالي (الجدول B في نص S1). يحدث التأثير الأكثر وضوحًا في الملف الملفوف HR2 بالقرب من الغشاء. بدون الارتباط بالجليكوزيل ، يمكن الوصول إلى HR2 بشكل كامل باستخدام الارتباط بالجليكوزيل ، ويصبح HR2 غير قابل للوصول إلى الإرساء Fab. في حين أن الجزيئات الصغيرة قد تتفاعل مع ساق بروتين HR2 ، يتم منع الأجسام المضادة من الوصول إلى السطح ، بالاتفاق مع عمليات المحاكاة المستقلة الحديثة [26].

    درجات إمكانية الوصول من (أ) تحليل الأشعة و (ب) يتم دمج إرساء الهيكل الصلب Fab مع (ج) درجات الصلابة ، بمتوسط ​​4 × 2.5 ميكرو ثانية من محاكاة بروتين S MD. وشملت أيضا هي (د) درجة حفظ التسلسل [35] ، و (ه) BepiPred-2.0 توقع تسلسل التوقيع والتوقيع. (F) مجموع النقاط الحلقية. (جي) مواقع ربط الأجسام المضادة المعادلة المعروفة. كثافة ألوان أعلى في أ-F يشير إلى درجة أعلى وكثافة ألوان أعلى في جي يشير إلى مواقع مرتبطة بأجسام مضادة متعددة مختلفة.

    اللوحات (A-F) والألوان كما في الشكل 3. تتم تصفية جميع القيم وتوحيدها (انظر الطرق). تُبرز الملصقات من E1 إلى E9 في (F) الحلقات المرشحة. تشير الخطوط الخضراء إلى مواقع الارتباط بالجليكوزيل. تُظهر المستطيلات السوداء مواقع ارتباط الأجسام المضادة المعروفة ، والمشار إليها أيضًا باللون الأسود على طول تسلسل S في المربع السفلي.

    في فيروسات SARS-CoV-2 ، تشكل بروتينات S أحيانًا مجموعات كثيفة ، والتي قد تعزز شغف التفاعلات مع الخلايا البشرية المضيفة [23]. لتقدير تأثير الازدحام ، قمنا بمقارنة إمكانية الوصول إلى حاتمة S من تحليلات الأشعة والالتحام في نظام المحاكاة الكثيف (S3 (C) و S3 (I) الشكل) وبمعزل (S3 (B) و S3 (H) الشكل) ، أي مع إزالة البروتينات الأخرى من نظام MD. بشكل عام ، أدى ازدحام البروتين إلى تقليل إمكانية الوصول إلى S بنسبة 5٪ أخرى في تحليل الأشعة و 6٪ في تحليل الإرساء Fab ، مما أدى إلى تقليل إمكانية الوصول المشترك بواسطة الجليكان والبروتينات المزدحمة بنسبة ∼ 39٪ و 86٪ على التوالي.

    جمود S.

    من المتوقع أن ترتبط الحواتم الهيكلية بقوة وعلى وجه التحديد بالأجسام المضادة. على النقيض من ذلك ، تميل المناطق المتنقلة إلى أن تصبح منظمة في حالة الربط ، مما يستلزم خسارة في الانتروبيا وقد لا تحتفظ بهيكلها عند تقديمها في بنية لقاح. بهدف الحصول على استجابة مناعية قوية ، اخترنا تضمين الصلابة في نقاط الحاتمة الخاصة بنا. هنا ، نركز على حركات المجالات بمقياس حوالي 1 نانومتر. قمنا بتحليل ديناميكيات التوافق واسعة النطاق المرتبطة بالمفصلات المرنة في الساق ومثبت الغشاء في ورقة أخرى [23]. لقد حددنا تقلبات الجذر التربيعي (RMSF) عن طريق تركيب هياكل البروتين وتحويل RMSF إلى درجة صلابة ، كما هو موضح في الطرق.

    يعرض سطح S كلا من المناطق الديناميكية والصلبة (الشكل 4C). ومن المثير للاهتمام ، أن RBD ومحيطه مرنان نسبيًا ، بما يتوافق مع النتائج التجريبية للاختلافات الكبيرة في بنية سلاسل الببتيد الثلاثة في الحالات المفتوحة والمغلقة [7]. على النقيض من ذلك ، فإن سطح البروتين في المجال S2 الذي يغطي آلية الاندماج يكون جامدًا نسبيًا (الشكل 4 ج) ، ربما لحماية هذا المجال المهم وظيفيًا في تشكيل الانصهار المنتشر.

    حفظ التسلسل.

    إن استهداف الحلقات التي يتم حفظ تسلسلها بشكل كبير سيضمن الفعالية عبر السلالات ويمنع الفيروس من الهروب من الضغط المناعي من خلال الطفرات بأقل قدر من عقوبة اللياقة. لقد قدرنا الحفاظ على التسلسل من الاختلافات التي تحدث بشكل طبيعي في كل موضع من مواقع الأحماض الأمينية في التسلسلات التي تم جمعها ورعايتها بواسطة مبادرة GISAID (https://www.gisaid.org/). كشف تحليل 30،426 تسلسل من الأحماض الأمينية أن S بشكل عام محفوظ بدرجة عالية ، مع عدم وجود طفرة مسجلة لـ 52 ٪ من مواقع الأحماض الأمينية. كدرجة حفظ ، قمنا بتعيين الانتروبيا في كل موضع إلى الفترة بين صفر وواحد (انظر الطرق). يتم حفظ المناطق السطحية بشكل جيد في الغالب في تسلسل (الشكل 4 د).

    متنبئ الاستمناع القائم على التسلسل.

    تقدم المناطق المحفوظة والصلبة والتي يسهل الوصول إليها مرشحين جيدين لربط شركاء البروتين بشكل عام. لاستكمال هذه المعلومات ، قمنا بتقييم الإمكانات المناعية بناءً على تواقيع التسلسل التي تستهدفها الأجسام المضادة. الأشكال الشبيهة بالحلمة في تسلسل S المحدد باستخدام خادم BepiPred 2.0 [36] مبعثرة عبر المجال الخارجي S وتتضمن حواتم معروفة (الشكلان 3E و 4E) ، ولكنها تحتوي أيضًا على مناطق مدفونة يتعذر الوصول إليها للأجسام المضادة.

    مجموع حاتمة النتيجة.

    لقد قمنا بدمج درجات إمكانية الوصول والصلابة والحفظ والاستمناع الخاصة بنا في درجة حاتمة إجماع واحدة (الشكلان 3 و 4 و). من خلال الحصول على منتج جميع الدرجات الفردية ، تأكدنا من حصول مرشحي الحلقات على درجات عالية في جميع الميزات. يلغي هذا المطلب الصارم العديد من المواقع المرشحة ، ويرجع ذلك في الغالب إلى أن درجات إمكانية الوصول (الشكل 4 أ و 4 ب) ودرجة الصلابة (الشكل 4 ج) تظهر اتجاهات معاكسة ، بما يتماشى مع التكرار الواسع للحلقات المرنة على السطح S.

    باستخدام درجة الإجماع لدينا ، حددنا تسعة حاتمات مرشحة (E1 – E9 الشكل 5 والجدول 1). يستعيد المرشحون الحاتمات E3 – E6 الحلقات المعروفة (الأشكال 3F و 3 G و 4 F) ، وفي بعض الحالات تحقق دقة مستوى البقايا (S4 الشكل) بالإضافة إلى ذلك ، نحدد الحاتمات المرشحة E1 و E2 و E7 –E9. جميع المرشحين الحاتمة يقيمون في الرأس المهيكل S. وعلى النقيض من ذلك ، فإن إمكانية الوصول المنخفضة والمرونة العالية في المفصلات [23] تعطي الساق درجات حاتمة عامة منخفضة.

    (أ) منظر علوي لـ S ممثل كما في الشكل 3F. يتم تصنيف المرشحين الحاتمة وفقًا للجدول 1. (ب) منظر جانبي مع تلوين وتسميات كما في A. (ج) تكبير / تصغير على المرشحين الحلقات (E1 ، E2 ، E7 ، E9) في تمثيل كرتوني وملون كما في A. تظهر المخلفات مع درجة إجماع حلقية و gt0.2 في تمثيل عرق السوس الأصفر.

    في المحاكاة التي أجريناها ، تم أخذ عينات من نطاقات RBD في التشكل المغلق وواحد في التشكل المفتوح. لتقييم تأثير الحالات المفتوحة والمغلقة ، قمنا بحساب درجات إمكانية الوصول والإجماع لجميع سلاسل البروتين الثمانية ذات التشكل RBD المغلق (S10 الشكل). توضح المقارنة مع الشكل 4 أن الاختلافات الكبيرة الوحيدة في إمكانية الوصول تحدث في منطقة RBD.

    يتسبب ازدحام S في انخفاض كبير في درجة مرشحي الحاتمة E1 و E2 ، في حين أن تأثيره ضئيل فقط على المرشحين E3-E4 و E7-E8 ، وليس له أي تأثير على المرشحين E5-E6 و E9 (S5 الشكل).

    السلوك الجماعي لـ S.

    على الرغم من التوزيع العشوائي الملحوظ لـ S على سطح الفيروسات ، فإن البقع المكتظة بالسكان ليست غير شائعة (انظر الشكل 5G في [23]). من المحتمل أن يتلامس متعدد S إذا كان مرتبطًا في وقت واحد بثنائي ACE2 واحد أو عند ربطه بأجسام مضادة. الاستفادة من إعداد المحاكاة لدينا ، قمنا بتحليل التفاعلات بين S. خلال 2.5 ميكرو ثانية ، لاحظنا عددًا من جهات الاتصال التي تتضمن كل من الجليكانات وأسطح البروتين ، مما أدى إلى تشويش جزئي لثلاثة من S في ترتيب مثلث مميز لنطاقات رأس S ومع يتفاعل S الرابع بشكل ضعيف مع اثنين من جيرانه (S9 (A) Fig). في حالة التشويش ، شكلت الجليكانات شبكة واسعة من التفاعلات ، كما يمكن رؤيته في الشكل S9 (B). ولتحديد الأدوار النسبية لبقايا وشقوق جليكان معينة ، قمنا بحساب خريطة اتصال للتفاعلات بين S (S9 (C) و S9 (د) الشكل). وجدنا أن غالبية جهات الاتصال التي يتوسط فيها البروتين موجودة في الحلقات غير المنظمة داخل مناطق NTD. تتركز جهات الاتصال بوساطة الجليكان في التسلسلات الموجودة في مناطق NTD و RBD وفي الجزء السفلي من الرأس S. على الرغم من حجمها ، لم تكن الجليكانات الموجودة على الساق متورطة في الاتصالات بين S. بدلاً من ذلك ، ظلوا محميين نسبيًا بمجالات الرأس الأكثر اتساعًا.


    3. النتائج والمناقشة

    3.1. اختيار وتقييم البروتين

    لقد ثبت أن الجمع بين قائمة طويلة من المستضدات يمكن أن يزيد من فعالية اللقاحات (روسي وآخرون ، 2004). Malfertheiner et al. (2008) قام بتقييم لقاح متعدد المكونات لدى متطوعين بشريين لاحظوا أن اللقاح آمن وعالي المناعة ، مما يؤدي إلى استجابات خلطية وخلوية طويلة الأمد لمولدات المضادات. لذلك ، تم اختيار 11 بروتينًا للقاح لدينا. تم الإبلاغ عن UreB في العديد من الدراسات الخاصة باستضداد VacA و CagA و GGT و NapA و OipA وهي البروتينات الرئيسية المشاركة في الآليات المسببة للأمراض. تم اختيار HpaA و FlaA و FecA و BabA و SabA لمشاركتهم في آليات الالتصاق والاستعمار.

