معلومة

توطين الخلية B و T.

توطين الخلية B و T.


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ماذا يعني توطين B-Cell ؟؟
"قد لا يتزامن توطين الخلايا B و T في المواد المسببة للحساسية". ماذا يعني هذا القول؟
(لم أدرس علم الأحياء منذ السنوات الثماني الماضية ، وأنا الآن أخوض فيه لأنني أحتاجه لبحثي. لذلك إذا كان بإمكان شخص ما وصفه بلغة بسيطة ، فسيكون ذلك مفيدًا للغاية)


أعتقد أن السبب الذي يجعلك تواجه مشكلة في تمييز العبارة هو أنها ليست منطقية حقًا ، ولا هي في رأيي مفسرة بشكل كافٍ في الورقة. الجمل التي تسبقها تقدم شرحًا بسيطًا لما قد يحصل عليه المؤلف في:

حتى الآن ، تم تحديد 1500 بنية مسببة للحساسية. يتم استخدام قواعد بيانات مسببات الحساسية على الإنترنت وأدوات التنبؤ بالحساسية لإيجاد تفاعل تبادلي بين مسببات الحساسية المعروفة. قد لا يتزامن توطين الخلايا B و T في المادة المسببة للحساسية.

أثناء الاستجابة المناعية المبالغ فيها (الحساسية) ، تتوضع الخلايا الليمفاوية (B و T) (تنتقل أو تتراكم في) إلى موقع المستضد (المسبب للحساسية).

إذا كان بإمكاني التخمين ، فسأقول إن المؤلف يوضح أن البيانات أظهرت أنه لا توجد استجابة مناعية (البيانات الناتجة عن تقييم تراكم الخلايا الليمفاوية بالقرب من مسببات الحساسية) ، على الرغم من حقيقة أن هذه العوامل المسببة للحساسية عبر الإنترنت تقول إن الاستجابة المناعية يجب أن يتم إنشاؤها.

يتحرك البيان في رأيي لتشويه سمعة هذه العوامل المسببة للحساسية عبر الإنترنت.

لقد ألقيت نظرة على بقية المخطوطة ، ووجدت غموضين آخرين بداخلها.

يستشهد المؤلف بورقة أخرى في جملتك قد تلقي مزيدًا من الضوء على هذا: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2686541/؟

نظرة عامة على ذلك قدمت القليل من الوضوح مع ذلك.

أخشى أن مجرد كرة بلورية أو هذا السؤال الموجه إلى كبير المؤلفين قد يجيب على سؤالك بيقين تام:

د. راجات كومار دي أستاذ وحدة استخبارات الآلة المعهد الإحصائي الهندي 203 طريق باراكبور ، كولكاتا 700108 ، الهند.


"قد لا يتزامن توطين الخلايا B و T في المواد المسببة للحساسية". هذه الجملة مكتوبة بشكل سيئ ، فهي تربك أكثر من كونها معلومة.

ما يقصده المؤلف هو: الحواتم التي يمكن للخلايا البائية والخلايا التائية التعرف عليها ليست هي نفسها في أحد مسببات الحساسية. علينا أن نتذكر أن جميع المواد المسببة للحساسية تقريبًا عبارة عن بروتينات وأن البروتينات تتكون من أحماض أمينية ، وهذا ما يشكل الحواتم. بالنسبة لبنية واحدة معينة أو لنقل ، أحد مسببات الحساسية ، يمكن للخلية التائية التعرف عليها فقط خطي الحلقات بينما يمكن للخلية B التعرف عليها خطي أو شكلي الحلقات (أي أنها تتعرف على بنية تشبه ثلاثية الأبعاد وليست مجرد سلسلة من الأحماض الأمينية).

ما أقوله دائمًا لطلابي حتى يتمكنوا من فهم المفهوم هو أن الخلايا التائية قادرة على "رؤية" صورة كرسي للتعرف عليها. بينما يمكن للخلية B أن تفعل ذلك وأكثر من ذلك يمكنها في الواقع "رؤية" كرسي على حقيقته.


