معلومة

د 4. مواقع ربط الحمض النووي - علم الأحياء

د 4. مواقع ربط الحمض النووي - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

نظرًا لأنه يجب أن يتفاعل RNA polymerase في موقع المحفز لجميع الجينات ، فقد تتوقع أن يكون لجميع الجينات تسلسل نيوكليوتيد مماثل في منطقة المحفز. تم العثور على هذا ليكون صحيحًا لكل من الجينات بدائية النواة وحقيقية النواة. ومع ذلك ، قد تتوقع ألا تحتوي جميع عوامل النسخ على تسلسلات ربط DNA متطابقة. تسمى تسلسلات الحمض النووي في بداية موقع بدء الجين الذي يربط البروتين (بوليميريز الحمض النووي الريبي ، عوامل النسخ ، وما إلى ذلك) المحفزات. يوضح الجدول أدناه الشكل الشائع لتسلسل الحمض النووي المسمى بـ بريبنو أو صندوق تاتا تم العثور عليها في حوالي -10 أزواج قاعدية من موقع البداية ، وأخرى عند -35. ترتبط البروتينات بهذه المواقع وتسهل ربط بوليميريز الحمض النووي الريبي ، مما يؤدي إلى نسخ الجينات.

متواليات المروج بدائية النواة
المروجين-35 منطقةفاصل-10 منطقةفاصليبدأ RNA
أوبيرون trpتجاكاN17تاكتN7أ
tRNAtyrTTACAN16تاتجاتN7أ
λP2تجاكاN17جاتاكتN6جي
أوبرون لاكTTTACAN17TATGTTN6أ
تفصيل أTTGATAN16تاتاتN7أ
ليكس أتككاN17تاتاكتN6أ
T7A3تجاكاN17تاكجاتN7أ
إجماعتجاكاتاتات

تم العثور على تسلسل مماثل في حقيقيات النوى (إجماع TATAAA) يقع حوالي 25 نيوكليوتيد في المنبع من موقع بدء النسخ. يطلق عليه صندوق Goldstein-Hogness.

Jmol: محدث TATA Box Binding Protein Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

بالإضافة إلى ذلك ، في حقيقيات النوى ، ترتبط التسلسلات اللاحقة التي تسمى عناصر الاستجابة ببروتينات معينة (مثل بروتين CREB أو بروتين رابط لعنصر استجابة AMP الدوري) لمزيد من التحكم في النسخ الجيني.

عناصر الاستجابة حقيقية النواة (RE)

الوكيل التنظيمي

وحدة

إجماعربط الحمض النوويعاملالحجم (دالتون)
صدمة حراريةHSECNNGAANNTCCNNG27 بي بيHSTF93,000
الجلوكوكورتيكويدGREتجتاكااتجتكت20 نقطة أساسمستقبل94,000
الكادميومتعليم مخاطر الألغامكجنكككجنكنك.?.
Phorbol استرتريتجاكتكا22 بي بيAP139,000
مصلSRECCATATTAGG20 نقطة أساسSRF52,000
مضادات الأكسدةنكونجتجاكتكاجك
فرمون (فطر)ACAAAGGGA
نقص الأكسجةالتربية على حقوق الإنسان

CCACAGTGCATACGT

ججكتكاكاكاجتك

CTCTCCCTCCCATGCA

العامل المحرض لنقص الأكسجة826 أأ
مستقبلات البيروكسيسوم المنشط (PPAR)PPREaGG_CAAAGGT (CG)PPAR59,000
الستيرويد (العام) (البروجسترون ، والأندروجين ، والقشرانيات المعدنية ، والقشرانيات السكرية

AGAACAxxxACAAGA

(تكرار معكوس)

قاعدة بيانات محفزات حقيقيات النوى (EPD) - مجموعة مشروحة غير زائدة عن الحاجة لمروّجات POL II حقيقية النواة ، والتي تم تحديد موقع بدء النسخ لها تجريبيًا. رابط لمقال يصف EPD واستخدامه.

المروجين والمنتهين

بالإضافة إلى المحفزات ، هناك تسلسلات أخرى للحمض النووي بعيدة عن موقع بدء النسخ أكثر من المحفز القريب الذي يؤثر على نسخ الجينات. وتشمل هذه المعززات وكواتم الصوت والعوازل. يوضح الشكل أدناه كيف يمكن أن يؤثر المُحسِّن على نسخ الجينات عن طريق جلب الحمض النووي البعيد (ربما آلاف الأزواج الأساسية بعيدًا عن موقع بدء النسخ) بالقرب من محفز الجين. يمكن للمرء أن يتخيل بسهولة كيف يعمل كاتم الصوت بطريقة مماثلة.

الشكل: معززات النسخ

العوازل ضرورية لمنع المعزز (أو كاتم الصوت) من تنشيط (أو تثبيط) جين آخر قريب يجب أن يتأثر. وهي عبارة عن تسلسلات بين المُحسِّن (أو كاتم الصوت) والمُحفِّز أو جين أو مجموعة من الجينات. تحتوي عوازل حقيقية النواة على موقع نيوكليوتيد CCCTC الذي يربط البروتينات التي تسمى عوامل ربط CCCTC (CTCF).

يُظهر الشكل والتعليقات التوضيحية التالية ، التي أعيد طباعتها من Nature بإذن (كما هو موضح في الشكل) ، وصفًا أكثر تفصيلاً لوحدة نسخ حقيقية النواة تتحكم في نسخ الجينات.

الشكل: مروجي حقيقيات النوى والمناطق التنظيمية

أ. "وحدة نسخ حقيقية النواة بسيطة. محفز أساسي بسيط (TATA) ، تسلسل المنشط المنبع (UAS) وعنصر كاتم الصوت متباعدان في حدود 100200 نقطة أساس من صندوق TATA الموجود عادة في حقيقيات النوى أحادية الخلية".