    تم فحص البروتينات المختارة بشكل أكبر في الخطوة التالية للحصول على مزيد من المعلمات ، بما في ذلك التوطين الخلوي ، والأهمية ، والفوعة ، والتماثل غير البشري ، واللولب اللولبي ، والوزن الجزيئي. أظهرت تنبؤاتنا أن UreB و NapA يمتلكان موقعًا سيتوبلازميًا CagA و FlaA و VacA و BabA خارج الخلية ، في حين تم توقع OipA و SabA و HpaA و FecA كبروتينات غشاء خارجي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف GGT كبروتين محيطي ، كما هو موضح في الجدول 1. تعد البروتينات السطحية وخارج الخلية أهدافًا جيدة لتطوير لقاح يهدف إلى الوقاية من الالتهابات والأمراض البكتيرية (Dwivedi et al. ، 2016).

    الجدول 1.التوطين دون الخلوي ، وأساسيات الجينات ، والفوعة ، والتماثل البشري ، واللولب عبر الغشاء ، والنقطة الكهروضوئية ، والتنبؤات بالوزن الجزيئي هيليكوباكتر بيلوري بروتينات مختارة

    aa ، الأحماض الأمينية C ، السيتوبلازم E ، ES الأساسي ، N-ES خارج الخلية ، N-H غير الأساسي ، N-V غير الهيكلي ، OM nonvirulent OM ، الغشاء الخارجي P ، periplasmic TM ، الغشاء V ، الخبيث.

    في تحليل الجينات الأساسية بواسطة OGEE ، تم تحديد جينات HP1118 (GGT) و HP0807 (FecA). الجينات الأساسية هي تلك الجينات من الكائن الحي التي تعتبر حاسمة لبقائه ، الجينات الأساسية لها أهمية خاصة بسبب تطبيقاتها النظرية والعملية مثل دراسة قوة النظام البيولوجي ، وتحديد الحد الأدنى من الجينوم / الكائن الحي وتحديد الأهداف العلاجية الفعالة في مسببات الأمراض (تشين وآخرون ، 2017). علاوة على ذلك ، تم العثور على 9 من 11 بروتينًا في قاعدة بيانات عوامل الضراوة لـ PATRIC FecA و GGT لم يتم تحديدها في هذه الفئة. كشف تحليل التنادد لـ 11 بروتينًا ذات أولوية باستخدام BLASTp عن هوية 30 ٪ ، وهو ما كان مهمًا لإعلان التسلسلات على أنها متجانسات غير بشرية يجب ألا تكون أهداف اللقاح متجانسة بشرية لتجنب المناعة الذاتية. أظهر التنبؤ بطوبولوجيا البروتينات بواسطة TMHMM أن VacA و GGT كان لهما حلزون TM واحد ، في حين أن البروتينات الأخرى لا تكشف عن وجود أي طوبولوجيا من هذا القبيل. أظهر VacA و GGT وجود حلزون TM يقع في 35-57 وفي 5-27 موقعًا من الأحماض الأمينية ، على التوالي. أخيرًا ، أدت الأوزان الجزيئية المحسوبة بواسطة أداة Compute pI / Mw لتسعة بروتينات إلى وزن أقل من 110 كيلو دالتون ، في حين أن VacA و CagA لها أوزان جزيئية تبلغ 139.3 و 132.4 كيلو دالتون ، على التوالي (الجدول 1).

    يُعتبر المرشحون الجيدون للقاح على أنهم أولئك الذين لا يقدمون التماثل مع البروتينات البشرية لتجنب توليد استجابة مناعية ذاتية محتملة ، يجب أن يفتقر هؤلاء المرشحون أيضًا إلى مناطق TM ، لتسهيل التعبير. من الخصائص الأخرى التي يجب أن يتمتع بها المرشح الجيد للقاح هو امتلاك خصائص مستضدية جيدة ، والتي تعد مهمة لإحداث الكائن الدقيق وللحماية من المرض (Monterrubio-López et al.، 2015). استخدم بعض المؤلفين هذه الأساليب في اختيار البروتينات المرشحة لتصميم السيليكو جرثومة المعدة لقاحات (Naz et al.، 2015 Nezafat et al.، 2017).

    3.2 مستضد توافق

    لتطوير عالمي جرثومة المعدة لقاح ، تم إجراء تحليل الحفاظ على المستضدات المختارة. تمت مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية لكل بروتين ومواءمته مع 85 تسلسلًا يتوافق مع جينومات مشروحة بالكامل لـ جرثومة المعدة من مناطق جغرافية مختلفة وقت الدراسة. لوحظ وجود تباين كبير في البروتينات CagA و VacA و FecA و BabA و SabA ، كما هو موضح في الشكل 1. وبالتالي ، لتقليل التباين بين جرثومة المعدة سلالات ، تم الحصول على تسلسل الإجماع. تم استخدام هذا النهج ضد العوامل المعدية ذات معدل التباين العالي مثل فيروس نقص المناعة البشرية (Thomson et al. ، 2005 Grimm and Ackerman ، 2013). في المقابل ، كانت البروتينات ذات أعلى نسبة (≥95٪) من الحفظ هي UreB و NapA و GGT و FlaA و HpaA و OipA (الشكل 2).

    تين. 1. تحليل حفظ البروتينات المختارة. تسلسلات بروتينية كاملة بين 85 جينومًا مشروحًا لـ هيليكوباكتر بيلوري تمت مواءمتها باستخدام منضدة عمل CLC الرئيسية ، وتم تمثيل درجات الحفظ في مخطط خطي ثنائي الأبعاد. (أ) CagA ، (ب) سابا ، (ج) بابا ، (د) VacA و (هـ) برازي. 2D ، ثنائي الأبعاد.

    تين. 2. تحليل حفظ البروتينات المختارة. تسلسلات بروتينية كاملة بين 85 جينومًا مشروحًا لـ هيليكوباكتر بيلوري تمت مواءمتها باستخدام منضدة عمل CLC الرئيسية ، وتم تمثيل درجات الحفظ في مخطط خطي ثنائي الأبعاد. (أ) UreB ، (ب) GGT ، (ج) نابا ، (د) FlaA ، (هـ) OipA و (F) HpaA.

    3.3 حواتم الخلايا التائية والبائية

    سمح تحليل التنبؤ بواسطة خوادم المعلومات الحيوية المختلفة للخلايا T و B (باستخدام أليلات MHC-I / -II للإنسان والفأر BALB / c) باختيار 11 حلقة بناءً على درجاتهم وعدد الأليلات والاتفاق بين الخوادم المستخدمة . الحواتم التي تم الحصول عليها كانت نابا30–49، CagA1103–1122، فلوريدا487–506، OipA211–230، GGT106–126، HpaA33–52، بابا129–149، برازي437–456، سابا540–559، فاكا459–478و UreB170–189 (الجدول 2). HpaA33–52 تم الإبلاغ عن epitope مسبقًا بواسطة Hu et al. (2016) قاموا بتقييم استجابة الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + T الخاصة بالمستضد المحفزة باستخدام HpaA المؤتلف من 101 جرثومة المعدةالأشخاص المصابون بالعدوى ، لوحظت زيادة كبيرة في الخلايا المنتجة للإنترفيرون. بالإضافة إلى ذلك ، تسعة مخلفات من UreB170–189 الحلقة المتوقعة في هذه الدراسة تتطابق مع UreB181–195 حاتمة ذكرت من قبل Qiu et al. لاحظوا التفاعل الإيجابي مع الأمصال من جرثومة المعدة- المرضى المصابون بالعدوى بواسطة فئران المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم المحصنة بالجلوتاثيون S-ترانسفيراز- UreB181–195 أظهر الببتيد الانصهار أن الأجسام المضادة الخاصة بالحاتمة قادرة على تثبيط النشاط الأنزيمي لليورياز. في دراسة أخرى ، Guo et al. (2017) قام بتصميم وتقييم لقاح متعدد التكافؤ قائم على الحاتمة (يُسمى CWAE) يتضمن UreB181–195 حاتمة. أدى التحصين العلاجي عن طريق الفم مع CWAE إلى تقليل عدد جرثومة المعدة المستعمرات في معدة الجربوع المنغولية. ارتبطت حماية CWAE بمستويات أعلى من استجابة خلايا CD4 + T المختلطة ، والغلوبولين المناعي G ، والغلوبولين المناعي الإفرازي A (Guo et al. ، 2017).


    Epitope المشروح بروتين - علم الأحياء

    روابط صفحة موارد الجسم المضاد (ARP).
    Bio-Rad Antibody (ABD Serotec سابقًا) الموارد - المراجعات المصغرة المتعلقة بالأجسام المضادة والملخصات التعليمية وملاحظات التطبيق والمدونة.
    IHCWorld.

    موارد محدد موقع الجسم المضاد

    AbMiner - البحث عن الأجسام المضادة مع التركيز على التحقق من صحة الأجسام المضادة (مجموعة علم الجينوم والمعلوماتية الحيوية ، LMP ، CCR ، المعهد الوطني للسرطان).
    Antibodypedia - قاعدة بيانات مفتوحة الوصول للأجسام المضادة المتاحة تجاريًا ضد أهداف البروتين البشري (جزء من مبادرة الأجسام المضادة البشرية لـ HUPO (HAI) بالتعاون مع Nature Publishing Group.
    مستكشف الأجسام المضادة - منشأة Sigma-Aldrich للبحث في مجموعة الأجسام المضادة الكبيرة الخاصة بهم.
    سجل الأجسام المضادة - سجل للأجسام المضادة المحددة بشكل فريد بما في ذلك الأجسام المضادة التجارية من حوالي 200 بائع.
    صفحة موارد الجسم المضاد (ARP).
    Bioz - مجمع علمي يوفر وسيلة بحث شاملة عن الأجسام المضادة وترتيبها من صفحته الرئيسية ، وقائمة قابلة للبحث من الأجسام المضادة والفئات ذات الصلة هنا.
    خدمة موقع الجسم المضاد Biocompare.
    أطلس البروتين البشري - بروتينات الجسم المضاد للاستكشاف المنهجي للبروتين البشري.
    IHCWorld.
    دليل Linscott للكواشف المناعية والبيولوجية.