ينظم التوطين المعتمد على حمض الفوسفاتيد ونزع الفسفرة القاعدية من RA-GEFs الاتجار بالخلايا الليمفاوية

تنتشر الخلايا الليمفاوية بين الأنسجة اللمفاوية المحيطية عبر الدم والجهاز الليمفاوي ، والهجرة التي يسببها الكيماويات مهمة في تهريب الخلايا الليمفاوية إلى مواقع بعيدة. يعد GTPase Rap1 الصغير مهمًا في التوسط في حركة الخلايا الليمفاوية ، وتشارك Rap1-GEFs في تنشيط Rap1 بوساطة الكيماويات. هنا ، نصف أدوار وآليات Rap1-GEFs في الاتجار بالخلايا الليمفاوية.

نتائج

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن RA-GEF-1 و 2 (المعروف أيضًا باسم Rapgef2 و 6) هما عاملان أساسيان لتبادل النوكليوتيدات (GEF) لـ Rap1 في تهريب الخلايا الليمفاوية. الفئران التي تؤوي الضربات القاضية الخاصة بالخلايا التائية رابغف 2/6 إظهار خلل في توجيه وخروج الخلايا التائية. ينشط Sphingosine-1-phosphate (S1P) وكذلك chemokines Rap1 بطريقة تعتمد على RA-GEF-1/2 ، ونقصها في الخلايا التائية يضعف فسفرة Mst1 ، واستقطاب الخلية ، والانجذاب الكيميائي نحو التدرج S1P. من ناحية أخرى ، فإن الضربات القاضية الخاصة بالخلايا البائية رابغف 2/6 يضعف الاحتفاظ المعتمد على الكيماوكين للخلايا البائية في نخاع العظام ويسهل الخروج بشكل سلبي. يحدد الإنتاج المعتمد على الفوسفوليباز D2 لحمض الفوسفاتيديك بواسطة هذه العوامل الكيميائية التوزيع المكاني لـ Rap1-GTP بعد توطين الغشاء لـ RA-GEFs ويحث على تطوير الغشاء الأمامي. من ناحية أخرى ، فإن إزالة الفسفرة القاعدية لـ RA-GEFs ضرورية للزيادة المعتمدة على العامل الكيميائي في نشاط مرفق البيئة العالمية لـ Rap1.

الاستنتاجات

نوضح هنا أن التوزيع الخلوي وتنشيط RA-GEFs هما عاملان أساسيان للحركة الاتجاهية للخلايا الليمفاوية وأن حمض الفوسفاتيدك ضروري لانتقال غشاء RA-GEFs مع التحفيز الكيميائي.


نتائج

Dynein تتعاون مع NMII لتحريك الجسيم المركزي.

لاستكشاف دور dynein ، قمنا بتحويل انفجارات الخلايا التائية CD4 + T الأولية باستخدام shRNA ضد سلسلة dynein الثقيلة (DynHC) جنبًا إلى جنب مع بنية ترميز centrin المسمى RFP ، وهي علامة مركزية (الشكل 1). أ و ب ). أعربت الخلايا التائية عن 5CC7 TCR ، والتي تتعرف على السيتوكروم العثة ج88 & # x02013103 (MCC) الببتيد المرتبط بجزيء معقد التوافق النسيجي الكبير من الدرجة الثانية I-E k. أدى قمع DynHC إلى تشتيت جهاز جولجي بشكل ملحوظ ، مما يدل على ضعف وظيفة dynein (الشكل S1). قمنا بعد ذلك بتقييم استقطاب الجسيم المركزي عن طريق تصوير الاتحادات الثابتة المكونة من الخلايا التائية وخلايا CH12 B المحملة بمستضد (الشكل 1). ب& # x02013د ). كما هو متوقع ، أظهرت الخلايا التائية الضابطة التي تعبر عن shRNA غير المستهدفة استقطابًا مركزيًا قويًا ، يتميز بمؤشر الاستقطاب & # x0201c & # x0201d قريب من الصفر. تم إلغاء هذه الاستجابة بواسطة nocodazole ، الذي يزيل بلمرة الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة ، و phorbol myristate acetate (PMA) ، الذي يمنع إعادة توجيه الجسيمات المركزية عن طريق استنباط إشارات DAG غير المستقطبة (4). والمثير للدهشة أن الخلايا التائية التي تفتقر إلى الداينين ​​لم تظهر سوى عيبًا طفيفًا في الاستقطاب فشل في بعض التجارب في الوصول إلى دلالة إحصائية. تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام مثبط داينين ​​جزيء صغير تم وصفه مؤخرًا ، وهو ciliobrevin D (الشكل 1).ه ) ، والذي يستهدف مجال محرك دينين (17). ومن ثم ، فإن فقدان بروتين Dynein أو وظيفة Dynein أدى جزئيًا فقط إلى منع إعادة توجيه الجسيم المركزي ، مما يعني ضمناً وجود آليات تعويضية.