ب. "وحدات تحكم نسخية معقدة من metazoan (تنتمي إلى مملكة Animalia). ترتيب معقد من وحدات مُحسِّن مجمعة متعددة تتخللها عناصر كاتم الصوت والعازل والتي يمكن أن تقع على بعد 1050 كيلو بايت إما في المنبع أو في اتجاه التيار لمُعزز أساسي مركب يحتوي على صندوق TATA (TATA) ) ، وتسلسلات البادئ (INR) ، وعناصر المروج المصب (DPE) ".

يُظهر الشكل والتعليق التالي ، المأخوذ مرة أخرى بإذن من Nature ، عرضًا أكثر تفصيلاً لجهاز النسخ العام متعدد الوحدات الفرعية ، بما في ذلك الوحدات الفرعية الخاصة بالأنسجة والانتقائية الجينية ومجمعات بدء النسخ.

الشكل: جهاز النسخ العام متعدد الوحدات حقيقية النواة

أ. "يمكن تقسيم جهاز النسخ حقيقية النواة إلى ثلاث فئات واسعة من المجموعات متعددة الوحدات التي تشمل المركب الأساسي RNA polymerase II وعوامل النسخ العامة المرتبطة (TFIIA ، -B ، -D ، -E ، -F و -H) ، متعدد - العوامل المساعدة للوحدات الفرعية (الوسيط ، CRSP ، TRAP ، ARC / DRIP ، وما إلى ذلك) ومجمعات تعديل الكروماتين المختلفة أو إعادة تشكيلها (SWI / SNF ، PBAF ، ACF ، NURF و RSF). "

ب ، ج. "طورت كائنات ميتازوان مجموعات متعددة انتقائية للجينات وأنسجة محددة تشبه TFIID باستخدام عوامل TAFs البديلة (TBP- [TATA Binding Protein) مثل TAF105 الخاص بالمبيض وكذلك TRFs (TBP- [TATA Binding Protein العوامل المرتبطة] العوامل ذات الصلة مثل TRF2 في ذبابة الفاكهة والفئران) للتوسط في تكوين مجمعات بدء بوليميريز RNA المتخصصة التي توجه نسخ برامج التعبير الخاصة بالأنسجة والانتقائية للجينات. " (مرجع الطبيعة في الشكل أعلاه) "

تنظيم الجينات في حقيقيات النوى

يمكن أن تتفاعل البروتينات على وجه التحديد مع الحمض النووي من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية والرابطة H والكارهة للماء. تحتوي أزواج قاعدة AT و GC على متبرعين ومتقبلين لسندات H متاحين يتم كشفهم في البستان الرئيسي والثانوي للحلزون ds DNA ، مما يسمح بتفاعلات معينة بين البروتين والحمض النووي.

الشكل: أزواج قاعدة AT و GC لها متبرعون ومقبلون متاحون لسندات H

جمول: برنامج تعليمي بسيط للحمض النووي محدث Jmol14 (جافا) | JSMol (HTML5) (انظر أزرار التحديد الأخيرة لرؤية المتبرعين والمقبولين لسندات H في البستان الرئيسي.

Jmol: تم تحديث RNA Polymerase II / DNA / RNA complex Jmol14 (جافا) | JSMol (HTML5)

النسخ الجيني وتحلل البروتين والدهون الغشائية

يوضح مثال مثير للاهتمام كيف يحافظ التحكم النسخي على توازن الدهون في الأغشية البيولوجية. الفسفوليبيدات والسفينجوليبيدات في الأغشية غير متجانسة للغاية ، بسبب تنوع مجموعات الرأس وتكوين سلسلة الأسيل. بالنظر إلى هذا التنوع الكبير ، من اللافت للنظر أن الخلايا المختلفة قادرة على الحفاظ على خصوصية أنواع الدهون في الخلايا المختلفة ، والأغشية المختلفة داخل الخلايا ، وداخل نشرة معينة من الغشاء (تذكر مناقشتنا لطوافات الدهون). كيف يمكن للخلية أن تنظم نوع الدهون التي تصنعها؟ ما الذي يتحكم في نسخ الجينات لتخليق الدهون؟

يبدو أن تنظيم نسخ هذه الجينات يتم التحكم فيه بواسطة بروتينات متعددة المجالات ترتبط بعناصر استجابة الستيرول في الحمض النووي. يتم تنشيط البروتينات ، التي تسمى بروتينات ربط عنصر استجابة ستيرول (SREBPs) عن طريق التحلل البروتيني لتحرير مجال عامل النسخ الذي يهاجر إلى النواة. يحدث تحلل بروتين SREBP في Golgi بواسطة البروتياز المقيم. يكون SREBP في Golgi معقدًا مع بروتين آخر ، وهو بروتين تنشيط الانقسام SREP (SCAP) ، والذي يسهل حركة SREBP إلى Golgi من موقع التوليف في الشبكة الإندوبلازمية. يحدث تنظيم الدهون عندما تمنع الأحماض الدهنية أو الكوليسترول أو مشتقات PL مثل فسفويثانولامين (من سيراميد) التنشيط التحلل للبروتين في SREBP. يعتمد التنظيم على ما إذا كانت SCAP "تنقل" SREBP إلى Golgi أم لا. يرتبط SCAP بـ SREP وينقله إلى غشاء Golgi ، ولكن فقط عندما تكون مستويات الستيرول منخفضة. عندما يكون الكوليسترول مرتفعًا ، فإنه يرتبط بمجال الغشاء في SCAP ويمنع SCAP من التفاعل مع SREP ونقله إلى Golgi.