    قواعد بيانات Epitope والأدوات ذات الصلة

    AntiJen - قاعدة بيانات حركية وديناميكية حرارية وخلوية v2.0 (حواتم الخلية T و B)
    Bcipep - قاعدة بيانات من حلقات الخلية B (مركز المعلوماتية الحيوية ، معهد التكنولوجيا الميكروبية ، الهند).
    مرفق تنبؤات ربط الببتيد HLA عبر الإنترنت من قسم المعلومات الحيوية والتحليل الجزيئي (BIMAS) ، المعاهد الوطنية للصحة.
    IEDB - قاعدة بيانات Epitope المناعي ومصدر التحليل (حواتم الخلايا T و B NIAID / NIH).
    IMGT - نظام معلومات ImMunoGeneTics متخصص في جزيئات MHC و Ig و TcR من جميع أنواع الفقاريات.
    MHCBN v4.0 - قاعدة بيانات منظمة لربط MHC / TAP والببتيدات غير الملزمة وحلقات الخلايا التائية (مركز المعلوماتية الحيوية ، معهد التكنولوجيا الميكروبية ، الهند).
    MHCPred - التنبؤ بربط الببتيد- MHC من الدرجة الأولى باستخدام الشبكات العصبية الاصطناعية (مركز تحليل التسلسل البيولوجي (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).
    NetMHC 4.0 - يتنبأ الخادم بربط الببتيدات بأكثر من 500 أليلات HLA-DR باستخدام الشبكات العصبية الاصطناعية (مركز تحليل التسلسل البيولوجي (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).
    NetMHCIIpan 2.0 - يتنبأ الخادم بربط الببتيدات بأكثر من 500 أليلات HLA-DR باستخدام الشبكات العصبية الاصطناعية (مركز تحليل التسلسل البيولوجي (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).
    ProPred - خادم التنبؤ الحاتمي من الفئة الثانية MHC (مركز المعلوماتية الحيوية ، معهد التكنولوجيا الميكروبية ، شانديغار ، الهند).
    ProPred I - مرفق عبر الإنترنت مع MHC من الدرجة الأولى للتنبؤ بالببتيد الملزم (مركز المعلوماتية الحيوية ، معهد التكنولوجيا الميكروبية ، الهند).
    SDAP - قاعدة البيانات الهيكلية للبروتينات المسببة للحساسية (قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، فرع جامعة تكساس الطبي).
    SYFPEITHI - قاعدة بيانات لروابط MHC وزخارف الببتيد (المعلوماتية الطبية الحيوية (BMI) ، هايدلبرغ / قسم المناعة ، جامعة توبنغن).

    تنبؤ بنية البروتين ثلاثية الأبعاد

    3D-JIGSAW - يبني الخادم نماذج بروتينية ثلاثية الأبعاد تستند إلى متماثلات من معمل نمذجة الجزيئات الجزيئية المعروفة لهيكل معروف ، وأبحاث السرطان في المملكة المتحدة ، لندن.
    التنبؤ بالبنية ثلاثية الأبعاد - مورد روابط شامل في VLS3D.com (فحص افتراضي للروابط الترابطية).
    مركز النمذجة الجزيئية (CMM) (المعاهد الوطنية للصحة).
    CPHmodels - خادم نمذجة تجانس البروتين (مركز تحليل التسلسل البيولوجي ، (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).
    ESyPred3D - خادم نمذجة Homology الذي يستخدم MODELLER (انظر أدناه) لبناء بنية نهائية ثلاثية الأبعاد للبروتين (جامعة نامور ، بلجيكا).
    EVA - المراقبة التلقائية المستمرة لخوادم التنبؤ ببنية البروتين في "الوقت الفعلي".
    Interactome3D - مورد نمذجة التماثل الفريد لرسم خرائط المعلومات الهيكلية على أي مجموعة بيانات تفاعل البروتين البروتين ديناميكيًا في الوقت الفعلي (معهد الأبحاث في الطب الحيوي ، برشلونة).
    MMDB (قاعدة بيانات النمذجة الجزيئية) - قاعدة بيانات هيكلية ثلاثية الأبعاد للنمذجة الجزيئية (NCBI).
    MODELLER - نمذجة البروتين من خلال تلبية القيود المكانية (Network Science - NetSci).
    Phyre2 - Phyre2 (Protein Homology / analogY Recognition Engine) خادم نمذجة التماثل عن بعد (مجموعة المعلومات الحيوية الهيكلية ، إمبريال كوليدج ، لندن).
    بوابة نموذج البروتين (PMP) - بوابة إلى مختلف الخدمات التفاعلية لبناء النماذج وتقييم الجودة (مجموعة البيولوجيا الهيكلية الحسابية ، SIB).
    مركز التنبؤ ببنية البروتين (جامعة كاليفورنيا ، ديفيس).
    ROBETTA - خادم التنبؤ ببنية البروتين كامل السلسلة من مزودي برنامج Rosetta (Baker Lab ، جامعة واشنطن).
    SWISS-MODEL - خادم نمذجة لبنية بروتين ExPASy مؤتمت بالكامل (موقع جيد للمبتدئين). يمكن الوصول إلى هذا الخادم أيضًا من البرنامج القابل للتنزيل DeepView (Swiss-PDBViewer).
    TINKER - أدوات برمجية للتصميم الجزيئي.

    قاعدة بيانات Allosteric (ASD) - قاعدة بيانات لبروتينات ومعدلات خيفي (مختبر التصميم الجزيئي ، جامعة شنغهاي جايوتونغ ، الصين).
    أطلس التفاعلات الجانبية للبروتين - البروتين - البروتين - البروتين - الحمض النووي - مجموعة التركيب والنمذجة الجزيئية الحيوية ، كلية لندن الجامعية).
    مشروع الجين الأزرق - الحوسبة الفائقة المطبقة على بنية البروتين (IBM)
    CLICK - مقارنة مستقلة في الطوبولوجيا للهياكل الجزيئية الحيوية ثلاثية الأبعاد (معهد المعلوماتية الحيوية A * STAR ، سنغافورة).
    خادم دالي - مرفق عبر الإنترنت لمقارنة هياكل البروتين ثلاثية الأبعاد (معهد التكنولوجيا الحيوية ، جامعة هلسنكي).
    قاعدة بيانات الحركات الجزيئية الكبيرة - مع الأدوات المرتبطة بالمرونة والتحليل الهندسي (Gerstein Lab ، جامعة Yale).
    العائلات الهيكلية للبروتين المرتبط بالحمض النووي - المعلومات المرتبطة بالارتباط التشعبي المجمعة بواسطة فكرة التعرف على الحمض النووي (مجموعة التركيب والنمذجة الجزيئية الحيوية ، كلية لندن الجامعية).
    EDS - خادم كثافة الإلكترون (جامعة أوبسالا ، السويد).
    ELM - مورد الحافز الخطي حقيقيات النوى للتنبؤ بالموقع الوظيفي للبروتين من تسلسل الإدخال (اتحاد ELM).
    قاعدة بيانات الهياكل الإنزيمية - EC قاعدة بيانات PDB لهياكل الإنزيم المعروفة المودعة في بنك بيانات البروتين (PDB).
    خلاصة - قاعدة بيانات حاتمات مستضدية مستنتجة هيكليًا في البروتينات.
    iELM - تتنبأ تفاعلات مورد الحافز الخطي حقيقية النواة بزخارف خطية قصيرة (SLiMs) مرتبطة بواجهات تفاعل البروتين البروتين (EMBL).
    Interactome3D - خدمة ويب للتعليق التوضيحي الهيكلي لشبكات تفاعل البروتين البروتين (معهد الأبحاث في الطب الحيوي ، برشلونة).
    مكتبة JenaLib Jena للجزيئات البيولوجية الكبيرة. مورد لتصور وتحليل أطلس البروتين (معهد البيولوجيا الجزيئية (IMB) ، يينا ، ألمانيا).
    MMDB (قاعدة بيانات النمذجة الجزيئية) - قاعدة بيانات هيكلية ثلاثية الأبعاد للنمذجة الجزيئية (NCBI).
    ModBase - قاعدة بيانات نماذج بنية البروتين المقارنة (Sali Lab ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو).
    قائمة الأجزاء - مورد لتحليل طيات البروتين (Gerstein Lab ، جامعة ييل).
    PDBsum - مورد إنترنت رئيسي للمعلومات الهيكلية للبروتين (EMBL-EBI).
    PDBWiki - قاعدة معرفية مشروحة للمجتمع من الهياكل الجزيئية البيولوجية.
    PISA (PDBePISA) - أداة واجهات البروتين والأسطح والتجميعات والتنبؤ بالبنى الرباعية المحتملة (EMBL-EBI).
    المطبوعات - خلاصة وافية لبصمات البروتين ، مجموعة من الزخارف المحفوظة المستخدمة لوصف عائلة البروتين.
    Motif Scan - ملف تعريف ProSite وزخارف نمطية ، وعائلات بروتين Pfam (SIB - ISREC).
    قاعدة بيانات PROSITE لمجالات البروتين والعائلات والمواقع الوظيفية (ExPASy - SIB).
    بنك بيانات البروتين (PDB) - من التعاون البحثي للمعلوماتية الحيوية الهيكلية (RCSB).
    بنك بيانات البروتين في أوروبا (PDBe) - مورد أوروبي لجمع وتنظيم ونشر البيانات حول الهياكل البيولوجية الجزيئية (EMBL-EBI).
    بنك بيانات البروتين الياباني (PDBj) - قاعدة بيانات الهياكل الجزيئية والأدوات المتكاملة (المركز الوطني لقاعدة بيانات العلوم البيولوجية وجامعة أوساكا).
    بوابة نموذج البروتين (PMP سابقًا PSI Protein Structure Knowledgebase) - بوابة لنماذج بروتين معين محسوبة بواسطة طرق النمذجة المقارنة المختلفة (Computational Structural Biology Group، SIB).
    مؤامرة راماشاندران - خادم يعرض زوايا التواء السلسلة الرئيسية من بروتين إدخال لهيكل معروف (مركز أبحاث وتعليم الكمبيوتر العملاق ، بنغالور).
    SALIGN - خادم محاذاة تسلسل / بنية متعدد البروتين يعتمد على استخدام MODELLER (انظر القسم السابق) (Sali Lab ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو).
    مستودع SWISS-MODEL - قاعدة بيانات لنماذج بنية البروتين المقارنة المشروحة ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة خط أنابيب نمذجة ExPASy SWISS-MODEL (انظر القسم السابق).
    ثيسيوس - التراكب المتزامن للعديد من الهياكل الجزيئية باستخدام طريقة جديدة لتراكب الاحتمالية القصوى التي لا تتجاهل فجوات المحاذاة (جامعة برانديز ، ماساتشوستس).

