معلومة

هل يمكنني استخدام المخزن المؤقت PCR بدلاً من المخزن المؤقت لتوليف (كدنا)؟

هل يمكنني استخدام المخزن المؤقت PCR بدلاً من المخزن المؤقت لتوليف (كدنا)؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أستخدم مجموعة تخليق Fermentase First strand (كدنا) لكن المخزن المؤقت الخاص بها قد انتهى. أحتاج إلى العمل اليوم ولكن لا يمكنني الوصول إلى أي مصدر في الوقت الحالي. لدي عازلة PCR في المختبر. هل يمكنني استخدام المخزن المؤقت PCR بدلاً من المخزن المؤقت لتوليف (كدنا)؟ ما هي اقتراحاتك الأخرى؟ شكرا لك


تحتوي هذه الصفحة على وصفة لـ 10X M-MuLV RT buffer:

  • 500 ملي تريس- HCl
  • 750 ملي بوكل
  • 30 ملي MgCl2
  • 100 مم DTT
  • 8.3 درجة الحموضة

إذا كان لديك الكواشف الأساسية ، أقترح صنع ذلك.


الأسئلة المتداولة حول عزل الحويصلة خارج الخلية

توفر مجموعة عزل الحويصلة خارج الخلية Capturem حلاً كاملاً للعزل البسيط والسريع للحويصلات خارج الخلية (EVs على سبيل المثال ، exosomes) من مختلف السوائل البيولوجية ، مثل البلازما والمصل والبول والحليب واللعاب والوسائط المكيفة بالخلايا والسائل النخاعي . نحن نقدم حجمين من الطقم وتنسيقات mdashmini و maxi و mdash حتى تتمكن من تنقية EVs من مجموعة من أحجام العينات.

لأية أسئلة لم تتم الإجابة عليها أدناه ، يرجى الاطلاع على أدلة المستخدم والمستندات الأخرى التي يمكن الوصول إليها من خلال جدول المنتج في هذه الصفحة. يرجى الاتصال بنا إذا لم تتمكن من العثور على إجابة لسؤالك.

ما هو مركب الربط المستخدم في أعمدة Capturem EV؟

تحتوي أعمدة الدوران Capturem EV على أغشية وظيفية باستخدام ركيزة قائمة على الليكتين تربط الحويصلات خارج الخلية.

كيف تختلف طريقة Capturem EV عن عزل EV باستخدام تنبيذ فائق؟

  • يعمل جهاز التنبيذ الفائق على فصل الجسيمات وفقًا للكثافة. لذلك ، فإنه يعزل مجموعة مختلطة من الحويصلات ذات الأحجام المختلفة ، جنبًا إلى جنب مع الملوثات غير EV ، مثل البروتينات مثل الألبومين. نظرًا للسرعة العالية ، تكون هذه العملية قاسية جدًا وغالبًا ما تلحق الضرر بالمركبات الكهربائية.
  • تقوم مجموعة عزل الحويصلة خارج الخلية Capturem بعزل المركبات الكهربائية التي يقل قطرها عن 200 نانومتر. العملية لطيفة ، وتبقى المركبات الكهربائية سليمة لتطبيقات المصب مثل الفحص المجهري الإلكتروني.

لماذا يكون تركيز البروتين الكلي أقل مع طقم عزل الحويصلة خارج الخلية من Capturem مقارنةً بالطرد المركزي الفائق؟

توفر أعمدة Capturem EV عينة EV عالية النقاء خالية من البروتينات الملوثة. ينتج عن التنبيذ الفائق عينة تحتوي على شوائب ، مثل الألبومين. لذلك ، سيعطي التنبيذ الفائق تركيزًا إجماليًا أعلى للبروتين بسبب هذه الشوائب.

هل يمكنني استخدام العينة المنقاة مباشرة لتطبيقات المصب الخاصة بي؟

تقوم مجموعتنا بإزالة المركبات الكهربائية باستخدام محلول فوسفاتي يحتوي على أملاح عضوية. يمكن استخدام الجسيمات المخففة مباشرة لتحليل الجسيمات الفيزيائية ، مثل تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ووضع العلامات على فحوصات الامتصاص الخلوي. إذا كان تطبيق المصب الخاص بك يتضمن استخراج البروتين و / أو الحمض النووي الريبي ، فسيكون من الضروري صوتنة أو تحلية العينات المزلقة أولاً.

هل يمكنني استخدام محلول شطف مختلف؟

نعم ، يمكنك استخدام شطف تنافسي باستخدام عازلة مانوز أو جلوكوز. ومع ذلك ، سيؤدي ذلك إلى خفض عائد EV الخاص بك ، وستحتاج إلى تحديد ما إذا كانت هذه المخازن المؤقتة متوافقة مع تطبيقات المصب.