يبدو أن أوكسين ، وهو هرمون نباتي رئيسي يحفز التعبير الجيني ، ينشط النسخ من خلال تحلل البروتين. عندما يرتبط بمستقبلاته السيتوبلازمية القابلة للذوبان ، بروتين يوبيكويتين ligase SCFTIR1 ، فإنه ينشط تحلل البروتين الذي يمنع النسخ.

Jmol: تم تحديث Auxin Receptor Jmol14 (جافا) | مستقبل JSMol (HTML5) Auxin


تحديد تسلسل الحمض النووي المرتبط بالبروتين في جين فول الصويا الذي ينظمه الأكسين

منطقة المروج لجين فول الصويا المستجيب لأوكسين ، GMAux28، لتحديد تسلسل الحمض النووي المرتبط بالبروتين الذي قد يكون متورطًا في تنظيم التعبير. باستخدام البصمة DNase I ومقايسات تحول الحركة الهلامية ، لوحظت مناطق متعددة من التفاعل ، بما في ذلك ثمانية مواقع ربط بروتين رئيسية ، في GMAux28 الجين. تم تحديد شكلين متسلسلين ، TGACGACA و TCCACGTGTC ، المرتبطين بعناصر as-1 / Hex و G-box ، على التوالي ، الموجودة في العديد من مروجي النباتات. تم تحديد أربعة مجالات متميزة من A / T-rich ، ويبدو أن مجالات A / T-rich تعدل ، ولكن ليس لتحديد ، التعبير عن العديد من الجينات. كما تم تحديد زخارف تسلسل جديدة ، دلتا -1 (D1) ودلتا -4 (D4). تشترك D1 و D4 في تسلسل أساسي مشابه جدًا ، TAGTxxCTGT و TAGTxCTGT ، على التوالي. في تحليلات التحول في حركة الهلام ، تظهر عناصر D1 و D4 تفاعلًا معقدًا لبروتينات الربط. ال جى ام ايه يو اكس 22 المروج يحتوي أيضًا على العناصر ذات الصلة بـ D1 والتي تتنافس مع GMAux28 عناصر. حددت مقارنات التسلسل تسلسلات شبيهة بـ D1 / D4 في العديد من الجينات الأخرى المستجيبة للأوكسين مما يشير إلى الأهمية المحتملة لـ D1 / D4 وبروتينات الربط المعنية في تنظيم التعبير عن هذه الجينات.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


خلفية

إصلاح الأضرار في الحمض النووي هو عملية خلوية أساسية تنظمها آلية جزيئية متخصصة. يبدأ مسار إصلاح استئصال القاعدة (BER) [1] لإصلاح الآفات الصغيرة بواسطة جليكوزيلات الدنا أحادية الوظيفة. تستخدم هذه الإنزيمات جزيء الماء كملف نووي لشق الرابطة N-glycosidic بين القاعدة المستهدفة و deoxyribose ، وإطلاق القاعدة التالفة وترك موقع apurinic / apyrimidinic (AP) [2]. يبدأ مسار BER لإزالة اليوراسيل (Ura) ، والذي ينشأ في الحمض النووي من نزع أمين السيتوزين (Cyt) أو دمج DUTP أثناء تخليق الحمض النووي ، بواسطة uracil-DNA glycosylases (UDGs) [3]. تنقسم UDGs إلى عائلات مختلفة بناءً على خصوصية الركيزة الخاصة بهم [4]. يشترك أفراد الأسرة I-V في هيكل وزخارف متشابهة. الأسرة الأولى UDGs ، والتي تُعرف أيضًا باسم UNGs ، على وجه التحديد تستأصل اليوراسيل من الحمض النووي أحادي الجديلة (ssDNA) والحمض النووي مزدوج الشريطة (سDNA) مع الأفضلية ssU & GT سU: G & GT سU: أ [5]. UNGs هي إنزيمات منتشرة في كل مكان تستخدم أشكالًا محفوظة بدرجة عالية لربط الحمض النووي والتعرف على اليوراسيل واستئصاله.

تم توضيح آلية التفاعل لـ UNGs من سلسلة من الدراسات الهيكلية الأنيقة التي تم فيها التقاط UNGs المتحولة من النوع البري وغير النشطة تحفيزيًا في شكل مرتبط بالحمض النووي في مراحل مختلفة من العمل [6-12]. لاكتشاف اليوراسيل في الحمض النووي ، تستخدم UNGs آلية "الضغط والسحب" ، والتي تتضمن عملية قلب قاعدة متعددة الخطوات. في الخطوة الأولى ، تؤدي بقايا السيرين والبرولين في ثلاث حلقات مختلفة ("حلقة Pro-rich" و "حلقة Gly-Ser" و "حلقة إقحام Leu") إلى انحناء طفيف للحمض النووي من خلال الضغط (" قرصة ') من العمود الفقري. في الخطوة الثانية ، تخترق بقايا الليوسين المحفوظة من "حلقة إقحام Leu" في الأخدود الصغير ويصبح الحمض النووي منثنيًا ومتشابكًا تمامًا مما يؤدي إلى قلب قاعدة اليوراسيل ("الدفع"). يتفاعل نوكليوتيد اليوراسيل مع "جيب التعرف على اليوراسيل" حيث يحدث انقسام في الرابطة الجليكوسيدية ، وفي الخطوة الأخيرة ، يتم سحب بقايا الليوسين ("سحب"). تم العثور على اثنين من البقايا التحفيزية ، حمض الأسبارتيك والحامض الأميني ، ثابتة في جميع UNGs (الجدول 1).