    عائلات ومجالات البروتين

    قاعدة بيانات تصنيف بنية البروتين من CATH - قاعدة بيانات قابلة للبحث من هياكل البروتين في PDB مصنفة حسب بنية المجال والأسرة الفائقة (مجموعة Orengo ، الكلية الجامعية ، لندن).
    مرفق التمديد التجميعي (CE) لمقارنة ومحاذاة هياكل البروتين (RCSB PDB).
    قاعدة بيانات المجال المحفوظة (CDD) ومرفق البحث عن البروتين (NCBI).
    محاذاة بنية بروتين دالي إما مع بنية بروتينية أخرى (مقارنة زوجية) أو لجميع الإدخالات في PDB (جامعة هلسنكي ، فنلندا). تتوفر أيضًا محاذاة هيكل Dali الزوجي هنا في EMBL-EBI.
    DBAli قاعدة بيانات لمحاذاة بنية البروتين (Sali Lab ، جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو).
    قط سمين - Fهيكل معجم أlignmenتي بواسطة جهاينينغ أأزواج شظية مبطنة تسمح تيويست (معهد سانفورد-بورنهام للبحوث الطبية ، الولايات المتحدة).
    تجمع InterPro البيانات من PROSITE و PRINTS و PFAM و PRODOM و SMART وقواعد البيانات الأخرى لتصنيف البروتينات إلى عائلات والتنبؤ بالمجالات والمواقع الوظيفية (EMBL-EBI).
    PASS2 - تنظيم محاذاة البروتين على هيئة عائلات هيكلية فائقة (المركز الوطني للعلوم البيولوجية (NCBS) ، بنغالور ، الهند).
    PDBeFold خدمة مطابقة البنية الثانوية (SSM) للمقارنة التفاعلية ، والمحاذاة والتراكب لهياكل البروتين في 3-D (EMBL-EBI).
    PeCoP - خادم يبحث عن بيبإصرار شاركنخدم صالتناضح في تسلسل أفراد عائلة البروتين القريب والبعيد.
    Pfam - قاعدة بيانات عائلات البروتين الخاصة بالمحاذاة ونماذج ماركوف المخفية (EMBL-EBI).
    POSA (محاذاة هيكل الطلب الجزئي). محاذاة هيكل مرنة متعددة باستخدام الرسوم البيانية الجزئية.
    ProDom - قاعدة بيانات عائلات مجال البروتين التي يتم إنشاؤها تلقائيًا من قاعدة بيانات معرفة UniProt.
    SCOP (التصنيف الهيكلي للبروتينات) - قاعدة بيانات مجال البروتين توفر مسحًا واسعًا لجميع طيات البروتين المعروفة ، ومعلومات مفصلة حول الأقارب المقربين لأي بروتين معين (مختبر MRC للبيولوجيا الجزيئية ، كامبريدج ، المملكة المتحدة).
    SMART (أداة بحث معمارية جزيئية بسيطة) - قاعدة بيانات مجال البروتين ومنشأة تحليل التسلسل (EMBL).
    TOPSCAN طريقة سريعة لمقارنة هياكل البروتين بناءً على هياكلها الثانوية (كلية لندن الجامعية ، المملكة المتحدة).
    واسع الخامسector أlignment سالبحث تيool للكشف عن تراكيب البروتين ثلاثية الأبعاد المتشابهة ، والمتجانسات البعيدة التي تفلت من الكشف عن طريق مقارنة التسلسل (NCBI).

    إشارة البروتين / توقع تسلسل الفرز

    PSORT - التنبؤ بإشارات فرز البروتين ومواقع التوطين في تسلسل الأحماض الأمينية.
    SignalP - التنبؤ بمواقع انقسام الببتيد في تسلسل البروتين (مركز تحليل التسلسل البيولوجي ، (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).
    خادم التنبؤ الببتيد إشارة SOSUIsignal (قسم التكنولوجيا الحيوية ، جامعة طوكيو للزراعة والتكنولوجيا).
    TargetP - يتنبأ بالموقع الخلوي للبروتينات حقيقية النواة (مركز تحليل التسلسل البيولوجي ، (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).

    بروتينات الغشاء والتنبؤ الطبولوجي

    DAS - DAS (طريقة المحاذاة السطحية الكثيفة) خادم التنبؤ عبر الغشاء (مركز ستوكهولم للمعلومات الحيوية).
    HMMTOP - خادم لتوقع حلزونات الغشاء وطوبولوجيا البروتين (تستضيفه الأكاديمية المجرية للعلوم).
    بنك بيانات البروتين الغشائي (MPDB) - قاعدة بيانات تحتوي على معلومات هيكلية ووظيفية مختارة عن بروتينات الغشاء والببتيدات (Trinity College Dublin).
    موارد البروتين الغشائية (مختبر ستيفن وايت ، جامعة كاليفورنيا ، إيرفين).
    بروتينات الغشاء للهيكل ثلاثي الأبعاد المعروف - قائمة محدثة باستمرار من مختبر ستيفن وايت ، جامعة كاليفورنيا ، إيرفين.
    اتجاهات البروتينات في الأغشية (OPM) - قاعدة بيانات توفر طوبولوجيا البروتينات الغشائية المتعلقة بالطبقة الدهنية ثنائية النواة الهيدروكربونية (Mosberg Lab ، جامعة ميتشيغان ، الولايات المتحدة).
    orienTM - يتنبأ بتوجه (طوبولوجيا) بروتينات الغشاء من التسلسل (الذي تستضيفه جامعة أثينا).
    بنك بيانات البروتين للبروتينات عبر الغشاء (PDBTM) قاعدة بيانات شاملة ومحدثة لبروتينات الغشاء في PDB (معهد علم الإنزيمات ، الأكاديمية المجرية للعلوم).
    SOSUI - التصنيف والتنبؤ بالهيكل الثانوي لبروتينات الغشاء (قسم الفيزياء التطبيقية ، جامعة ناغويا ، اليابان).
    TMHMM - توقع حلزونات الغشاء في البروتينات (مركز تحليل التسلسل البيولوجي ، (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).
    TMpred - التنبؤ بمناطق الغشاء والتوجيه (المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية).
    TopPred - التنبؤ الطبولوجي لبروتينات الغشاء (معهد باستور).

    لفائف - التنبؤ بمناطق لفائف البروتين (المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية).
    MARCOIL - برنامج يعتمد على نموذج ماركوف المخفي للتنبؤ بمجالات الملف الملفوف البروتيني. (المعلوماتية الحيوية ، معهد والتر وإليزا هول للأبحاث الطبية ، أستراليا).
    MultiCoil - توقع الملفات الملفوفة البروتينية ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد (مختبر علوم الكمبيوتر والذكاء الاصطناعي في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (CSAIL)).
    PairCoil2 - التنبؤ بمناطق الملف الملفوف في البروتينات غير المتعددة (MIT - CSAIL).

    مصدر تدهور البروتين (مختبر ويلكينسون ، كلية الطب بجامعة إيموري ، أتلانتا ، الولايات المتحدة).
    AAA - ATPases المرتبطة بالعديد من الأنشطة الخلوية لعائلة البروتين الفائقة - المعلومات والروابط (معهد العلوم البيولوجية الجزيئية ، غراتس ، النمسا.
    CutDB - مورد قاعدة بيانات يركز على شرح الأحداث الفردية الفعلية والمتوقعة لتحلل البروتين (معهد سانفورد-بورنهام للبحوث الطبية ، الولايات المتحدة).
    تسميات EC-IUBMB Peptidase: قوائم أ و ب.
    قاعدة بيانات بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية (المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) ، الولايات المتحدة).
    جمعية تحلل البروتين الدولية (IPS).
    MEROPS - قاعدة بيانات Peptidase (معهد Wellcome Trust Sanger ، المملكة المتحدة).
    NetChop - خادم تنبؤ موقع انشقاق البروتياز القائم على الشبكة العصبية (مركز تحليل التسلسل البيولوجي ، (CBS) ، الجامعة التقنية في الدنمارك).
    PAProC - منشأة للتنبؤ بموقع انشقاق البروتياز (أقسام علم المناعة والرياضيات الحيوية ، جامعة توبينغن.
    PeptideCutter - موقع انشقاق البروتياز (ExPASy- SIB).
    PoPS - أدوات حسابية للتنبؤ بنمذجة خصوصية البروتياز (اتحاد المعلوماتية الحيوية الفيكتوري - جامعة موناش ، أستراليا.

    عائلات البروتين المتخصصة الأخرى المختارة

    البيولوجيا الحسابية / المعلوماتية الحيوية

    المعلوماتية الحيوية @ جامعة مانشستر (المملكة المتحدة).
    قسم المعلوماتية الحيوية والتحليل الجزيئي (BIMAS) - مركز تكنولوجيا المعلومات (CIT) ، المعاهد الوطنية للصحة.
    Bioinformatics.ca (بوابة المعلومات الحيوية الكندية).
    مركز المعلوماتية الحيوية (جامعة سنغافورة الوطنية).
    معهد المعلوماتية الحيوية في الهند - مركز تعليمي وبحث وتطوير غير هادف للربح.
    دليل الروابط الكندية Bioinformatics.ca - قائمة ذات ميزات ديناميكية لموارد المعلوماتية الحيوية التي تسرد أيضًا جميع الروابط الموجودة في مشكلة خادم ويب NAR.
    منظمة المعلوماتية الحيوية - توفر موارد مجانية ومفتوحة للبحث والتطوير والتعليم.
    مركز المعلوماتية الجزيئية والجزيئية الحيوية (CMBI) - جامعة نيميغن ، هولندا.
    مركز البيولوجيا الحاسوبية (آي بي إم).
    مجموعة علم جينوم السرطان الحاسوبي (CCG) التابعة للمعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية (SIB) - تطوير أدوات التحليل وقواعد البيانات المتعلقة بالتسلسل الجزيئي والوظائف البيولوجية.
    متصفح Db - (المعلوماتية الحيوية ، جامعة مانشستر).
    المعهد الأوروبي للمعلومات الحيوية (EMBL-EBI).
    بوابة المنظمة العالمية لتعلم المعلوماتية الحيوية والتعليم والتدريب (GOBLET).
    معهد المعلوماتية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية (IBB) - جامعة بيون ، الهند).
    الجمعية الدولية لعلم الأحياء الحسابي (ISCB).
    بيولوجيا الرياضيات والحساب والأنظمة (MCSB جامعة كاليفورنيا ، إيرفين).
    المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) - المكتبة الوطنية الأمريكية للطب (NLM).
    مركز شنغهاي لتكنولوجيا المعلومات الحيوية (SCBIT)
    المعهد الوطني للمعلومات الحيوية في جنوب إفريقيا (SANBI) - جامعة ويسترن كيب.
    المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية (SIB).
    مؤسسة Open Bioinformatics Foundation (O | B | F) - منظمة غير ربحية يديرها المتطوعون تركز على دعم البرمجة مفتوحة المصدر في المعلوماتية الحيوية.

    حقوق النشر © 2020 ePitope Informatics


    إجماع هـ توقع المنفذ
    (الحمض النووي البشري
    إصلاح البروتين ،
    MGMT - الذروة
    بقايا حاتمة
    يظهر بالذهب).


    الملخص

    نقدم استراتيجية جديدة متعددة التخصصات تدمج البيولوجيا الحسابية مع تحليل ميكروأري عالي الإنتاجية بهدف ترجمة الفهم الجزيئي للتعرف على البروتين والأجسام المضادة إلى تصميم أدوات تحليلية وتشخيصية فعالة وانتقائية قائمة على البروتين. تم استخدام هياكل اثنين من البروتينات ذات الطيات المختلفة ومحتويات البنية الثانوية ، وهما FABP بيتا برميل و α-helical S100B ، كأساس للتنبؤ وتصميم حواتم ربط الأجسام المضادة المحتملة باستخدام الطريقة الحسابية MLCE التي تم تطويرها مؤخرًا . بدءًا من فكرة أن بنية وديناميكيات واستقرار مستضد البروتين تلعب دورًا رئيسيًا في التفاعل مع الأجسام المضادة ، فإن MLCE يدمج تحليل الخصائص الديناميكية والحيوية للبروتينات لتحديد شبكات التفاعل النشطة غير المحسّنة منخفضة الكثافة على سطح المستضدات المعزولة ، والتي تتوافق مع البنى التحتية التي يمكن التعرف عليها بشكل مناسب من قبل شريك ملزم. تم تصنيع الحواتم التي تم تحديدها بعد ذلك على شكل ببتيدات حرة واستخدامها لاستنباط أجسام مضادة محددة في الأرانب. الأهم من ذلك ، ثبت أن الأجسام المضادة الناتجة تتعرف تحديدًا وانتقائيًا على البروتينات الأصلية كاملة الطول في الاختبارات القائمة على المصفوفات الدقيقة. أظهرت تجارب المنافسة كذلك خصوصية التعرف الجزيئي بين البروتينات المستهدفة المعطلة والأجسام المضادة المتولدة. تُظهر نتائجنا الحسابية المتكاملة والقائمة على المصفوفات الدقيقة إمكانية اكتشاف وتصميم حواتم اصطناعية بشكل عقلاني قادرة على استنباط أجسام مضادة محددة للبروتينات كاملة الطول تبدأ فقط من المعلومات الهيكلية ثلاثية الأبعاد على الهدف. نناقش الآثار المترتبة على أغراض تطوير اللقاح والتشخيص.