تنتج الحويصلة خارج الخلية مع مخازن شطف مختلفة. تم عزل الحويصلات خارج الخلية من نفس الكمية من البلازما (200 & microl) باستخدام أعمدة عزل الحويصلات خارج الخلوية Capturem (صغيرة). تمت التصفية التتابعية للمحتويات باستخدام 100 ميكرول من 1) 200 ملي ميثيل وألفا- D- مانوبيرانوسيد في 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 2) 1 مولار جلوكوز في 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، أو 3) محلول شطف Capturem EV. اللوحة أ. تم استخدام NTA لتقييم تركيز وحجم توزيع المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها مع ظروف الشطف المختلفة. اللوحة B. العائد الإجمالي (إجمالي عدد المركبات الكهربائية) من 200 وميكرو بلازما هو الأعلى باستخدام Elution Buffer المزود مع المجموعة.

هل يمكنني صوت المركبات الكهربائية المنقاة لتحليل اللطخة الغربية؟

نعم فعلا. نصن عيناتنا عند 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز صوتي مائي (منظف بالموجات فوق الصوتية ، JSP). إذا كنت تستخدم جهاز صوتي مختلف ، فقد يتطلب الأمر تحسينًا.

كيف يمكنني تحلية عينات المركبات الكهربائية المنقاة؟

نوصي بالخطوات التالية:

  1. قم بتحميل العينة الكاملة التي تم الحصول عليها باستخدام المجموعة المصغرة (أو 500 وميكروول من العينة التي تم الحصول عليها باستخدام مجموعة maxi) على وحدة مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra-0.5 (إما 3-kDa أو 10-kDa MWCO ، التي يوفرها المستخدم). إذا كان حجم العينة أقل من 500 وميكرول ، أضف الماء إلى وحدة الفلتر لرفع الحجم إلى 500 وماكرول. الطرد المركزي في 14000ز لمدة 5 و ndash30 دقيقة وتجاهل التدفق.
  2. أضف الماء إلى وحدة التصفية حتى يصل حجم الصوت إلى 500 ومايكرول وجهاز الطرد المركزي عند 14000ز لمدة 5 و - 30 دقيقة.
  3. نقل retentate (العينة في المرشح) إلى أنبوب جمع 2 مل جديد (المقدمة من قبل المستخدم).
  4. بالنسبة للعينة التي تم الحصول عليها باستخدام مجموعة maxi ، كرر الخطوتين 1 و ndash3 مع 500 و microl المتبقية من العينة.

ما مقدار البروتين والحمض النووي الريبي الذي يمكنني توقع تنقيته من عينات المركبات الكهربائية؟

يمكن أن يختلف هذا الرقم وفقًا لنوع عينة الإدخال وحجمها وشروطها. في تجربتنا ، بالنسبة للمركبات الكهربائية المستعادة من 1 مل من البلازما ، أنتجت حوالي 1 نانوغرام من الحمض النووي الريبي و 5 ميكروغرام من البروتين من حمولة المركبات الكهربائية.

كيف تقارن قيمة EV من عمود maxi بالعائد من العمود المصغر؟

من 1 مل من البلازما ، يعطي عمود Capturem EV maxi إنتاجية EV أكبر 10 مرات من العمود الصغير. بأقصى سعته ، يعطي عمود Capturem EV maxi إنتاجية EV (إجمالي عدد المركبات الكهربائية) يبلغ

ما هو الغرض من عمود المقاصة المسبقة؟

يزيل عمود التنظيف المسبق أي شظايا غشائية كبيرة وأجسام موت الخلايا المبرمج وشظايا خلية أصغر وما إلى ذلك ، والتي من شأنها أن تسد عمود Capturem وتمنع عزل EV.

ما هو الغرض من وحدة مرشح أميكون ، ولماذا هي مطلوبة؟

تزيل وحدة التصفية مجاميع البروتين غير المحددة ، والبروتينات الدهنية ، والسيتوكينات ، وما إلى ذلك ، مما ينتج عنه مركبات كهربائية ذات نقاء أعلى كما تم قياسه بواسطة تحليل تتبع الجسيمات النانوية الفلورية.

عند استخدام المجموعة المصغرة ، أي مرشح Amicon لجمع عينة طافية أحتاج إلى شرائه بشكل منفصل؟

شراء وحدات مرشح الطرد المركزي Amicon Ultra-0.5 (Thermo Fisher Scientific، Cat. # UFC510024) ، التي لديها 100 كيلو دالتون MWCO. يرجى التأكد من استخدام المرشحات كما هو موضح في بروتوكولنا.