يتعاون Dynein و NMII خلال استقطاب الجسيم المركزي في الخلايا التائية وتقارن # x02013APC. (أ& # x02013جتم خلط انفجارات الخلايا التائية (5CC7) التي تعبر عن shRNAs المشار إليها بعلامة GFP مع centrin-RFP بخلايا CH12 المحملة بمستضد وتم تصويرها بعد التثبيت. عولجت الخلايا بـ 5 نانوغرام / مل من PMA ، 33 & # x003bcM nocodazole ، 50 & # x003bcM blebbistatin ، أو التحكم في السيارة (DMSO) كما هو محدد. (أ) التحقق من صحة ضربة قاضية DHC shRNA بواسطة طعنة مناعية ، مع & # x003b2 actin بمثابة عنصر تحكم في التحميل. NT ، عدم استهداف تحكم shRNA. (ب) يتم عرض صور الفلورة التمثيلية متراكبة على صور المجال الساطع المقابلة لها. (أشرطة النطاق: 10 & # x003bcm.) (ج) رسم تخطيطي يوضح حساب مؤشر الاستقطاب. (د) القياس الكمي لمؤشر الاستقطاب في الاتحادات الثابتة (ن & # x02265 44 متقارن لكل حالة). (ه) الاستقطاب المركزي في الاتحادات الثابتة المعالجة بمركبة DMSO ، 5 نانوغرام / مل PMA ، 50 & # x003bcM ciliobrevin D ، 50 & # x003bcM مركب التحكم السلبي لـ ciliobrevin D (المركب 2) ، 50 & # x003bcM blebbistatin ، أو 50 & # x003bcM ciliobrevin D بالاشتراك مع 50 & # x003bcM blebbistatin (ن & # x02265 45 اتحادات لكل حالة). أشرطة الخطأ في د و ه دلالة SEM. ص تم حساب القيم باستخدام اختبار Mann & # x02013Whitney. ***ص & # x0003c 0.001 **ص & # x0003c 0.01 *ص & # x02264 0.05 نانوثانية ، ص & # x0003e 0.05.

نظرًا لأن NMII متورط في تحريض القطبية في أنواع الخلايا الملتصقة (10 ، 11) ، فقد بحثنا فيما إذا كان يمكن أن يساهم في إعادة توجيه الجسيم المركزي في الخلايا التائية. تسبب Blebbistatin ، وهو مثبط محدد لمحرك الميوسين 2 ، في حدوث خلل استقطاب صغير ، مشابه في الحجم لذلك الناجم عن نقص الدينين وحده (الشكل 1). ب& # x02013ه ). ومع ذلك ، فإن الجمع بين البليبيستاتين مع DynHC shRNA أو ciliobrevin D يثبط بشدة استقطاب الجسيم المركزي ، مع متوسط ​​مؤشرات الاستقطاب التي يمكن مقارنتها بالخلايا المعالجة بـ nocodazole و PMA. لم يتأثر فسفرة Erk الناجم عن TCR بتثبيط dynein أو NMII ، مما يعني أن أنماط الاستقطاب التي لاحظناها لم تنتج عن ضعف إشارات TCR (الشكل S2).أ). أشارت هذه النتائج إلى أن NMII و dynein يعملان بطريقة زائدة عن الحاجة جزئيًا لتحريك الجسيم المركزي نحو IS.