    معلومة اضافية

    مساهمات المؤلفين

    نفذ HL إجراءات الاستنساخ ، وعلامات HA و MYC و TAP لـ Cbf1 و Tbf1 في C. البيض، والطبقات المناعية ، ووضع العلامات وتنقية التقارب لـ NOP1-TAP و ChIP-CHIP لـ Cbf1-TAP و Tbf1-TAP وكذلك لاكز فحوصات مراسل. قامت AS و CA ببناء Mcm1-TAP C. البيض سلالة وأداء ChIP-CHIP لـ Mcm1-TAP في كل من حالات الخميرة والهايفال. أشرف AN و MW على العمل. تمت كتابة المسودة الأولى للمقال بواسطة HL و AS. كل الكتاب قراءة وافقت على المخطوط النهائي.


    نتائج

    يمكن وضع علامة على البروتينات في محطة N- أو C الخاصة بهم. بالنسبة إلى وضع العلامات على أساس GCE ، اخترنا تصميم علامة N-terminal لتجنب اقتطاع البروتين الناتج عن التضمين غير الفعال لـ ncAA [5 ، 6 ، 16 ، 17]. على أساس عملنا السابق ، تم استنساخ العلامات المحتملة في ناقل تعبير واحد ، مصمم لترميز دمج ncAA bicyclo-nonyne Lysine (BCN-Lys) الذي يتفاعل بيولوجيًا مع الأصباغ المترافقة مع التترازين (الشكل 1 ب و ملف إضافي 1: الشكل S1a) [6، 18، 19]. تم تقييم فاعلية الوسم مبدئيًا باستخدام α-tubulin كمعيار وتقييم لوضع العلامات على الأنابيب الدقيقة (MT) في خلايا الثدييات الحية في وجود Silicon-Rhodamine-Tetrazine (SiR-Tet) [6 ، 20]. تم استخدام علامات MT التي تم الحصول عليها عند دمج BCN-Lys الخاص بالموقع في α-tubulin في الموضع 45 (α-tubulin 45TAG) كمرجع ، بالنظر إلى عرضنا السابق لفعالية وضع العلامات MT في هذا الموقع [6].

    يجب أن تتضمن علامة GCE- الحد الأدنى من N-terminal- كودون TAG الذي سيشفر دمج BCN-Lys. لسوء الحظ ، لم يتم الحصول على تصنيف محدد عند التعبير عن α-tubulin الذي يحمل كودون TAG في طرفه N (مباشرة قبل البقايا الأولى) في وجود SiR-Tet ، باستخدام تصوير الخلايا الحية أو مضان في هلام (ملف إضافي 1: الشكل S1b و S2). يشير هذا إلى أن الإضافة الوحيدة لكودون TAG في بداية تسلسل تشفير البروتين ليست كافية لوضع العلامات ، ربما بسبب فشل الريبوسوم في دمج ncAA عند الطرف N من البروتين. لذلك ، تم تصميم علامات N-terminal المحتملة ، التي تحمل أطوالًا مختلفة ، بناءً على حاتمة هيماجلوتينين (HA) التسعة الشائعة الاستخدام بشكل شائع كعمود فقري [21] (الشكل 2 أ وملف إضافي 1: الشكل S1c- F). تم إدخال كودون TAG إما في تسلسل HA (استبدال الكودون الأخير في الحلقة) (1) ، مباشرة بعد تسلسل HA (2) ، أو بعد رابط مرن قصير شائع الاستخدام يشتمل إما على جلايسين سيرين (GS 3) أو جلايسين جلايسين سيرين جلايسين (GGSG 4). لوحظت مستويات منخفضة ولكن ملحوظة من α-tubulin باستخدام أي من هذه العلامات ، مما يشير إلى أنه تم التعبير عن α-tubulin الموسوم بـ N في الخلايا (الشكل 2 ب). في تجارب وضع العلامات على الخلايا الحية باستخدام SiR-Tet ، تم الحصول على القليل من الزخرفة MT باستخدام α-tubulin الموسومة بالمجسات 1 أو 2 (الشكل 2 ج ، 1-2) ، بينما لوحظ وضع العلامات الواضحة والمحددة باستخدام العلامات 3 و 4 (الشكل 2 ج ، 3-4) ، مما يشير إلى أن المسبارين 3 و 4 يمكن أن يعملوا كعلامات GCE لـ α-tubulin.

    تحسين علامة الحد الأدنى لتوسيع الشفرة الوراثية (GCE) لوضع العلامات الفلورية باستخدام α-tubulin. أ عرض تخطيطي للعلامات المستخدمة والمختبرة في به. يتم عرض التسلسلات الكاملة للعلامات في الملف الإضافي 1: الشكل S1c-f. به تم استنساخ علامات GCE (المحددة في أ) بشكل فرعي إلى الطرف N من α-tubulin باستخدام بلازميد pBUD-Pyl-RS-tub (ملف إضافي 1: الشكل S1a). HEK293T (ب) أو COS7 (جه) تم نقل الخلايا باستخدام البلازميدات pBUD-Pyl-RS-tub التي تحمل علامات مختلفة ، أو نسخة WT من α-tubulin ، أو بدون بروتين مستهدف ، وحضنت لمدة 48 ساعة في وجود ncAA BCN-Lys. ثم خضعت الخلايا لتحليل اللطخة الغربية (ب) أو المسمى بـ SiR-Tet لمدة ساعة واحدة وتم تصويره على الهواء مباشرة (جه). الصور بتنسيق ج هي توقعات الحد الأقصى لشدة مكدسات z ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها من الخلايا التمثيلية. د صور مكبرة للمناطق المميزة بالمربعات الصفراء في ج. تم رسم قيم الكثافة على طول الخطوط الحمراء المرسومة في الصور أدناه ، مما يدل على التحسن في نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR). ه تم قياس قيم SNR في الخلايا التي تعبر عن α-tubulin مع BCN-Lys إما في الموضع G45 أو في الطرف N عبر العلامات 3 أو 4. كان متوسط ​​SNR المقاس في الخلايا التي تعبر عن T tubulin هو 1.2 (خط أحمر متقطع). كان متوسط ​​SNR الذي تم قياسه مسبقًا باستخدام GFP 1.75 (خط متقطع أخضر). ن = 25. النتائج المعروضة في به تم الحصول عليها في 3 تجارب مستقلة على الأقل. F عرض تخطيطي لعلامة GCE المُحسَّنة المستخدمة لمزيد من العلامات. أشرطة مقياس: ج 10 ميكرومتر ، د 2 ميكرومتر

    لتقييم كفاءات وضع العلامات التي تم الحصول عليها باستخدام علامات GCE المحتملة ، تم قياس نسب الإشارة إلى الضوضاء (SNRs) في الخلايا المصنفة بناءً على ملامح شدة الخط ، كما هو موضح في الشكل 2 د. كانت قيم SNR التي تم قياسها في الخلايا التي تعبر عن أي من إصدارات α-tubulin أعلى بكثير من متوسط ​​مستويات الخلفية المقاسة في الخلايا التي تعبر عن إصدار من النوع البري (WT) من α-tubulin غير قادر على دمج ncAA ، والتحقق من أن وضع العلامات محدد ( الشكل 2 هـ). أظهرت الخلايا التي تعبر عن α-tubulin الموسومة بالمسبار 4 نسبة SNR أعلى بكثير مقارنة بالمسبار 3 ، مما يشير إلى أن HA-GGSG-ncAA مفضل على HA-GS-ncAA لوصف MT. بشكل ملحوظ ، على الرغم من مستويات التعبير المنخفضة نسبيًا التي تم الحصول عليها باستخدام المسبار 4 ، فإن متوسط ​​قيم SNR التي تم الحصول عليها في الخلايا التي تعبر عن α-tubulin الموسوم بالمسبار 4 كانت أعلى من تلك التي تم الحصول عليها في الخلايا التي تعبر عن α-tubulin 45TAG أو في الخلايا التي تعبر عن α-tubulin-GFP ( الشكل 2 د ، هـ) [6]. يمكن أن تنتج SNRs المحسّنة تحت مستويات تعبير α-tubulin المنخفضة عن تقليل جزء التوبولين العصاري الخلوي (غير المبلمر) في الخلايا وهو مفضل لفسيولوجيا الخلية. لذلك خلصنا إلى أن α-tubulin الموسوم HA-GGSG-ncAA يتفوق على α-tubulin الخاص بالموقع من أجل وضع العلامات MT. بناءً على هذه النتائج ، حددنا N ′ HA-GGSG-ncAA باعتباره العلامة الدنيا لوضع العلامات البيولوجية المتعامدة المستندة إلى GCE للبروتينات في خلايا الثدييات الحية (الشكل 2f).

    لفحص قابلية تطبيق وخصوصية علامة GCE (HA-GGSG-ncAA ، الشكل 2f والملف الإضافي 1: الشكل S1f) لوضع العلامات على الأجزاء الخلوية المختلفة ، طبقناها أولاً على العلامات الخلوية المقترنة بـ GFP ، أي ، علامة غشاء البلازما (PM) GFP-CAAX وعلامة بيروكسيسومال GFP-SKL (الشكلان 3 و 4). تم التعبير عن GFP-CAAX الموسوم بـ GCE في خلايا عند مستويات أعلى من GFP-CAAX التي تحمل كودون TAG في الموضع الأمثل في GFP (GFP 150TAG -CAAX ، الشكل 3 أ) [19]. على الدوام ، لوحظ زخرفة PM في الخلايا التي تعبر إما عن GFP-CAAX أو GFP 150TAG -CAAX الموسومة بـ GCE وتم تمييزها بـ SiR-Tet في كل من قنوات GFP و SiR بقيم SNR متشابهة نسبيًا (الشكل 3 ب ، ج). كانت قيم SNR التي تم قياسها لوضع العلامات PM باستخدام قناة SiR لـ GFP-CAAX أو GFP 150TAG CAAX الموسومة بـ GCE متشابهة وأعلى بكثير من المستويات المقاسة في الخلايا التي تعبر عن GFP-CAAX غير قادرة على دمج ncAA (WT GFP-CAAX) ، تشير إلى أن وضع العلامات محدد ولا يتعرض للخطر بواسطة علامة الحملة العالمية للتعليم (الشكل ثلاثي الأبعاد ، هـ).