هل يمكنني معالجة المركبات الكهربائية المعزولة Capturem مع بروتين K لإزالة الجزء الأكبر من البروتينات من العينات بدلاً من استخدام مرشح Amicon؟

يمكنك استخدام Proteinase K ، ولكن قد يؤدي ذلك إلى تدهور جزئي للبروتينات المكشوفة على سطح المركبات الكهربائية وبالتالي يؤثر على قدرتك على اكتشاف هذه البروتينات في تحليلك النهائي.

بالنسبة للأعمدة ماكسي ، هل يمكنني استخدام دلو متأرجح أو دوار بزاوية ثابتة؟

نعم ، يمكنك استخدام دوار دلو متأرجح أو دوار بزاوية ثابتة.


النسخ العكسي (توليف (كدنا))

ينتج توليف الحمض النووي من قالب RNA ، عبر النسخ العكسي ، DNA تكميليًا (cDNA). تستخدم النسخ العكسية (RTs) قالب RNA وبادئ قصير مكمل للنهاية 3 من RNA لتوجيه توليف أول حبلا cDNA ، والتي يمكن استخدامها مباشرة كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتيح هذا المزيج من النسخ العكسي و PCR (RT-PCR) اكتشاف الحمض النووي الريبي منخفض الوفرة في عينة ، وإنتاج cDNA المقابل ، وبالتالي تسهيل استنساخ جينات النسخ المنخفضة. وبدلاً من ذلك ، يمكن صنع أول جديلة (كدنا) مزدوج الشريطة باستخدام DNA Polymerase I و DNA Ligase. يمكن استخدام نواتج التفاعل هذه للاستنساخ المباشر بدون تضخيم. في هذه الحالة ، مطلوب نشاط RNase H ، إما من RT أو من الخارج.

تتوفر العديد من RTs من الموردين التجاريين. إن النسخ العكسي لفيروس الأرومة النخاعية للطيور (AMV) وفيروس مولوني مورين اللوكيميا (M-MuLV ، MMLV) هو النسخ العكسية المنتظمة التي تستخدم بشكل شائع في سير عمل البيولوجيا الجزيئية. ينقص M-MuLV Reverse Transcriptase 3 & amp ؛ الحاد و rarr 5 & amp ؛ نشاط نوكلياز خارجي حاد. يعتبر ProtoScript & reg II Reverse Transcriptase عبارة عن نسخة عكسية M-MuLV مؤتلفة مع انخفاض نشاط RNase H وزيادة ثبات الحرارة. يمكن استخدامه لتجميع أول حبلا (كدنا) في درجات حرارة أعلى من النوع البري M-MuLV. يكون الإنزيم نشطًا حتى 50 درجة مئوية ، مما يوفر خصوصية أعلى ، وإنتاجية أعلى من (كدنا) والمزيد من منتج (كدنا) كامل الطول ، يصل طوله إلى 12 كيلو بايت.

يعمل استخدام RTs المصممة هندسيًا على تحسين كفاءة تكوين المنتج كامل الطول ، مما يضمن اكتمال نسخ الطرف 5 من نسخة mRNA ، وتمكين انتشار وتوصيف نسخة DNA موثوقة لتسلسل RNA. يمكن أن يكون استخدام RTs الأكثر ثباتًا بالحرارة ، حيث يتم إجراء التفاعلات عند درجات حرارة أعلى ، مفيدًا جدًا عند التعامل مع RNA الذي يحتوي على كميات عالية من البنية الثانوية.

للمساعدة في مقارنة كواشف RTs و cDNA Synthesis المتاحة ، قم بعرض مخطط اختيار RT / cDNA Synthesis الخاص بنا.

اختر النوع:

هذا المنتج مغطى بواحدة أو أكثر من براءات الاختراع والعلامات التجارية و / أو حقوق النشر المملوكة أو الخاضعة لسيطرة New England Biolabs، Inc (NEB).

بينما تقوم NEB بتطوير منتجاتها والتحقق منها لتطبيقات مختلفة ، فإن استخدام هذا المنتج قد يتطلب من المشتري الحصول على حقوق ملكية فكرية إضافية لطرف ثالث لتطبيقات معينة.

لمزيد من المعلومات حول الحقوق التجارية ، يرجى الاتصال بفريق تطوير الأعمال العالمية في NEB على [email protected]

هذا المنتج مخصص لأغراض البحث فقط. هذا المنتج غير مخصص للاستخدام لأغراض علاجية أو تشخيصية في البشر أو الحيوانات.