لفحص التفاعل بين dynein و NMII عن كثب ولربط استجابات الاستقطاب بأحداث الإشارة الأخرى ، استخدمنا اختبار التنشيط الضوئي والتصوير TCR الموصوف مسبقًا (18). يتم إرفاق الخلايا التائية بأغطية مغلفة بإصدار ضوئي من pMHC الخاص بهم. يؤدي التشعيع اللاحق لمنطقة بحجم ميكرون أسفل الخلية التائية باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى تنشيط TCR الموضعي ، مما يؤدي إلى إنشاء منطقة شبيهة بـ IS داخل الخلية T & # x02013glass. تتراكم DAG و nPKCs عادةً في هذه المنطقة بعد & # x0223c90 ثانية ، مع إعادة توجيه الجسيم المركزي بعد 10 & # x0201315 ثانية لاحقًا (4). يتيح لنا هذا النظام تشغيل إعادة توجيه مركزية تعتمد على TCR ومراقبة الاستجابات المرتبطة بدقة عالية زمانية مكانية.

أدى قمع DynHC إلى عيب صغير ، لكن يمكن اكتشافه ، في إعادة توجيه الجسيم المركزي إلى المنطقة المشعة بالأشعة فوق البنفسجية (الشكل 2). أ و ب ). أظهرت الخلايا التائية التي تفتقر إلى DynHC أيضًا انخفاضًا كبيرًا في سرعة الجسيم المركزي القصوى ، مما يشير إلى ضعف القدرة على تحريك الجسيم المركزي (الشكل 2).ج ). وقد لوحظت عيوب مماثلة بعد العلاج بالبليبيستاتين (الشكل 2 أ& # x02013ج ) ، بما يتفق مع دور NMII في هذه العملية. قمع MyH9 بوساطة shRNA ، السلسلة الثقيلة الوحيدة NMII المعبر عنها في الخلايا التائية ، أعاقت أيضًا إعادة توجيه الجسيم المركزي ، على الرغم من أن بدرجة أقل من البليبيستاتين (الشكل S3)أ). من المحتمل أن يعكس هذا ضربة قاضية دون المستوى الأمثل بواسطة MyH9 shRNA (الشكل S3ب). الأهم من ذلك ، أن التطبيق المتزامن لـ DynHC shRNA و blebbistatin قد منع استجابات الاستقطاب إلى حد أكبر بكثير من أي علاج على حدة. تم إلغاء حركة الجسيم المركزي نحو المنطقة المشععة أساسًا (الشكل 2 أ و ب ) ، وتم تقليل السرعة المركزية القصوى بأكثر من ضعفين بالنسبة للتحكم في الخلايا التائية (الشكل 2ج ). لم تؤثر ضربة قاضية لـ DynHC على إنتاج DAG الناجم عن TCR ، ولم يغير البليبيستاتين تجنيد PKC & # x003b8 ، مما يشير إلى أن إشارات TCR المبكرة كانت سليمة (الشكل S2 ب و ج). تشير هذه البيانات إلى أن Dynein و NMII يتعاونان لنقل الجسيم المركزي في اتجاه المصب لتنشيط nPKC المستقطب.