ومع ذلك ، فإن مجموعات UNG من فيروسات الجدري هي أفراد استثنائيون والأكثر تنوعًا في هذه العائلة. يتم حفظ الأشكال التي تستخدمها هذه الإنزيمات بشكل كامل في جميع فيروسات الأورثوبوكس ولكنها تختلف اختلافًا كبيرًا عن نظيراتها في الكائنات الحية الأخرى (ملف إضافي 1: الجدول S1) [4 ، 13-15]. والأهم من ذلك ، أن UNGs من فيروسات الجدري تلعب دورًا جديدًا وأساسيًا في تكاثر الفيروس وتعمل كمكون جوهري لآلية النسخ المتماثل. في اللقاح النموذجي لفيروس الجدري ، يرتبط UNG (المعروف باسم D4) ببروتين فيروسي آخر A20 لتشكيل عامل المعالجة غير المتجانسة. يرتبط A20 أيضًا ببوليميراز الحمض النووي E9 وبالتالي يربط D4 إلى E9 [15-20] ويجمع النواة غير المتجانسة (D4: A20: E9) لمركب البوليميراز المعالج. في غياب D4 ، يصنع Vaccinia E9 امتدادات قصيرة (& lt10 nucleotides) من الحمض النووي [18 ، 21]. هذا الدور الأساسي لـ D4 في دعم تخليق الحمض النووي لا يعتمد على نشاطه التحفيزي (glycosylase) [15].

تم الإبلاغ عن الهياكل البلورية لـ D4 في الشكل الحر [13 ، 22 2owr 1 , الحاشية 1 2owq ، 3 nt7 ، 4dof ، 4dog] وكمركب غير منتج 2 الحاشية السفلية 2 معقد اليوراسيل [14 4lzb]. يحتفظ الهيكل ثلاثي الأبعاد لـ D4 بالطي الكلي لبروتينات UNG - ورقة β متوازية ذات 4 خيوط مع حلزونات α على كلا الجانبين (الشكل 1). هناك ورقتان إضافيتان β في D4 (المخلفات 2-6 / 12-16 و107-109 / 215-217) لم يتم رؤيتها في أي UNG آخر (الأشكال 1 أ ، ب). على الرغم من اختلاف الأشكال الخاصة بـ UNG اختلافًا كبيرًا ، إلا أن بنية جيب ربط اليوراسيل في D4 تشبه بشكل ملحوظ مجموعات UNG الأخرى وخمسة من البقايا الستة التي تشكل الجيب متطابقة. تشتمل هذه المخلفات على الحفاز Asp68 و His181 ، والتي يتم وضعها بشكل مناسب لربط اليوراسيل وانقسام الرابطة الجليكوسيدية [14]. بالنظر إلى الخصائص الفريدة لـ UNGs لفيروس الجدري ، يجب أن يكون من المثير للاهتمام للغاية فهم كيفية تكيف هذه البروتينات مع استخدام الأشكال المتغيرة لربط الحمض النووي ، والتعرف على اليوراسيل واستئصاله.

هيكل D4. أ. الهيكل العام لـ D4. يوضح الرسم التخطيطي للرسوم المتحركة الهيكل ثلاثي الأبعاد لـ D4. الوحدات الفرعية A و B من هيكل D4 المجاني (4dof) يتم عرضها وتسميتها. يتم تلوين الشريط الطرفي C للورقة المركزية باللون الأخضر. الأوراق الإضافية التي تظهر في هياكل D4 هي بقايا أحماض أمينية أرجوانية ملونة تشكل الخيوط. العناصر الهيكلية التي تشارك في تفاعلات homodimer في هياكل D4 المختلفة مطلية باللون الأزرق والبنفسجي والأخضر. ب. مقارنة مع الإنسان UNG (هونج). يُظهر رسم الكارتون تراكب هيكل hUNG الخالي من الركيزة (1akz) بلون القمح و D4 (4dof الوحدة الفرعية أ) باللون السماوي. الطية الهيكلية العامة متشابهة جدًا لكل من البروتينات. الأوراق الإضافية N و C- في D4 ملونة داكنة. يتم تمييز طرفي N و C لـ D4. ج. A20 ملزم على D4. يُظهر الرسم الكرتوني موقع التجليد A20 على هيكل D4. هيكل D4 (4dof، الوحدة الفرعية A ، سماوي) على السلسلة D4 A من مجمع D4: A20 (4od8 ، أصفر). مقطع A20 من 4od8 يظهر بلون القمح. تلعب بقايا الأحماض الأمينية Arg167 و Pro173 من D4 و Trp43 و Lys44 of A20 دورًا مهمًا في الربط. تظهر هذه البقايا كنماذج لاصقة. يتم تمييز النهايتين N و C من A20

تتميز جميع الهياكل البلورية لـ free-D4 وهيكل مجمع uracil بتغليف ثنائي الأبعاد مميز. على الرغم من أن تفاعلات البروتين البروتين المحددة بين الوحدات الفرعية D4 تختلف إلى حد ما ، فإن الواجهة البينية متشابهة جدًا في هذه الهياكل [13 ، 14 ، 22]. تتكون واجهة homodimer هذه من البقايا الموجودة في الطرف C- حبلا من الصفيحة المركزية في كل وحدة فرعية ، حلقة مرنة / حلزون قصير (بقايا 161-173) ولولب طويل (187-206) يقع بالقرب من C- المحطة. يمثل الموقع الأول ، الذي يقع في حلقة تربط بين جديلة C- طرفي ، أحد أكثر المناطق مرونة في الهياكل D4 (الشكل 1 أ). عند التركيز العالي للبروتين ، تستخدم D4 نفس الواجهة لثنائي المحلول. ومع ذلك ، عندما يكون A20 موجودًا ، يؤدي التفاعل المحدد جدًا على هذا السطح إلى تكوين D4: A20 heterodimer (الشكل 1 ج) [19 ، 20]. تشير الدلائل الهيكلية والكيميائية الحيوية التراكمية إلى أنه في معقد بوليميريز الدنا المعالَج ، يظل D4 نشطًا تحفيزيًا وربما يمسح ويزيل اليوراسيل باستمرار من الدنا المركب حديثًا [18-20]. تم الإبلاغ عن تفاصيل قدرة D4 على ربط وفحص الحمض النووي ووظيفته الأنزيمية وخصوصية الركيزة [22 ، 23]. ومع ذلك ، فإن التوصيف الهيكلي لموقع (مواقع) ربط الحمض النووي على D4 مفقود.