تطبيق [كدنا]:

يحتوي الحمض النووي الريبي (cRNA) على سلسلة من الحمض النووي فقط لتشفير الحمض النووي. باستخدام القياس الكمي للنسخة العكسية PCR ، يمكن تقدير كمية النسخة المعينة أو mRNA أو الجين الذي يهمنا.

كما أنها تستخدم لاستنساخ الجينات وتجارب التحول.

تُستخدم مكتبة cDNA أيضًا لدراسة التعبير عن الحمض النووي حقيقي النواة عن طريق إدخاله في خلية بدائية النواة.

تعبير غير متجانس:

إن تخليق (كدنا) قابل للتطبيق في عملية التعبير غير المتجانسة حيث يتم التعبير عن البروتين في نوع من الخلايا غير قادر على تصنيع هذا البروتين بشكل طبيعي.

أحد الاستخدامات المهمة لبناء (كدنا) هو استنساخ جينات ذات عدد نسخ منخفض.


النتائج والمناقشة

تم إنشاء صندوق تجريبي كامل الطول D13 1.1 كيلو بايت (كدنا) بواسطة اشعال DF1 (HoxD13 الأمامي 1) و DR2 (HoxD13 التمهيدي العكسي 2) باستخدام تسلسل استنساخ الجينوم كما هو موضح في الشكل 1. تقييد هضم نوكلياز داخلي لمنتج PCR هذا باستخدام بوم أظهر الشكل 1 أجزاء صحيحة بالحجم المتوقع تبلغ 519 و 316 و 265 نقطة أساس على التوالي. تم هضم استنساخ D13 كامل الطول في ناقل PCR ® II (Invitrogen) بثلاثة نوكليازات داخلية مقيدة نتج عنها نمط حجم الجزء المتوقع الصحيح كما هو موضح في الشكل 2. علاوة على ذلك ، قمنا بترتيب نسخة D13 هذه باستخدام بادئات T7 للتأكد من إطار القراءة المفتوح الصحيح لهذا الجين. لم يلاحظ أي طفرات في D13 [كدنا] كنتيجة للتلاعب PCR.

كامل طول HOXD13 (كدنا) تحليل المنتج PCR. 1) 1.1 كيلو بايت هوموبوكس D13 (كدنا) كامل الطول تم إنشاؤه باستخدام بادئات محددة DF1 و DR2. 2 و 3) سلم 100 زوج (Gibco BRL Life Technologies ، Rockville ، MD) 4). تقييد هضم نوكلياز داخلية لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل مع بوم يوضح الشكل 1 الأجزاء الصحيحة ذات الحجم المتوقع من 519 و 316 و 265 نقطة أساس. على التوالي 5). سلم 1 كيلو بايت (Gibco BRL Life Technologies ، Rockville ، MD) 6-8). هي شظايا تقييد الهضم بطول كامل HOXD13 مستنسخة في PCR II (ناقل) مع سابقة بمعنى البيئة R1 (1.1 كيلو بايت) و Kpn 1 (381 نقطة أساس) و SMA 1 و بام H1 (826 نقطة أساس) على التوالي.


البادئات العشوائية عبارة عن أليغنوكليوتيدات قصيرة لها تسلسل عشوائي. نظرًا لأنها تتكون عادةً من 6 نيوكليوتيدات في الطول ، فإنها تُعرف غالبًا باسم السداسيات العشوائية. يتيح التسلسل العشوائي الربط غير المتحيز للبادئات إلى أي مكان في معظم أنواع الحمض النووي الريبي بما في ذلك الرنا الريباسي والرنا الصغير. نظرًا لأنها مرتبطة طوال الوقت ، يجب تغطية غالبية منتجات الجينات ، وبالتالي زيادة فرصة التضخيم أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تتكون البادئات Oligo (dT) من امتدادات من deoxythymidine. وهي متوفرة بأطوال مختلفة ، وأكثرها شيوعًا هي 12-18 نيوكليوتيدات طويلة. تم تصميم البادئات Oligo (dT) بحيث ترتبط مع ذيول بولي (A) التكميلية من الرنا المرسال (mRNA). لذلك ، فإن oligo (dT) s مفيدة فقط في تفاعلات cDNA عندما تكون mRNAs هدفًا لتطبيق المصب. لن تصلب إلى شظايا non-polyA mRNA ، مثل 18S rRNA. أيضًا ، ضع في اعتبارك أنه إذا تم تصميم بادئات PCR بالقرب من نهاية الجين 5 ، فإن استخدام البادئات oligo (dT) لتخليق cDNA ليس هو أفضل فكرة. نظرًا لأن هذه البادئات تصلب حتى نهاية 3 'mRNA ، فقد لا تكون النهاية 5' موجودة في المنتج الموسع ، خاصةً إذا كنت تبحث عن جين كبير.