    يمكن مقارنة وضع العلامات على غشاء البلازما (PM) الذي تم الحصول عليه عبر علامة GCE الأدنى مع GFP ووضع العلامات الخاصة بالموقع. HEK293T (أ) أو COS7 (به) تم نقل الخلايا باستخدام بلازميدات pBUD-Pyl-RS التي تحمل GCE-tag-GFP-CAAX أو GFP-CAAX التي تحورت في الموضع 150 إلى TAG أو نسخة WT من GFP-CAAX ، واحتُضنت لمدة 48 ساعة في وجود BCN-Lys . ثم خضعت الخلايا لتحليل اللطخة الغربية (أ) أو المسمى بـ SiR-Tet لمدة ساعة واحدة وتم تصويره على الهواء مباشرة (به). تمثل الصور شرائح (كنفوكل) مفردة من الخلايا التمثيلية. د تم الحصول على ملفات تعريف شدة الخط في الخلايا التي تعبر عن التركيبات المشار إليها والمسمى بـ SiR-Tet. اللوحة العلوية: صور مكبرة لشرائح متحد البؤر. اللوحة السفلية: قيم الكثافة على طول الخط المتقطع المرسوم في الصور. ه تم قياس قيم SNR لـ GFP و SiR في الخلايا التي تعبر عن الإصدارات المختلفة من GFP-CAAX. ن = 30. تم الحصول على النتائج في ما لا يقل عن 3 تجارب مستقلة. أشرطة مقياس: ب, ج 10 ميكرومتر ، د 2 ميكرومتر

    إظهار خصوصية الملصقات وكفاءتها في البيروكسيسومات المسمى بـ GFP-SKL الموسومة بـ GCE. HEK293T (أ, ب) أو COS7 (جF) تم نقل الخلايا باستخدام بلازميدات pBUD-Pyl-RS التي تحمل تركيبات GFP-SKL المشار إليها واحتضانها لمدة 48 ساعة في وجود ncAA BCN-Lys (باستثناء الممرات 1 و 3 في ب). ثم خضعت الخلايا لتحليل اللطخة الغربية (أ) أو المسمى بـ SiR-Tet لمدة 1 ساعة وتعرض لمعة في الهلام (ب) أو صور حية (جز). ب تم تفكيك الخلايا ، وتم تحميل كميات متساوية من البروتين الكلي على SDS-PAGE. تم تسجيل النتائج باستخدام مضان SiR. شوهد نطاق محدد يحصل على حجم مماثل لتلك التي تم الحصول عليها في لطخة غربية فقط في الخلايا التي تعبر عن GCE-tag-GFP-SKL واحتضانها باستخدام BCN-Lys ، مما يشير إلى وضع العلامات المحددة. ج, د توقعات الكثافة القصوى للخلايا التمثيلية. من اليسار إلى اليمين: تم الحصول على الفلورة في كل قناة ، وتحليل الصورة المدمجة والتحليل المشترك بين قيم الشدة لـ 640 (SiR) و 488 (GFP) على مجموعة فرعية كبيرة من الخلية التي تستثني النواة (مستطيل أبيض في صورة مدمجة): قيم ارتباط بيرسون: ج 0.86, د 0.07. ه من اليسار إلى اليمين: صورة مكبرة للخلية ج، ملف تعريف شدة الخط المقاس للخط المتقطع في الصورة المكبرة ، وملخصًا لقيم SNR المقاسة لـ GFP و SiR في الخلايا التي تعبر عن الإصدارات المختلفة من GFP-SKL. ن = 40. F, ز تم تصنيف الخلايا التي تعبر عن التركيبات المشار إليها بـ SiR-Tet وتم تصويرها باستخدام معلمات تصوير مماثلة (وقت التعرض وكثافة الليزر). F تم تجزئة بيروكسيسومات إيجابية GFP على أساس الكثافة. لكل بيروكسيسوم ، تم رسم متوسط ​​الكثافة في قناة GFP مقابل متوسط ​​الشدة في قناة SiR.

    95 ٪ من البيروكسيسومات التي تحمل علامة GFP أظهرت مستويات شدة SiR أعلى من الخلفية. ز تم تقسيم النقاط النقاط الإيجابية لـ SiR على أساس الشدة. لكل نقطة ، تم رسم متوسط ​​الشدة في قناة SiR مقابل متوسط ​​الشدة في قناة GFP.

    5٪ من النقاط الإيجابية لـ SiR كانت GFP سلبية. كان متوسط ​​مستويات الشدة المقاسة لـ SiR puncta في الخلايا التي تعبر عن GCE-tag-GFP-SKL أعلى مرتين على الأقل من المستويات المقاسة لنقاط SiR المجزأة في خلايا التحكم التي تعبر عن WT GFP-SKL ، مما يشير إلى وضع العلامات المحددة. تم الحصول على النتائج في 3 تجارب مستقلة على الأقل. أشرطة مقياس 10 ميكرومتر

    تم التعبير عن GFP-SKL الموسومة بـ GCE في خلايا HEK293 ، ولوحظ نطاق محدد بحجم مماثل في اختبار مضان في هلام عند وضع العلامات على الخلايا باستخدام SiR-Tet ، في وجود BCN-Lys (الشكل 4 أ ، ب). بشكل ملحوظ ، بينما تم التعبير عن WT GFP-SKL بمستويات أعلى مقارنة بـ GFP-SKL الموسومة بـ GCE ، لم يلاحظ أي وضع علامات محددة لـ WT GFP-SKL باستخدام مضان في الهلام ، مما يشير بقوة إلى أن وضع العلامات يتم بشكل خاص عن طريق ربط Fl- صبغ إلى ncAA في GFP-SKL الموسومة بـ GCE. في الخلايا الحية ، لوحظ توطين مشترك ملحوظ لـ GFP و SiR في نقاط صغيرة في جميع أنحاء الخلية (باستثناء النواة) عند SNRs مماثلة (الشكل 4 ج ، ارتباط بيرسون = 0.86). لم يكن هذا هو الحال في الخلايا التي تعبر عن WT GFP-SKL والمسمى بـ SiR ، والتي أظهرت ارتباطًا مضادًا بين GFP و SiR puncta (الشكل 4 د ، هـ ، ارتباط بيرسون = 0.07). في هذه الخلايا ، لوحظ وجود عدد قليل من السكان من SiR puncta ولكن لم يتم توطين هذه النقاط مع نقاط GFP التي لوحظت في جميع أنحاء الخلية. تشير هذه النتائج أيضًا إلى أن التوطين المشترك الذي لوحظ في الخلايا التي تعبر عن GFP-SKL الموسومة بـ GCE نتج عن تصنيف SiR للبروتين.

    سمح لنا تنظيم إشارة التألق في النقاط المنفصلة في الخلايا المسمى SKL بتقدير غلة وضع العلامات النسبية عن طريق تقسيم سكان النقاط النقطية في قناة واحدة وتحديد شدتها في القناة الأخرى (الشكل 4f ، ز). أظهرت نقاط GFP المقسمة من الخلايا التي تعبر عن WT GFP-SKL والمسمى بـ SiR-Tet مستويات منخفضة من SiR لم تتسع مع مستويات كثافة GFP (الشكل 4f). لذلك رأينا أن مستويات SiR التي تم الحصول عليها في هذه الخلايا تمثل خلفية مضان SiR. في الخلايا التي تعبر عن GFP-SKL الموسومة بـ GCE ، فإن غالبية نقاط GFP المجزأة (

    95 ٪) كانت مستويات شدة SiR أعلى من تلك المقاسة في الخلايا التي تعبر عن WT GFP-SKL. علاوة على ذلك ، تم تحجيم مستويات الشدة في قناة SiR بكثافة GFP ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام مضان SiR لقياس المستويات النسبية لـ GFP-SKL في بيروكسيسومات مفردة. أدى تقسيم النقاط النقطية الإيجابية لـ SiR في الخلايا التي تعبر عن GFP-SKL الموسومة بـ GCE إلى سلوك مماثل على مستوى العالم ، مع وجود عدد قليل من السكان (أقل من 5 ٪) من SiR puncta التي ظهرت GFP سلبية (الشكل 4g). في الخلايا التي تعبر عن WT GFP-SKL ، تم تجزئة عدد قليل من السكان من SiR puncta. تحتوي هذه النقاط على مستويات شدة منخفضة في كل من قنوات GFP و SiR مقارنة بنقاط SiR المجزأة في خلايا GFP-SKL التي تحمل علامات GCE ، مما يشير إلى أنها تمثل ضوضاء. يمكن تصفية هذه الهياكل بسهولة بناءً على الكثافة ، باستخدام معالجة الصور. مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن وضع العلامات المستندة إلى علامة GCE-SiR له

    عائد 95 ٪ مقارنة بـ GFP ويمكن استخدامه للتصوير الكمي للخلايا الحية للبيروكسيسومات.

    بعد ذلك ، اختبرنا متانة العلامة من خلال تطبيقها على العضيات الخلوية المتنوعة. لذلك ، استخدمنا Lamp1 كعلامة ليسوزومية ، CD63 كعلامة للأجسام متعددة الخلايا (MVBs) ، ER cb5 TM كعلامة شبكية إندوبلازمية (ER) ، Exo70 كعلامة خارجية ، و Mito cb5 TM (ميتو) أو ميتو- DsRed كعلامات ميتوكوندريا (للتسلسلات ، انظر الملف الإضافي 1: الجدول S1). تم تجنب وضع العلامات النووية بسبب العلامات غير المحددة المعروفة للنواة التي تمت ملاحظتها مع وضع العلامات على أساس GCE (الأشكال 2 ج 3 ب ، ج و 4 ج ، د) [4 ، 6 ، 16]. تم الحصول على وضع العلامات على الليزوزوم الفعال باستخدام Lamp1 الموسومة بـ GCE في وجود SiR-Tet (الشكل 5 أ ، ب). بشكل عام ، كانت العلامات قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام Lamp1-mVenus. أظهرت الجسيمات الحالة المسمى عبر أي من العلامات (أي علامة GCE أو mVenus) استجابة مماثلة للعلاج بالكلوروكين ولديها مستويات SNR مماثلة (الشكل 5 أ-ج) [22]. لاحظنا أنه في حين أن وضع العلامات على الليزوزوم باستخدام Lamp1-mVenus يسلط الضوء على كل من الهياكل المملوءة والجوفاء ، فقد لوحظ فقط الهياكل المملوءة في الخلايا التي تحمل علامة GCE-tag-SiR-Lamp1. قد ينتج هذا الاختلاف عن موضع العلامة التي تواجه علامة mVenus العصارة الخلوية ، بينما تواجه علامة GCE التجويف الليزوزومي. يعتبر تصنيف بروتينات التجويف الليزوزومي باستخدام البروتينات الفلورية التقليدية أمرًا صعبًا بسبب حساسية الأس الهيدروجيني للأخير [23]. تشير بياناتنا إلى أن وضع العلامات المستند إلى علامة GCE متوافق مع وضع العلامات على الهياكل الخلوية الحمضية.