هنا ، أبلغنا عن أول عرض تفصيلي لتفاعلات D4-DNA من بنية بلورية لـ D4 في معقد مع غير محدد غير تالف سالحمض النووي. يكشف هيكل هذا المركب لأول مرة عن تفاعلات ربط الحمض النووي بواسطة UNG من عائلة فيروس الجدري. كما أنه يمثل أول هيكل ثلاثي الأبعاد لـ UNG مرتبط إلى غير تالف حقًا سDNA ويوفر لقطة تمثيلية للتفاعل الأولي بين UNG و DNA. نقدم أيضًا مقارنة بنيوية بين D4 و UNG البشري (hUNG) حيث تتوفر الهياكل البلورية في حالة خالية من الحمض النووي ، وفي معقدة مع الحمض النووي المحتوي على اليوراسيل ومعقدة مع الحمض النووي الذي يحتوي على موقع أساسي [6-8 ، 10 ].


جون وايز

تعطي الأساليب الحسابية الحديثة نظرة ثاقبة جديدة في بنية ووظيفة البروتينات والإنزيمات. فيما يلي مثالين على المخرجات المرئية من هذه الأساليب الحسابية.

اللوحة اليسرى:نموذج قصير من الببتيد تم تعديله في بقايا السيستين باستخدام مسبار نيتروكسيد الجذور الحرة المستقر. تسمح تعديلات البروتين مثل هذا بتحديد تفاصيل بنية البروتين ووظيفته.

اللوحة اليمنى:مسبار آخر منمذجة الجذور الحرة. يظهر العمود الفقري للببتيد كخط أرجواني. تظهر البقايا بألوان مشفرة لكل نوع ذرة (أزرق داكن = نيتروجين ، أزرق فاتح = كربون ، أحمر = أكسجين ، أبيض = هيدروجين ، أصفر = كبريت).

اللوحة اليسرى:نموذج لبروتين تحكم نسخي مرتبط بتسلسل ربط الحمض النووي المحدد الخاص به. تفاعلات الحمض النووي للبروتين مثل هذه هي نقطة البداية الشائعة للتحكم في التعبير الجيني. تم تحديد هذا الهيكل لبروتين 434 Cro المركب مع 20 زوجًا أساسيًا من قطعة الحمض النووي التي تحتوي على مشغلها OR1 بواسطة A.Mondragon & amp S.C Harison (رمز الوصول إلى بنك بيانات البروتين 3cro). يظهر التركيب الثانوي للبروتين بشكل تخطيطي باللون الرمادي تظهر خيوط الحمض النووي المزدوجة بألوان مشفرة لكل نوع ذرة (انظر اللوحة اليسرى - برتقالي = فوسفور).

اللوحة اليمنى:نموذج لمضخة مقاومة للأدوية المتعددة من البشر يظهر تضاربًا صارمًا بين الركيزة والدواء. هذه البروتينات مهمة في العلاج الكيميائي للسرطان والفيروسات. تُظهر القضبان الأرجوانية والأشرطة الصفراء الإنزيم وتظهر جزيئات الدواء والركيزة مع كرات فان دير وال.

منشورات مختارة

هورنونج ، ت. ، فولكوف ، أو. ، زايدة ، ت. & ldquo هيكل الجزء العصاري الخلوي للوحدة الفرعية b-Dimer من Escherichia coli FoF1-ATP Synthase & rdquo (2008) بيوفيز. ج. 94, 5053-5064

وايز ، ج. و Vogel ، P.D. & ldquo يمكن أن تشكل الوحدة الفرعية b dimer من Escherichia coli ATP synthase ملفات ملفوفة أعسر و rdquo (2008) فيزياء حيوية J. 94, 5040-5052

Hossann، M.، Li، Z.، Shi، Y.، Kreilinger، U.، Blattner، J.، Vogel، P.D.، Yuan، J.M.، Wise، J.G.، Trommer، W.E. (2006) & ldquoNovel Immunotoxin: بروتين اندماج يتكون من الجيلونين وجزء من مستقبلات الأسيتيل كولين كعامل علاجي مناعي محتمل لعلاج الوهن العضلي الوبيل rdquo ، تعبير البروتين وتنقية 46 ، 73-84.

Motz C، Hornung T، Kersten M، McLachlin DT، Dunn SD، Wise JG، Vogel PD (2004) & ldquo الوحدة الفرعية b dimer لـ FoF1-ATP synthase: التفاعل مع F1-ATPase كما يستنتج عن طريق وضع العلامات الدورانية الخاصة بالموقع و rdquo ، J بيول. تشيم. 279 ، 49074-81.

Guo و C. و Li و Z. و Shi و Y. و Xu و M. توكسين الجيلونين و rdquo ، تعبير البروتين وتنقيته 37 ، 361-367.

Fromknecht، K.، Vogel، P. and Wise، J.G. (2003) & ldquo إعادة التصميم التوافقي لخصوصية ربط الحمض النووي لقمع اللولب النسيجي-Turn-Helix Repressor & rdquo، J. Bacteriology 185، 475-81

Guhr، P.، Neuhofen، S.، Coan، C.، Wise، J.G.، and Vogel، PD، (2002) & ldquoNew Aspects on the Mechanism of GroEL-Assisted Protein Folding & rdquo، Biochim. بيوفيز. اكتا 1596 ، 326-335

Chelius، D.، Loeb-Hennard، C.، Fleischer، S.، McIntyre، JO، Marks، AR، De، S.، Hahn، S.، Jehl، MM، Moeller، J.، Philipp، R.، Wise ، JG & أمبير ترومر ، W.E. (2000) & ldquo تنشيط فوسفاتيديل كولين لقلب الإنسان (R) -3 طفرات هيدروكسي بوتيرات ديهيدروجينيز التي تفتقر إلى sulfhydryls المركز النشط: الطفرات الموجهة بالموقع لبروتين اندماج جديد مؤتلف rdquo ، الكيمياء الحيوية 39 ، 9687-9697.