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


هل يمكنني استخدام المخزن المؤقت PCR بدلاً من المخزن المؤقت لتوليف (كدنا)؟ - مادة الاحياء

في طرق عزل الحمض النووي الريبي شائعة الاستخدام ، لا يزال غياب الحمض النووي الجيني يمثل تحديًا. خاصة بالنسبة لـ RT-PCR الكمي (qRT-PCR ، يمكن أن يؤدي تضخيم الحمض النووي الجيني المشترك إلى نتائج غير محددة.

1.) الكشف عن الحمض النووي الجيني في عينات الحمض النووي الريبي

تم استخدام تقنيات مختلفة لرصد تلوث الحمض النووي الريبي بواسطة الحمض النووي الجيني. يمكن الكشف عن كميات كبيرة من الحمض النووي الملوث باستخدام قياس OD (ينتج عنه نسبة 260/280 نانومتر أقل بكثير من القيمة المثلى 2) ، أو عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، حيث يتم الحصول على أربطة حمض نووي ذات وزن جزيئي مرتفع للغاية.

ومع ذلك ، في تطبيقات المصب الحساسة مثل qRT-PCR ، يمكن أن تؤدي أيضًا آثار الحمض النووي الجينومي ، التي لا يمكن اكتشافها بالطرق المذكورة أعلاه ، إلى نتائج غير محددة. وذلك لأن كلا من mRNA المنسوخ العكسي (cDNA) ، وكذلك الحمض النووي الجيني الملوث ، يمكن أن يعمل كقالب لتضخيم PCR اللاحق. نتيجة هذا التضخيم المشترك هي واحدة أو أكثر من شظايا PCR الإضافية التي يمكن تصورها عبر الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز بناءً على وزنها الجزيئي المميز (انظر الشكل 1).
تتمثل إحدى الإستراتيجيات لتجنب هذا التضخيم المشترك في تصميم تمهيدي PCR يمتد عبر حدود exon.
تتضمن إستراتيجية التصميم التمهيدي هذا واحدًا أو أكثر من أشكال التسلسل intronic في الحمض النووي الجيني مما يؤدي إلى تحويل كفاءة التضخيم لتفاعل PCR تجاه قالب cDNA. يجب مراقبة خصوصية اختبار qRT-PCR باستخدام نسخة عكسية ناقص تفاعل التحكم في إعداد qRT-PCR. يتم معالجة تفاعل التحكم هذا ومعالجته بشكل مشابه لتفاعلات qRT-PCR الأخرى ، باستثناء أنه بدلاً من إنزيم الترانسكريبتاز العكسي ، يضاف الماء إلى خليط التفاعل. تشير شظايا PCR المتضخمة في تفاعل التحكم هذا إلى تلوث الحمض النووي الجيني.

الشكل 1: نظرة عامة على توليف (كدنا) الأول مع أنواع مختلفة من الاشعال RT.

تم إجراء GAPDH (الممرات 1 و 3 و 5) و RP49 (الممرات 2 و 4 و 6) PCR الجيني المحدد بما في ذلك تفاعل تحكم يفتقر إلى إنزيم النسخ العكسي (الممرات 5 و 6). شظايا PCR في الممرات 5 و 6 المشار إليها بواسطة الأسهم ، ذات وزن جزيئي أعلى بناءً على تسلسل intron المضمّن ، وبالتالي فهي تشير إلى تلوث قالب RNA بالحمض النووي الجيني.

2.) علاج DNase I
لإزالة الحمض النووي الجيني من عينات الحمض النووي الريبي ، يوصى بعلاج DNase I. يصنف إنزيم DNAse I على أنه نوكلياز داخلي قادر على هضم الحمض النووي الفردي والمزدوج الذي تقطعت به السبل إلى قواعد مفردة أو قليل النيوكليوتيدات. الإنزيم خاص بالحمض النووي دون أن يؤثر سلبًا على سلامة الحمض النووي الريبي المتبقي (Vanecko and Lasbowski ، 1961).

يمكن إجراء علاج DNase I في نفس وقت عزل RNA. يتم استخدام هذا الإجراء المريح في مجموعة عزل RNA عالية النقاء. يتم تضمين إنزيم DNase I في المجموعة ، ويتم تطبيقه مباشرة أثناء إجراء عزل عمود الدوران. يرتبط RNA بصوف السيليكا في وجود أملاح Chaotropic ، ويتم تطبيق DNase I مباشرةً واحتضانه باستخدام RNA المنقى على عمود الدوران. يتم بعد ذلك غسل الحمض النووي المهضوم من عمود الدوران ، مما يؤدي إلى إزالة الحمض النووي الريبي النقي من عمود الدوران.