    يتم الحصول على وضع العلامات على الليزوزوم الفعال باستخدام SiR-Tet بينما يتطلب وضع العلامات MVB TAMRA-Tet. أج الخلايا التي تعبر عن GCE-tag-Lamp1 المسمى بـ SiR-Tet (أ) أو Lamp1-mVenus (ب). الألواح اليسرى: لا يوجد علاج. الألواح اليمنى: المعالجة بمثبط الليزوزوم الكلوروكين (3 ساعات ، 120 ميكرومتر). تظهر الصور المكبرة لمجموعة فرعية من الخلايا (تتوافق مع المربعات في اللوحات العلوية) في اللوحات السفلية. تشير الأسهم إلى وضع العلامات الجسيمية المملوءة مقابل الجوفاء. ج من اليسار إلى اليمين: ملفات تعريف شدة الخط المقاسة للخط الأحمر المتقطع في أ، الخط الأخضر المتقطع في ب، وملخصًا لقيم SNR المقاسة في الخلايا التي تعبر عن البلازميدات المشار إليها (ن = 50). د تم إصلاح خلايا COS7 التي تعبر عن علامة MVB CD63 المقترنة بعلامة GCE وتلطيخها بأجسام مضادة لـ HA و CD63. ه, F وضع العلامات MVB في الخلايا التي تعبر عن GCE-tag-CD63 المسمى بـ TAMRA-Tet ​​(ه) أو CD63-mCherry (F). ز تقاس قيم SNR في الخلايا التي تعبر عن البلازميدات المشار إليها. ن = 50. النتائج المعروضة في كل لوحة تم الحصول عليها في ما لا يقل عن 3 تجارب مستقلة. أشرطة مقياس ، صور مكبرة 10 ميكرومتر ، 2 ميكرومتر

    المحاولات الأولية لوضع العلامات على MVBs و ER والميتوكوندريا والإكسوسومات باستخدام علامة GCE و SiR-Tet لم ينتج عنها تلطيخ محدد (ملف إضافي 1: الشكل S3). ومع ذلك ، في تجارب التلقيح المناعي باستخدام الأجسام المضادة لـ CD63 ، تم توطين CD63 الموسوم بـ GCE مع CD63 الداخلي (الشكل 5 د). وبالتالي ، فقد استنتجنا أن CD63 الذي يحمل علامة GCE قد تم التعبير عنه واستهدافه بشكل صحيح في الخلايا ، ومع ذلك فشلنا في ربط صبغة Fl عبر التفاعل الحيوي المتعامد. تمشيا مع هذه الفكرة ، أدى استبدال TAMRA-Tet ​​لـ SiR-Tet إلى وضع علامات محددة على MVBs و ER و exosomes باستخدام CD63 الموسومة بـ GCE و ER cb5 TM و Exo70 ، على التوالي (الأشكال 5e-g و 6). لم يتم الحصول على وسم الميتوكوندريا باستخدام إما SiR- أو TAMRA-Tet ​​مع GCE-tag-Mito cb5 TM أو مجسات mito-DsRed (ملف إضافي 1: الشكل S4). استنادًا إلى تجارب التألق المناعي ، يبدو أنه في حين فشل Mito cb5 TM في التوطين في الميتوكوندريا ، تم ترجمة Mito-DsRed الموسومة بـ GCE بشكل صحيح ولكنها فشلت في ربط الصبغة المترافقة مع التيرازين (ملف إضافي 1: الشكل S4). كانت أنماط التعبير وقيم SNR التي تم الحصول عليها باستخدام علامات العضية الموسومة بـ GCE والتي تم تصنيفها بنجاح (على سبيل المثال ، لـ MVBs و ER و exosomes) قابلة للمقارنة بشكل عام مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام علامات بروتين Fl التقليدية مع SNRs أفضل تم الحصول عليها لـ MVBs الموسومة بـ GCE و تم الحصول على نسبة SNR منخفضة لـ ER الموسومة بـ GCE (الأشكال 5e-g و 6). في جميع الحالات (الهياكل الخلوية الموسومة بـ SiR أو TAMRA التي تحمل علامة GCE) ، كانت مستويات شدة الإشارة أعلى بكثير من مستويات الخلفية المقاسة في الخلايا التي تعبر عن ترميز البلازميد فقط زوج tRNA / tRNA-synthetase المتعامد والمسمى بـ Tet- المترافق المقابل صبغات فلورية (الشكل 6 ز). معًا ، تتحقق هذه النتائج من صحة خصوصية التوسيم وتوافق علامة GCE لتوسيم العضية.

    تعرض Exosomes و ER وضع علامات خلوية محددة عبر علامة GCE الحد الأدنى في وجود TAMRA-Tet. تم نقل خلايا COS7 بالبلازميدات المشار إليها ، وتم تمييزها عند الإشارة إليها ، وتم تصويرها مباشرة بعد 48 ساعة. أ, ب, د, ه من اليسار إلى اليمين: أقصى صور إسقاط ، صور مكبرة لمجموعة فرعية من الخلايا (تتوافق مع المربعات في اللوحات اليسرى) ، ملفات تعريف كثافة الخطوط المقاسة للخطوط المتقطعة في اللوحات الوسطى. ج, F تم قياس قيم SNR في الخلايا التي تعبر عن البلازميدات المشار إليها (ن Exo70 = 40 ، ER cb5 TM = 45). ز تم نقل الخلايا باستخدام البلازميدات pBUD-Pyl-RS المشار إليها وتم تسميتها بـ SiR-Tet أو TAMRA-Tet ​​، كما هو محدد. لكل حالة ، تم قياس متوسط ​​مستويات الشدة لمنطقة الاهتمام داخل الخلية وتم تقسيمها حسب متوسط ​​كثافة الخلفية المقاسة خارج الخلية. تم استخدام البلازميدات pBUD-Pyl-RS التي لا يتم ترميزها لبروتين مهم كعناصر تحكم سلبية (بدون بروتين). ن = 15. تم الحصول على النتائج المعروضة في كل لوحة في 3 تجارب مستقلة على الأقل. أشرطة مقياس ، صور مكبرة 10 ميكرومتر ، 2 ميكرومتر

    تم الحصول أيضًا على علامات ناجحة ومحددة للبروتين خارج الخلية الذي يحمل علامة GCE EGFR وبروتين ESCRT-III داخل الخلايا CHMP4B كما يتضح من مضان الهلام وتصوير الخلايا الحية (ملف إضافي 1: الشكل S5). بالنسبة إلى وضع العلامات EGFR ، تم إدخال علامة GCE بين ببتيد الإشارة وتسلسل تشفير البروتين (ملف إضافي 1: الشكل S5c ، د) ، مما يشير إلى أن علامة GCE ليست حصرية للطرف N. وبالتالي ، إلى جانب استخدامها في وضع العلامات على العضية ، يمكن استخدام علامة GCE لوصف البروتينات داخل وخارج الخلايا في الخلايا الحية.

    سمحت تسمية Fl-dye للتركيبات التي تحمل علامة GCE بتسجيلات الخلايا الحية وتتبع أي من الهياكل الخلوية المسمى (مثل MT و PM و peroxisomes و ER و MVB و exosomes الشكل 7 وملف إضافي 2: فيلم S1 ، ملف إضافي 3: فيلم S2 ، ملف إضافي 4: فيلم S3 ، ملف إضافي 5: فيلم S4 ، ملف إضافي 6: فيلم S5 ، ملف إضافي 7: فيلم S6 ، ملف إضافي 8: فيلم S7 ، وملف إضافي 9 فيلم S8). تم إجراء استعادة الفلورة بعد تجارب التبييض الضوئي (FRAP) بنجاح باستخدام علامة GCE-ER cb5 TM ER ، مع أوقات استرداد مماثلة لتلك التي تم قياسها في ER باستخدام VSVG-GFP [24] (الشكل 7 ج وملف إضافي 8: فيلم S7 ، ملف إضافي 9: فيلم S8). من الجدير بالذكر أن الحجم الكلي لعلامة GCE-tag-ER cb5 TM ER أصغر بكثير من VSVG-GFP (GCE-tag-ER cb5 TM ،

    84.5 كيلو دالتون). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام علامات العضية المستندة إلى GCE التي تم تطويرها حديثًا والتي تم الإبلاغ عنها هنا لدراسة ديناميات العضية في الخلايا الحية باستخدام مجسات أصغر بكثير.

    تسجيلات الخلايا الحية للعضيات الخلوية المسمى بعلامة GCE وصبغة Fl المترافقة التيرازين. أ تسجيلات الخلايا الحية للخلايا التي تعبر عن GCE-tag-GFP-SKL المسمى بـ SiR-Tet. اللوحة العلوية: تم التقاط أقصى صور إسقاط للخلية بأكملها في الوقت 0. اللوحة السفلية: صور مكبرة متسلسلة لمجموعة فرعية من الخلية (تتوافق مع مربع في اللوحة العلوية) مأخوذة من سلسلة الأفلام. يتم عرض كل إطار رابع من سلسلة الأفلام (ملف إضافي 4: فيلم S3). ب تسجيلات الخلايا الحية للخلايا التي تعبر عن GCE-tag-CD63 المسمى بـ TAMRA-Tet. على اليسار ، تم التقاط أقصى صورة إسقاط للخلية بأكملها في الوقت 0. تظهر الصور المتسلسلة المكبرة لمجموعة فرعية من الخلية (تتوافق مع المربع في اللوحة اليسرى) المأخوذة من سلسلة الأفلام إلى اليمين. يتم عرض كل إطار رابع من سلسلة الأفلام (ملف إضافي 6: فيلم S5). ج تحليل FRAP للخلايا التي تعبر عن GCE-tag-ER cb5 TM المسمى بـ TAMRA-Tet. يتم عرض لقطات لمجموعة فرعية من خلية تمثيلية مأخوذة من سلسلة الأفلام (ملف إضافي 8: فيلم S7) في اللوحة العلوية. يتم عرض الصور المتسلسلة لعائد الاستثمار المبيض في اللوحة السفلية (ملف إضافي 9: فيلم S8). تمثل المؤامرة الموجودة على اليمين التوافق الأسي لاستعادة كثافة التألق مقابل الوقت بعد التبييض الضوئي في العائد على الاستثمار. تم تصحيح قيم الكثافة للتبييض غير المقصود وتم تطبيعها إلى مستويات الشدة المقاسة قبل التبييض. تم الحصول على النتائج المعروضة في كل لوحة في 3 تجارب مستقلة على الأقل. أشرطة مقياس ، صور مكبرة 10 ميكرومتر ، 2 ميكرومتر

    ملف إضافي 2: فيلم S1. ديناميات الأنابيب الدقيقة في الخلايا المسمى بـ GCE-tag-α-tubulin. تم تسجيل خلايا COS7 التي تعبر عن GCE-tag-α-tubulin والمسمى بـ SiR-Tet على فترات 4 ثوانٍ. تظهر الإسقاطات القصوى للشدة المكونة من 3 شرائح z مأخوذة من خلية تمثيلية. شريط النطاق: 10 ميكرومتر.

    الملف الإضافي 4: فيلم S3. ديناميات البيروكسيسوم في الخلايا المسمى بـ GCE-tag-GFP-SKL. تم تسجيل خلايا COS7 التي تعبر عن GCE-tag-GFP-SKL والمسمى بـ SiR-Tet على فترات 5.3 ثانية. اللوحة اليسرى: 488 قناة (GFP ، خضراء) ، اللوحة الوسطى: قناة 640 (SiR ، حمراء). تظهر توقعات الحد الأقصى للكثافة لـ 30 شريحة z مأخوذة من خلية تمثيلية. شريط النطاق: 10 ميكرومتر.