يتعاون Dynein و NMII لاستقطاب الجسيم المركزي استجابة للتنشيط الضوئي TCR. استقطاب الجسيم المركزي في الخلايا التائية المعالجة بـ shRNA غير الاستهدافي (NT) أو shRNA ضد DynHC (DHC) ، مع أو بدون 50 & # x003bcM بليبيستاتين. (أ) المونتاج الزمني التمثيلي ، مع وقت تشعيع الأشعة فوق البنفسجية المشار إليه بنص أصفر. الدوائر الصفراء تشير إلى المنطقة المشعة في كل تجربة. يشار إلى الوقت بالدقائق: الثواني فوق المونتاج. (أشرطة النطاق: 5 & # x003bcm.) (ب) متوسط ​​المسافة بين المنطقة المنشطة ضوئيًا والجسيم المركزي بمرور الوقت ، مع الإشارة إلى الأشعة فوق البنفسجية بخط أرجواني. (ج) السرعة القصوى للحركة المركزية (ن & # x02265 34 خلية لكل عينة). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. ص تم حساب القيم باستخدام Student ر اختبار. ***ص & # x0003c 0.001 **ص & # x0003c 0.01 *ص & # x02264 0.05 نانوثانية ، ص & # x0003e 0.05.

التوطين المتبادل لـ NMII و Dynein أثناء إعادة التوجيه المركزي.

لاستكشاف كيفية تأثير NMII على استقطاب الجسيمات المركزية ، قمنا بمراقبة توطينه في تجارب التنشيط الضوئي باستخدام الخلايا التائية التي تعبر عن MyoRLC المسمى GFP. شكل NMII مجموعات خيطية عابرة تحت غشاء البلازما (الشكل 3أ ) التي يمكن تصورها عن طريق الفحص المجهري الكامل للانعكاس الداخلي (TIRF). أدى التنشيط الضوئي لـ TCR المحلي إلى تغيير هذا النمط عن طريق قمع تشكيل مجموعات NMII الجديدة في المنطقة المشععة (الشكل 3). أ و ب والفيلم S1). أدى هذا إلى عدم تناسق في توزيع NMII ، لأن المجموعات استمرت في التكون في الغشاء خلف الجسيم المركزي أثناء إعادة توجيهها (الشكل 3).ب ). كشف التحليل الدقيق للخطوات الفردية في حركة الجسيم المركزي عن وجود علاقة ملحوظة بين السرعة اللحظية للجسيم المركزي وفرق شدة MyoRLC المقاسة على طول اتجاه الحركة (الشكل 3).ج ). وبالتالي ، ارتبطت السرعات الأكبر بتراكم أعلى لـ MyoRLC خلف الجسيم المركزي ونضوب أكبر أمامه. بالإضافة إلى ذلك ، أشار تحليل الارتباط المتبادل إلى أن فقدان NMII من المنطقة المشععة يسبق إعادة توجيه الجسيم المركزي بمقدار 27.0 & # x000b1 5.9 ثانية. ومن ثم ، حدث إعادة تصميم NMII في الوقت المناسب للتأثير على استجابة الاستقطاب.

توطين متبادل لـ NMII و dynein بعد تنشيط TCR. تم إجراء تجارب التنشيط الضوئي باستخدام خلايا 5CC7 T تعبر عن MyoRLC-GFP مع أي من centrin-RFP (أ& # x02013ج) أو DynIC-RFP (د و ه). تم تصوير MyoRLC-GFP و DynIC-RFP باستخدام الفحص المجهري TIRF ، وتم تصوير centrin-RFP باستخدام epifluorescence. (أ و د) المونتاج الزمني التمثيلي ، مع وقت تشعيع الأشعة فوق البنفسجية المشار إليه بنص أصفر. الدوائر الصفراء تشير إلى المنطقة المشعة في كل تجربة. رؤوس الأسهم في أ عرض مجموعات MyoRLC-GFP. يشار إلى الوقت بالدقائق: الثواني في أعلى كل صورة. (أشرطة النطاق: 5 & # x003bcm.) (ب و ه) التحديد الكمي لديناميات MyoRLC و DynIC (ن & # x02265 10 خلايا لكل منحنى). استبعاد MyoRLC من المنطقة المشعة (ب و ه) وتوظيف DynIC في المنطقة المشعة (ه) تظهر كـ & # x00394F / F ، وهي خلفية طبيعية مصححة تعني شدة التألق (MFI). تم تقييم إعادة ترتيب MyoRLC أيضًا عن طريق حساب نسبة MFI بين الجزء الخلفي والأمامي للخلية T (ب) (أنظر أيضا مواد وطرق SI). (ج) العلاقة بين حجم خطوة الجسيم المركزي والتراكم التفاضلي لـ MyoRLC حول الجسيم المركزي ، محسوبًا في كل نقطة زمنية عن طريق طرح MyoRLC MFI أمام الجسيم المركزي من MFI خلف الجسيم المركزي. يتم فرز البيانات بناءً على حجم خطوة الجسيم المركزي في نفس النقطة الزمنية (ن = 10 خلايا انظر أيضًا مواد وطرق SI). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM.