من أجل حماية الحمض النووي الريبي المعزول ، يجب أن يكون إنزيم DNase I المستخدم بجودة خالية من RNase. إنزيم DNase I Enzyme المؤتلف ، RNase-Free من شركة Roche ليس مضمونًا فقط أنه خالٍ من RNase وفقًا لرقابة الجودة الصارمة الحالية ، ولكنه علاوة على ذلك خالٍ من أي مكونات حيوانية ، مثل تلوث الحمض النووي.

في حالات المستويات العالية جدًا من الحمض النووي الجيني الداخلي ، فإن العلاج باستخدام DNase I أثناء عملية العزل لا يزال بإمكانه ترك بقايا الحمض النووي الملوث في الحمض النووي الريبي المعزول. في هذه الحالة ، يمكن إجراء علاج DNase بعد عزل الحمض النووي الريبي.

نصيحة: كقاعدة عامة لهضم DNase I ، استخدم وحدة واحدة من DNase I لكل 1 إلى 5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي في الحجم الإجمالي 50 ميكرولتر المحتضنة لمدة 20 دقيقة عند +25 إلى + 37 درجة مئوية.

بعد خطوة هضم DNase الإضافية ، يلزم إجراء تنقية إضافية للحمض النووي الريبي من إنزيم DNase I. يمكن إجراء هذا التنقية عن طريق إجراء تنظيف باستخدام مجموعة عزل RNA عالية النقاء باتباع بروتوكول المجموعة (2.2 عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا المستزرعة). قبل إجراء التنظيف ، يجب زيادة حجم العينة إلى 200 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للشطف المتضمن في المجموعة.
لاحظ أنه في هذه الحالة ، يجب حذف خطوة هضم DNase للعمود أثناء الدوران من البروتوكول المذكور في إدراج الحزمة.
الفائدة الرئيسية من هذه الطريقة هي سهولة استخدامها ، ونقص المواد السامة ، فضلاً عن الاسترداد العالي للحمض النووي الريبي الكلي.

الشكل 2: هضم الحمض النووي الجيني بواسطة علاج DNase I.

تم إجراء GAPDH (الممرات 1 و 3 و 5) و RP49 (الممرات 2 و 4 و 6) PCR الخاصة بالجينات بما في ذلك تفاعل تحكم يفتقر إلى إنزيم النسخ العكسي (الممرات 5 و 6). شظايا PCR في الممرات 5 و 6 المشار إليها بواسطة الأسهم ، ذات وزن جزيئي أعلى بناءً على تسلسل intron المضمّن ، وبالتالي فهي تشير إلى تلوث قالب RNA بالحمض النووي الجيني.


أ) تضخيم جزء GAPDH بواسطة PCR.
ب) رد فعل تحكم ناقص-RT مع وبدون علاج DNase I. تم عزل الحمض النووي الريبي من خلايا 1 × 106 K562 (الخلايا الليمفاوية البشرية) باستخدام مجموعة عزل RNA عالية النقاء مع تضخيم لاحق لشظايا PCR الخاصة بـ GAPDH (الممرات من 1 إلى 6). لم يتم الحصول على جزء غير متوقع من PCR ، مما يشير إلى عدم وجود الحمض النووي الجيني في الممرات من 1 إلى 4 (+ علاج DNase) ، في حين أظهرت تلك العينات التي تفتقر إلى معالجة DNase منتجات PCR المنتجة من تلوث الحمض النووي الجيني (الممرات 5 و 6) التي تعمل كقالب في تضخيم PCR.
نصيحة: حتى بعد معالجة DNase ، يجب إجراء PCR لاحقًا باستخدام تصميم التمهيدي المتداخل مع exon. يجب أيضًا تضمين تفاعل ناقص الإنزيم العكسي كتفاعل تحكم لمراقبة خصوصية التضخيم.