Kersten ، M.V. ، Dunn ، S.D. ، Wise ، J.G. ، and Vogel ، P.D. & ldquo يؤدي وضع الملصقات الدوارة الموجهة من الموقع للمواقع التحفيزية إلى الحصول على نظرة ثاقبة لبنية F1-ATP Synthase من الإشريكية القولونية& rdquo، (2000) الكيمياء الحيوية 39، 3856-3860.

فوجل ، بي. و Wise J.G. & ldquoStudienbrief Technik in der Medizin: Gentechnische Arbeitsmethoden & rdquo، (1999) Zentrum f & uumlr Fernstudien & amp Universit & aumlre Weiterbildung، Universit & aumlt Kaiserslautern

Loesel ، RM ، Wise ، J.G. و Vogel ، P.D. (1997) & ldquo عدم التناسق في المواقع التحفيزية ولكن ليس في المواقع غير التحفيزية في الإشريكية القولونية F1-ATPase & rdquo ، الكيمياء الحيوية 36 ، 1188-1193

Schanding ، T. ، Vogel ، P.D. ، Trommer ، W.E. وحكيم ، ج. (1996) & ldquo توليف مشتق سيكلوهيكسيل كاربودييميد حساس للأس الهيدروجيني لتدوير تفاعلات البروتونات في إنزيمات ضخ البروتون و rdquo ، رباعي السطوح 52 ، 5783-5792

مقالات عن التطور وقيمة العلم كتبها أو شاركت في تأليفها

من أخبار دالاس الصباح:

"التحدث ضد التصميم الذكي" 5 أبريل 2007

من جريدة SMU DAILY CAMPUS:

"التصميم الذكي ليس علمًا: لماذا يهم هذا" 4 مايو 2007

"مطالبات الهوية لا تصمد" 26 أبريل 2007

"رسالة إلى المحرر - تكتيكات خادعة من معهد الاكتشاف" 25 أبريل 2007


طرق الكشف عن تفاعلات البروتين والحمض النووي

يمكن استخدام طريقة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) لمراقبة تنظيم النسخ من خلال تعديل هيستون (علم التخلق) أو تفاعلات ارتباط عامل النسخ والحمض النووي. تسمح طريقة اختبار ChIP بتحليل تفاعلات الحمض النووي والبروتين في الخلايا الحية عن طريق معالجة الخلايا بالفورمالديهايد أو الكواشف المتشابكة الأخرى من أجل تثبيت التفاعلات من أجل التنقية والكشف عن المصب. يتطلب إجراء فحوصات ChIP معرفة البروتين المستهدف وتسلسل الحمض النووي الذي سيتم تحليله ، حيث يجب على الباحثين توفير الجسم المضاد ضد البروتين محل الاهتمام وبادئات PCR لتسلسل الحمض النووي محل الاهتمام. يتم استخدام الجسم المضاد لترسيب مركب البروتين - DNA بشكل انتقائي من شظايا DNA الجينومية الأخرى ومجمعات البروتين - DNA. تسمح البادئات PCR بتضخيم محدد واكتشاف تسلسل الحمض النووي المستهدف. تسمح تقنية PCR الكمية (qPCR) بتحديد كمية تسلسل الحمض النووي المستهدف. يعتبر اختبار ChIP قابلاً للتنسيقات القائمة على الصفيف (ChIP-on-chip) أو التسلسل المباشر للحمض النووي الذي تم التقاطه بواسطة البروتين المناعي (ChIP-seq).

  • التقاط لقطة لبروتين معين - DNA
    التفاعلات كما تحدث في الخلايا الحية
  • الكمي عندما يقترن بتحليل qPCR
  • القدرة على تشكيل محفز للبروتينات المختلفة
  • يحتاج الباحث إلى مصدر أجسام مضادة من فئة ChIP
  • يتطلب تصميم بادئات محددة
  • يصعب تكييفها للفحص عالي الإنتاجية

دليل خطوة بخطوة لفحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) الناجحة

تتضمن هذه النظرة العامة المحدثة لإجراء ChIP تفاصيل إضافية حول اختيار الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها بواسطة ChIP). تصف مذكرة التطبيق أيضًا وتقدم أمثلة على الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) كأسلوب لدراسة علم التخلق ، حيث تتيح للباحثين التقاط لقطة لتفاعلات معينة بين البروتين والحمض النووي.

يوفر كتيبنا الفني للتفاعل البروتيني المكون من 72 صفحة بروتوكولات ومعلومات تقنية ومعلومات عن المنتج للمساعدة في تحقيق أقصى قدر من النتائج لدراسات تفاعل البروتين. يوفر الكتيب معلومات أساسية وتلميحات مفيدة ونصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمقايسات الترسيب المناعي ومقايسات الترسيب المناعي المشترك ، والمقايسات المنسدلة ، والنشاف والتشابك في أقصى الغرب. يحتوي الكتيب أيضًا على قسم موسع حول طرق دراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي ، بما في ذلك ChIP و EMSA و RNA EMSA. يعتبر الكتيب مصدرًا أساسيًا لأي مختبر يدرس تفاعلات البروتين.