    الملف الإضافي 8: فيلم S7. تصور ديناميكيات ER من خلال تطبيق FRAP على GCE-tag-ER cb5 TM المسمى ER. تم تصوير خلايا COS7 التي تعبر عن GCE-tag-ER cb5 TM المسمى بـ TAMTA-Tet ​​لمدة دقيقتين بفواصل زمنية قدرها 2 ثانية. تم إجراء التبييض الضوئي بعد 4 نقاط زمنية أساسية (12 ثانية). تظهر الإسقاطات القصوى للشدة المكونة من 3 شرائح z مأخوذة من خلية تمثيلية. شريط النطاق: 10 ميكرومتر.

    تشتمل علامة GCE الطويلة المكونة من 14 وحدة بنائية الموصوفة هنا على التسلسل الكامل لعلامة HA. على هذا النحو ، لا يزال من الممكن استغلال حاتمة HA لتطبيقات أخرى ، مثل اللطخة المناعية ، والتألق المناعي ، والترسيب المناعي (الشكلان 2 ب و 5 د). لتوسيع تعدد استخدامات العلامة ، اختبرنا ما إذا كان يمكن استبدال حاتمة HA بحلقات FLAG (8 بقايا) أو Myc (10 بقايا) (الشكل 8 وملف إضافي 1: الشكل S6). تم التعبير عن بنيات GFP-SKL التي تحمل علامات HA / FLAG / Myc GCE بنجاح في الخلايا ، مع تألق SiR-Tet المشترك مع GFP (قيم ارتباط بيرسون: FLAG ، 0.87 Myc ، 0.67) (الشكل 8 أ ، ب اللوحة العلوية ، وملف إضافي 1: الشكل S6a، b). تم الحصول أيضًا على تصنيف فعال للإكسوسومات باستخدام إصدارات علامة FLAG و Myc المقترنة بـ Exo70 ، كما يتضح من التصوير بالخلايا الحية وفلورة TAMRA في الهلام (الشكل 8 ج اللوحة العلوية والملف الإضافي 1: الشكل S6c ، هـ). ومع ذلك ، يبدو أن وضع العلامات MT قد تعرض للخطر باستخدام علامات FLAG / Myc GCE ، مع وجود عدد قليل جدًا من الخلايا التي تظهر تلطيخ MT باستخدام علامة Myc GCE (الشكل 8d اللوحة العلوية والملف الإضافي 1: الشكل S6d). كما لوحظ انخفاض وضع العلامات المحددة باستخدام مضان SiR في هلام (ملف إضافي 1: الشكل S6f). ومع ذلك ، في حين كان تلطيخ MT أكثر بروزًا باستخدام علامة FLAG GCE ، لوحظ وضع علامات أعلى لعلامة Myc GCE باستخدام مضان في الهلام. تشير هذه البيانات إلى أنه في بعض الحالات ، لا يعكس المستوى الإجمالي للبروتين المسمى قدرته على تصنيف بنية خلوية معينة. بشكل جماعي ، توضح هذه النتائج أن النظام متعدد الاستخدامات ، من حيث الحاتمة المستخدمة في العلامة. ولكن ، على الرغم من أن إصدار HA للعلامة يبدو قويًا ، إلا أن وضع العلامات باستخدام إصدارات epitope الأخرى يحتاج إلى تقييم أكثر دقة.

    تعد علامة GCE متعددة الاستخدامات ويمكن تصغيرها في بعض الحالات. أ تحليل اللطخة الغربية لخلايا HEK293T المنقولة ببلازميد pBUD-Pyl-RS المُدرج مع GFP-SKL N- الموسوم نهائيًا مع (من اليسار إلى اليمين) علامة GCE المُحسَّنة (HA-GGSG-ncAA) ، العلامات ذات الحلقات القصيرة البديلة FLAG- GGSG-ncAA و Myc-GGSG-ncAA ، وعلامة بدون حاتمة (GGSG-ncAA). تم تحضين الخلايا لمدة 48 ساعة في وجود BCN-Lys ، وتم حصادها وتعريضها لتحليل اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة لـ GFP. بد إسقاطات الكثافة القصوى المأخوذة من صور الخلايا الحية لخلايا COS7 المنقولة باستخدام FLAG-GGSG-ncAA (اللوحات العلوية) أو GGSG-ncAA (اللوحات السفلية) المقترنة بـ GFP-SKL (ب) ، Exo70 (ج) ، أو α-tubulin (د) والموسومة بأصباغ التترازين المشار إليها. مؤامرات في ب تمثل تحليل التوطين المشترك بين قيم الشدة لقنوات 640 (SiR) و 488 (GFP) التي يتم إجراؤها على مجموعات فرعية كبيرة من الخلايا التي تستبعد النواة (تتوافق مع المستطيلات في الصورة المدمجة) قيم ارتباط بيرسون: اللوحة العلوية ، اللوحة السفلية 0.87 ، 0.76. ج, د اليسار ، أقصى كثافة إسقاط للخلايا التمثيلية. على اليمين ، تقاس ملامح شدة الخط للخطوط المتقطعة في اللوحات اليسرى. تم الحصول على النتائج المعروضة في كل لوحة في 3 تجارب مستقلة على الأقل. شريط مقياس 10 ميكرومتر

    أخيرًا ، اختبرنا كيف ستؤثر إزالة تسلسل الحاتمة من علامة GCE على وضع العلامات (ملف إضافي 1: الشكل S1i). بعبارة أخرى ، هل تسلسل ترميز رابط GGSG متبوعًا بـ TAG كافٍ لوضع العلامات البيولوجية المتعامدة على البروتينات القائمة على GCE؟ لم يتم الحصول على أي علامات محددة تقريبًا عند وضع علامات على α-tubulin بعلامة GCE التي تفتقر إلى تسلسل HA عن طريق مضان في الهلام وتصوير الخلايا الحية (الشكل 8d اللوحة السفلية والملف الإضافي 1: الشكل S6f). بالنسبة للبيروكسيسومات والإكسوسومات ، تم الحصول على تصنيف محدد ، وإن كان بمستويات منخفضة (الشكل 8 ب ، الألواح السفلية ج). في البيروكسيسومات ، كان وضع العلامات المختزل متسقًا مع التعبير المنخفض للبروتين الذي لوحظ بواسطة لطخة غربية (الشكل 8 أ ، ب ارتباطات بيرسون في اللوحة السفلية ، 0.76). لوحظ أيضًا تقليل وضع العلامات المحددة على Exo70 باستخدام مضان داخل الهلام (ملف إضافي 1: الشكل S6e) ، مما يزيد من احتمال أن تكون العلامات المخفضة التي لوحظت في الخلايا نتيجة للفشل في دمج ncAA أثناء الترجمة. لذلك ، في حالات محددة يكون فيها طول العلامة أمرًا بالغ الأهمية للحفاظ على وظيفة البروتين ، يمكن تقليل علامة GCE إلى ما لا يقل عن خمس بقايا. ومع ذلك ، فإن هذا يأتي على حساب كفاءة الوسم وبالتالي يجب اختباره على أساس كل حالة على حدة.


    مجموعة MGH COVID-19 ومشاركو فريق المعالجة

    فريق التحصيل: كيندال لافين-بارسونز 1 ، بلير باري 1 ، بريندان ليلي 1 ، كارل لودينشتاين 1 ، برينا مكيج 1 ، نيكول تشارلاند 1 ، هارجون خانا 1 ، جاستن مارغولين 1

    فريق المعالجة: آنا غوني 2 ، إيرينا جوشتيروفا 2 ، توم لاسال 2 ، نيهاريكا شارما 2 ، بريان سي روسو 3 ، ماريكارمن روجاس لوبيز 3 ، موشيه ساد فيلدمان 4 ، كاسيديت مانكونغريتشيب 4 ، جيسيكا تانتيفيت 4 ، مولي فيشر توماس 4

    اتحاد ماساتشوستس حول جاهزية مسببات الأمراض:Betelihem A. Abayneh 5، Patrick Allen 5، Diane Antille 5، Katrina Armstrong 5، Siobhan Boyce 5، Joan Braley 5، Karen Branch 5، Katherine Broderick 5، Julia Carney 5، Andrew Chan 5، Susan Davidson 5، Michael Dougan 5، ديفيد درو 5 ، آشلي إليمان 5 ، كيث فلاهيرتي 5 ، جين فلانيري 5 ، باميلا فوردي 5 ، إليز جيتينجز 5 ، أماندا جريفين 5 ، شيلا جريميل 5 ، كاثلين جرينك 5 ، كاثرين هول 5 ، ميج هيلي 5 ، ديبورا هينولت 5 ، جريس هولاند 5 ، شانتال كايتيسي 5 ، فلاستا لافال 5 ، يوتينج لو 5 ، سارة لوثرن 5 ، جوردان مارشوكا (شنايدر) 5 ، بريتاني مارتينو 5 ، روزان ماكنمارا 5 ، كريستيان نامبو 5 ، سوزان نيلسون 5 ، مارجوري نون 5 ، كريستين أومربورن 5 ، لويس كريس باتشيكو 5 ، نيكول فان 5 ، فاليشا إيه بورتو 5 ، إدوارد رايان 5 ، كاثلين سيليك 5 ، سو سلوغنهاوبت 5 ، كيمبرلي سميث شيبارد 5 ، إليزابيث سوسشانا 5 ، فيفين ويلسون 5 ، جاليت ألتر 6 ، أليخاندرو بالاز 6 ، جوليا بالز 6 ، ماكس بارباش 6 ، يانيك بارتش 6 ، جولي بوكاو 6 ، جوش شوفالييه 6 ، فاطمة شودري 6 ، كيفين إينكوف 6 ، جون فالون 6 ، ليز فيديركو 6 ، كيلسي فين 6 ، بيلار غارسيا برونكانو 6 ، سيبوترا هارتانا 6 ، تشينيانغ جيانغ 6 ، بولينا كابلونك 6 ، مارشال كاربيل 6 ، إيفان سي لام 6 ، كريستينا Lefteri 6، Xiaodong Lian 6، Mathias Lichterfeld 6، Daniel Lingwood 6، Hang Liu 6، Jinqing Liu 6، Natasha Ly 6، Ashlin Michell 6، Ilan Millstrom 6، Noah Miranda 6، Claire O'Callaghan 6، Matthew Osborn 6، Shiv بيلاي 6 ، يليزافيتا راسادكينا 6 ، ألكسندرا ريسيس 6 ، فرانسيس روزيكا 6 ، كيرا سايجر 6 ، ليبرا سيسا 6 ، كريستيان شار 6 ، سالي شين 6 ، نيشانت سينغ 6 ، ويوي صن 6 ، زياومينغ صن 6 ، هانا تيشيلي 6 ، أليجا تروشا- بيتشوكا 6 ، دانيال وورال 6 ، أليكس تشو 6 ، جورج دالي 7 ، ديفيد جولان 7 ، هوارد هيلر 7 ، أرلين شارب 7 ، نيكولاس جيلج 8 ، أليكس روزنتال 8 ، كولين وونغ 8

    1 قسم طب الطوارئ ، مستشفى ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية. 2 مركز السرطان بمستشفى ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية. 3 قسم الأمراض المعدية ، قسم الطب ، مستشفى ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية. 4 مركز مستشفى ماساتشوستس العام للمناعة والأمراض الالتهابية ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية. 5 مستشفى ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية. 6 معهد راغون في MGH ، MIT وهارفارد ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية. 7 كلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية. 8 بريجهام ومستشفى النساء ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.


    شاهد الفيديو: Predict a protein structure using AlphaFold within ChimeraX (كانون الثاني 2023).