3.) عدم اكتمال هضم DNase.
لا يزال بإمكان المستويات العالية جدًا من الحمض النووي الجيني الداخلي أن تترك بقايا الحمض النووي الملوث في الحمض النووي الريبي المعزول. في حالة عدم وجود خيار إضافي لهضم DNase مع التنظيف اللاحق ، يجب تقليل كمية المادة الأولية (على سبيل المثال ، 106 خلية مستنبتة ، 500 ميكرولتر من الدم الكامل ، 108 خلايا خميرة أو 109 خلايا بكتيرية هي الحد الأقصى لعزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء عدة).
سبب آخر محتمل لهضم الحمض النووي غير المكتمل هو أن نشاط إنزيم DNase I يمكن أن ينخفض ​​بسبب ظروف عازلة دون المستوى الأمثل. يتطلب إنزيم DNase I كاتيونات ثنائية التكافؤ مختلفة ، كل من Mg 2+ و Ca 2+ ، للحصول على الأداء الأمثل.
نصيحة: لتحقيق الأداء الأمثل لهضم DNase I ، يجب أن يكون تركيز الحمض النووي حوالي 100 ميكروغرام / مل.

في بعض الأحيان ، يمكن أن تؤثر معالجة DNase I الإضافية ، وتحديداً تعطيل الحرارة لإنزيم DNase I ، سلبًا على نتائج RT-PCR اللاحقة. يمكن أن تؤدي درجات الحرارة المرتفعة اللازمة لتعطيل إنزيم DNase I أيضًا إلى تدهور الحمض النووي الريبي. يتطلب التعطيل الحراري لإنزيم DNase I حضانة عند + 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. نظرًا لأن جزيئات الحمض النووي الريبي حساسة للحرارة (Huang et al. ، 1996) ، يجب أن يكون وقت الحضانة هذا أقصر ما يمكن.

1. Chomczynski، P، Sacchi، N (1987). الشرج Biochem. 162 ، 156-9.

2. Huang، Z، Fasco، MJ، Kaminsky LS (1996). التقنيات الحيوية 20، 1012-20.

3. مور ، س (1981). في: الإنزيمات (Boyer PD، Ed.). المطبعة الأكاديمية ، نيويورك.


هل يمكنني استخدام المخزن المؤقت PCR بدلاً من المخزن المؤقت لتوليف (كدنا)؟ - مادة الاحياء

تهدف تقنيات `` Omic '' ، التي تتبنى نظرة شاملة للجزيئات التي يتكون منها الكائن الحي ، في المقام الأول إلى الكشف العالمي عن الجينات (الجينوميات) ، و mRNA (النسخ) ، والبروتينات (البروتينات) والأيضات (الأيضات) في بيولوجي معين. عينة. تطبيق التقنيات الجينومية في مجال علم الأحياء الدقيقة التشخيصي له حدود حيث أن الجينوميات تستهدف الأحماض النووية الخاصة بالكائنات الميكروبية ، لذلك يمكن أن تحدث نتيجة إيجابية مع كل من الكائنات الحية الدقيقة النشطة وغير النشطة. تقدم علم النسخ جنبًا إلى جنب مع التقدم في تقنية المصفوفة الدقيقة وتقنية النسخ الاحتياطي في الوقت الحقيقي PCR ، بينما استفادت البروتينات وعلم الأيض بشكل كبير من التطور المتزايد لتقنيات قياس الطيف الكتلي التي تكتشف البروتين والتحليلات الأيضية. تساعد علم النسخ والبروتيوميات وعلم الأيض معًا في معالجة الأسئلة المتعلقة بالتعبير الجيني ، وبالتالي توفير التشخيص "الوظيفي" وتقييم العدوى الميكروبية.

يقوم DNase I و Proteinase K بإزالة الحمض النووي من البكتيريا المصابة أو الميتة ولكن ليس من البكتيريا الحية في النظم المرجعية للميكروبات والأغشية الحيوية لمياه الشرب الطبيعية لتحليلات البيولوجيا الجزيئية اللاحقة

أشارت النتائج إلى تمييز جيد نسبيًا بين الحمض النووي المكشوف من C. jejuni الميتة والحمض النووي المحمي من البكتيريا الحية. تم استخدام DNase I بشكل أساسي في مجال البيولوجيا الجزيئية لإزالة تلوث الحمض النووي الجيني البكتيري في العينات لمزيد من تحليلات الحمض النووي الريبي (Wang et al. . ، 2002). باقتراح تعرض عينة تحتوي على DNA و eDNA وخلايا حية وميتة لـ DNase I ، يجب حماية الأحماض النووية من الخلايا الحية من عمل الإنزيم بسبب غشاء الخلية السليم.