تتضمن المحتويات: مقدمة في تفاعلات البروتين ، مقايسات الترسيب المناعي المشترك ، المقايسات المنسدلة ، النشاف الغربي الأقصى ، رسم خرائط تفاعل البروتين ، مقايسات مراسلة الخميرة ثنائية الهجين ، فحوصات تحول الحركة الكهربية [EMSA] ، فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، البروتين - يقارن الحمض النووي ، وأكثر من ذلك.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات

يتم استخدام مقايسة تحول الحركة الكهربية للحمض النووي (EMSA) لدراسة البروتينات المرتبطة بتحقيقات أليغنوكليوتيد الحمض النووي المعروفة ويمكن استخدامها لتقييم درجة التقارب أو خصوصية التفاعل. تعتمد هذه التقنية على ملاحظة مفادها أن معقدات البروتين والحمض النووي تهاجر بشكل أبطأ من جزيئات الدنا الحرة عند تعريضها إلى بولي أكريلاميد غير مسبب للتحول أو الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز. نظرًا لأن معدل هجرة الحمض النووي يتحول أو يتأخر عند ارتباط البروتين ، يُشار أيضًا إلى الفحص على أنه تحول هلام أو مقايسة تأخر الهلام. تؤدي إضافة جسم مضاد خاص بالبروتين إلى مكونات الارتباط إلى إنشاء معقد أكبر (جسم مضاد - بروتين - دنا) ، والذي ينتقل بشكل أبطأ أثناء الرحلان الكهربي. يُعرف هذا باسم "التحول الفائق" ، ويمكن استخدامه لتأكيد هويات البروتين. حتى ظهور EMSA ، تمت دراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي بشكل أساسي عن طريق مقايسات ربط مرشح النيتروسليلوز باستخدام مجسات ذات علامات إشعاعية.

  • الكشف عن بروتينات ربط الحمض النووي منخفضة الوفرة من المحللات
  • اختبار طفرات موقع الربط باستخدام العديد من تكوينات المسبار مع نفس المحللة
  • اختبار تقارب ملزمة من خلال تحليل طفرات مسبار الحمض النووي
  • إمسا غير المشعة ممكن باستخدام تحقيقات الحمض النووي المسمى بيوتينيلات أو الفلورسنت
  • تحليل تفاعلات البروتين والحمض النووي في المختبر
  • يصعب قياسها
  • تحتاج إلى إجراء اختبار الانزياح الفائق مع الجسم المضاد للتأكد من هوية البروتين في المجمع

تقليديا ، تم تمييز مجسات الحمض النووي إشعاعيًا بـ ³²P من خلال دمج [γ-³²P] dNTP خلال تفاعل 3 'ملء باستخدام جزء Klenow أو بعلامة 5' باستخدام [γ-³²P] ATP و T4 polynucleotide kinase. بعد الرحلان الكهربائي ، يتعرض الجل لفيلم الأشعة السينية لتوثيق النتائج. مجموعة EMSA Thermo Scientific LightShift Chemiluminescent EMSA عبارة عن اختبار غير مشع يوفر أداءً قويًا وحساسًا. تشتمل المجموعة على كواشف لإعداد وتخصيص تفاعلات ربط الحمض النووي ، ومجموعة تحكم من الحمض النووي ومستخلص البروتين لاختبار نظام المجموعة ، واستقرار الستربتافيدين- HRP المتقارن للتحقق من هدف الحمض النووي المرتبط بالبيوتين ، ووحدة ركيزة مضيئة كيميائيًا بشكل استثنائي للكشف.

إنزيم EMSA الكيميائي الإشعاعي المكون من أربعة مجمعات مختلفة من الحمض النووي والبروتين. تراوحت أحجام الدوبلكس المستهدفة التي تحمل علامة البيوتين من 21 إلى 25 زوجًا قاعديًا. تم اشتقاق عوامل النسخ Oct-1 و AP1 و NF-B من مستخلص هيلا النووي. يتم توفير مستخلص EBNA-1 كعنصر تحكم في LightShift Chemiluminescent EMSA Kit. كانت سلاسل المنافسين المحددة غير المصنفة (عند استخدامها) موجودة عند زيادة 200 ضعف عن الهدف المحدد. تراوحت أوقات التعرض لأفلام الأشعة السينية لكل نظام من دقيقتين لـ EBNA و Oct-1 و AP1 و 5 دقائق لـ NF-B.


& ltp> يوفر هذا القسم أي معلومات مفيدة حول البروتين ، ومعظمها معلومات بيولوجية. & ltp> & lta href = '/ help / function_section' target = '_ top'> المزيد. & lt / a> & lt / p> الوظيفة i

البروتين ، الذي يشارك في إصلاح الحمض النووي وانتشار البروتين ، كجزء من مجمع UV-DDB ومجمعات DCX (DDB1-CUL4-X-box) ، على التوالي (PubMed: 10882109 ، PubMed: 11278856 ، PubMed: 11705987 ، PubMed: 9892649، PubMed: 12732143، PubMed: 15882621، PubMed: 16473935، PubMed: 18593899).

المكون الأساسي لمركب UV-DDB (مركب بروتين رابط للحمض النووي المتضرر من الأشعة فوق البنفسجية) ، وهو مركب يتعرف على تلف الحمض النووي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ويجند بروتينات مسار إصلاح ختان النوكليوتيدات (مسار NER) لبدء إصلاح الحمض النووي (PubMed: 10882109) ، PubMed: 11278856، PubMed: 11705987، PubMed: 16260596، PubMed: 12944386، PubMed: 14751237).

يرتبط مجمع UV-DDB بشكل تفضيلي بثنائي سيكلوبوتان بيريميدين (CPD) ، و 6-4 منتجات ضوئية (6-4 PP) ، ومواقع أبورينية وعدم تطابق قصير (PubMed: 10882109 ، PubMed: 11278856 ، PubMed: 11705987 ، PubMed: 16260596 ، PubMed: 12944386).