تعتبر التقنيات الجزيئية ، مثل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) و PCR الكمي (qPCR) ، حساسة للغاية ، ولكنها قد تكتشف إجمالي الحمض النووي الموجود في العينة ، بما في ذلك الحمض النووي خارج الخلية (eDNA) والحمض النووي القادم من الخلايا الحية والميتة. DNase I هو نوكلياز داخلي لا يشق على وجه التحديد الحمض النووي المفرد والمزدوج الذي تقطعت به السبل. تم اختبار هذا الإنزيم في هذه الدراسة لتحليل قدرته على هضم الحمض النووي القادم من الخلايا الميتة بأغشية الخلايا التالفة ، تاركًا الحمض النووي من الخلايا الحية ذات الأغشية الخلوية السليمة المتاحة للطرق القائمة على الحمض النووي. لهذا الغرض ، تم تطوير بروتوكول محسن DNase I / Proteinase K (DNase / PK). متصل المكورات العنقودية الذهبية خلايا قتل الحرارة الزائفة الزنجارية الخلايا ، DNA الجينومي الحر السالمونيلا المعوية، وتم التعامل مع مزيج من هذه الأهداف وفقًا لبروتوكول DNase / PK المطور. في موازاة ذلك ، عولجت هذه العينات باستخدام بروبيديوم أحادي أزيد (PMA) كمقايسة موصوفة بالفعل للتمييز بين الأحياء والميت. تم استخدام PCR الكمي و PCR-DGGE لجزء eubacterial 16S rDNA لاختبار قدرة علاجات DNase / PK و PMA لتمييز الحمض النووي القادم من الخلايا ذات الأغشية الخلوية السليمة في وجود الحمض النووي من الخلايا الميتة والحمض النووي الجيني الحر. تم تطبيق الأساليب على الأغشية الحيوية الأصلية لمياه الشرب التي يبلغ عمرها ثلاثة أشهر من منشأة تجريبية تم بناؤها في محطات المياه الألمانية. أظهرت التحولات في أنماط الحمض النووي التي لوحظت بعد تحليل DGGE قابلية تطبيق DNase / PK وكذلك علاج PMA لفحص الأغشية الحيوية الطبيعية. ومع ذلك ، أظهر علاج DNase / PK بعض المزايا العملية بالمقارنة مع علاج PMA للتمييز الحي / الميت للأهداف البكتيرية في أنظمة مياه الشرب.

تحديد بروتين ثالث مرتبط بـ EspA يشكل جزءًا من نظام إفراز النوع الثالث من الإشريكية القولونية المعوية النزفية

النزف المعوي الإشريكية القولونية يستخدم نظام إفراز من النوع الثالث لإيصال المؤثرات الخبيثة إلى الخلايا. يتكون جهاز الإفراز من جسم غشائي قاعدي ومركب إبرة خارجي والذي يعتبر EspA المكون الرئيسي له. ان l0050- تم العثور على طفرة حذف (L50) تضعف إفراز النوع الثالث والالتزام البكتيري. تدعم هذه الأنماط الظاهرية وتوطين منتج الجين في الغشاء الداخلي الفرضية القائلة بأن L0050 ، الذي أعيدت تسميته بـ EscL ، يشكل جزءًا من جهاز الإفراز. علاوة على ذلك ، في L50 ، وجد أن كمية EspA الموجودة داخل محللة الخلية قد تقلصت ، في حين ظل البروتين الشريك EspA المعبر عنه بالسيسترون EspA غير متأثر. يبدو أن انخفاض مستوى EspA ناتج عن عدم استقرار بروتين EspA المركب حديثًا في ΔL50 بدلاً من انخفاض في EspA mRNA. باستخدام كل من التنقية الكيميائية الحيوية ونظام التفاعل البكتيري ثنائي الهجين ، تمكنا من استنتاج أن EscL هو بروتين ثالث ، بالإضافة إلى CesAB و CesA2 ، يتفاعل مع EspA ويعزز استقرار EspA داخل الخلايا.


الانتماءات

مختبر بيولوجيا الخلايا الجرثومية للثدييات ، مركز علم الأحياء التطوري ، معهد RIKEN Kobe ، 2-2-3 Minatojima-Minamimachi ، Chuo-ku ، Kobe ، 650-0047 ، اليابان

Kazuki Kurimoto و Yukihiro Yabuta و Yasuhide Ohinata و amp Mitinori Saitou

البحث التمهيدي لعلوم وتكنولوجيا الأجنة ، وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية ، 4-1-8 هون-شو ، كاواجوتشي ، سايتاما ، 332-0012 ، اليابان

مختبر بيولوجيا الخلايا الجزيئية وتطويرها ، كلية الدراسات العليا للدراسات الحيوية ، جامعة كيوتو ، أوواك-تشو ، كيتاشيراكاوا ، ساكيو-كو ، كيوتو ، 606-8502 ، اليابان


شاهد الفيديو: الدرس الثالث- التفاعل المتسلسل PCR و الاستشارة الوراثية - أحياء الحادي عشر - الاستاذ مراد الساعي (شهر فبراير 2023).