يعمل أيضًا كوحدة التعرف على الركيزة لـ DCX (DDB2-CUL4-X-box) E3 ubiquitin-protein ligase complex DDB2-CUL4-ROC1 (المعروف أيضًا باسم CUL4-DDB-ROC1 و CUL4-DDB-RBX1) (PubMed: 12732143 ، PubMed: 15882621، PubMed: 16473935، PubMed: 18593899، PubMed: 26572825).

قد يحتوي مجمع DDB2-CUL4-ROC1 على هيستون H2A وهيستون H3 وهيستون H4 في مواقع تلف الحمض النووي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية (PubMed: 16678110، PubMed: 16473935).

قد يؤدي انتشار الهستونات في كل مكان إلى تسهيل إزالتها من النواة وتعزيز إصلاح الحمض النووي اللاحق (PubMed: 16678110، PubMed: 16473935).

يحتوي مجمع DDB2-CUL4-ROC1 أيضًا على XPC في كل مكان ، مما قد يعزز ارتباط الحمض النووي بواسطة XPC ويعزز NER (PubMed: 15882621).

يتواجد مجمع DDB2-CUL4-ROC1 أيضًا في كل مكان KAT7 / HBO1 استجابةً لتلف الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تدهوره: يتعرف على KAT7 / HBO1 بعد الفسفرة بواسطة ATR (PubMed: 26572825).

& # xd & ltp> معلومات منظمة يدويًا والتي يوجد لها أدلة تجريبية منشورة. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / Evidences # ECO: 0000269"> المزيد. & lt / a> & lt / p> & # xd تأكيد يدوي استنادًا إلى التجربة في i


وضع العلامات والكشف

إذا تم استخدام كميات كبيرة من الحمض النووي في تفاعلات EMSA ، فيمكن تصور نطاقات الحمض النووي عن طريق تلطيخ بروميد الإيثيديوم أو بقع الحمض النووي الفلورية الأخرى. ومع ذلك ، يمكن أيضًا أن يصبح الحمض النووي الناقل وغير المحدد المنافس المستخدم في معظم تفاعلات ربط EMSA ملطخًا ويسبب إشارة خلفية عالية. تتطلب طريقة الكشف هذه أيضًا الكثير من الحمض النووي ، حيث يكون من الأفضل عادةً (والاقتصادي) استخدام تركيزات منخفضة من الحمض النووي في تفاعلات الربط من أجل الحد من الارتباط غير المحدد. وبالتالي ، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا هي تسمية المسبار قبل إجراء التجربة للسماح باكتشافه المحدد بعد الرحلان الكهربي. تقليديا ، تم تمييز مجسات الحمض النووي إشعاعيًا بـ ³²P من خلال دمج [γ-³²P] dNTP خلال تفاعل 3 'ملء باستخدام جزء Klenow أو بعلامة 5' باستخدام [γ-³²P] ATP و T4 polynucleotide kinase. بعد الرحلان الكهربائي ، يتعرض الجل لفيلم الأشعة السينية لتوثيق النتائج.

انتقلت العديد من المعامل إلى أنظمة الكشف البديلة EMSA بسبب النفقات والمخاوف التنظيمية المرتبطة بالنشاط الإشعاعي. نظرًا لأن dNTPs متوفرة معدلة باستخدام haptens (على سبيل المثال ، البيوتين والديجوكسيجينين) أو الأصباغ الفلورية ، فهناك العديد من الطرق غير المشعة لأداء EMSA. يمكن الكشف عن مجسات الفلورسنت في هلام بمساعدة نظام التصوير المناسب ، ولكن هذه الطريقة لم تكن شائعة جدًا حتى الآن لأن الأدوات باهظة الثمن مطلوبة وحساسيتها لا تقارن بعد بالمسابير المشعة.

يمكن تصور مجسات الحمض النووي المعدلة بواسطة كواشف الكشف الثانوية مثل الستربتافيدين أو الأجسام المضادة لـ DIG في الأنظمة ذات الركائز الأنزيمية المماثلة لتلك المستخدمة في النشاف الغربي. الخطوة الإضافية الوحيدة المطلوبة لهذه الطريقة هي نقل عينات البروتين والحمض النووي المفصولة إلى دعامة غشاء مناسبة. عند استخدامه مع ركيزة مناسبة ، يكون نظام البيوتين-ستربتافيدين قويًا للغاية ويمكن تحسينه لتحقيق حدود الكشف المساوية لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام المجسات المشعة. من المهم ملاحظة أن إجراء فحوصات النشاف هذه باستخدام النيوكليوتيدات يتطلب استخدام أغشية موجبة الشحنة من أجل التقاط وتثبيت شظايا الحمض النووي الصغيرة. على الرغم من أن هذا النوع من الأغشية يمثل بعض التحديات التقنية المتعلقة بالحجب والربط غير المحدد ، إلا أنه يمكن التغلب عليها باستخدام مجموعات محسّنة. على سبيل المثال ، تم تحسين Thermo Scientific Pierce RNA 3 'End Biotinylation Kit من أجل وضع العلامات على النهاية الطرفية المكونة من 3 أجزاء من تحقيقات RNA لتسهيل استخدامها كمجسات أو أهداف في EMSA وطرق أخرى لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي.

3 'نهاية وضع العلامات من الحمض النووي الريبي. يحفز T4 RNA ligase ربط 3’-OH من الحمض النووي الريبي مع ثنائي فوسفات السيتدين الحيوي من مجموعة Pierce RNA 3 'End Biotinylation. يسمح ملصق البيوتين هذا بالكشف عن بروتينات أفادين. ينتج عن استخدام هذه المجموعة وضع العلامات النهائية 3 لمجسات RNA.


شاهد الفيديو: تركیب الحمض النووي DNA وتضاعفھ. الأحیاء. علوم الأحیاء والبیئة (شهر فبراير 2023).