يتم تجنيد Dynein في منطقة تحفيز TCR قبل الجسيم المركزي (4). يمكن مراقبة استجابة التوظيف هذه عن طريق تصوير TIRF في الخلايا الحية باستخدام وحدات دينين ذات علامات الفلورسنت بما في ذلك السلسلة الوسيطة (DynIC) ، والسلسلة المتوسطة الخفيفة (DynLIC) ، وسلسلة TcTex الخفيفة (DynLC). باستخدام الخلايا التائية التي تعبر عن MyoRLC المسمى بـ GFP جنبًا إلى جنب مع DynIC المسمى RFP ، وجدنا أن dynein و NMII اعتمدتا تكوينات متبادلة أثناء استجابات الاستقطاب (الشكل 3). د و ه والفيلم S2). في حين تم تجنيد dynein في المنطقة المشعة ، يتجمع الميوسين في المناطق التي تفتقر إلى dynein. تم اكتشاف هذا الارتباط المضاد الملحوظ قبل وبعد تحفيز TCR ، مما يشير إلى أن التوطين المتبادل لـ NMII و dynein لم يتم إنشاؤه بواسطة إشارات TCR ولكن يتم تسخيره فقط من خلاله (الشكل S4).أ). استنفاد NMII سبقت تراكم dynein في المنطقة المشعة بمقدار 24.8 & # x000b1 11.5 ثانية ، مما يشير إلى أن NMII تمت إعادة تنظيمه قبل dynein في هذا المسار. مجتمعة مع التجارب الوظيفية الموضحة أعلاه ، تدعم هذه النتائج نموذجًا بموجبه dynein & # x0201cpulls & # x0201d على شبكة الأنابيب الدقيقة من الأمام بينما NMII & # x0201cpushes & # x0201d من الخلف.

تم الإبلاغ عن أن NMII يتراكم في IS في الخلية T وتقارن # x02013APC (13) ، والذي يبدو غير متوافق مع فكرة أنه يمكن أن يؤثر على استقطاب الجسيم المركزي من الخلف. للتحقيق في هذه المشكلة ، قمنا بتصوير الخلايا التائية التي تعبر عن كل من MyoRLC-GFP و centrin-RFP مع APCs (الشكل S4)ب). على الرغم من أننا لاحظنا أحيانًا تراكمًا متشابكًا لـ NMII ، إلا أنه حدث في أقل من نصف الاتحادات التي فحصناها (5/14) ، وفي جميع الحالات ، استمر أقل من 3 دقائق. ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا أيضًا أن نقط NMII عابرة تتشكل على جانبي وظهر الخلايا التائية المنشطة أثناء إعادة توجيه الجسيم المركزي (رؤوس الأسهم البيضاء في الشكل S4).ب). على الرغم من أننا لا نستطيع أن نقول على وجه اليقين أن هذه النقاط النقطية متطابقة مع مجموعات NMII التي لوحظت في تجارب التنشيط الضوئي ، إلا أنها تشكلت في المكان المناسب وفي الوقت المناسب للمشاركة في استجابة الاستقطاب. وبالتالي ، فإن توطين NMII في خلايا T & # x02013APC لا يتعارض مع نموذجنا المقترح.

NPKCs تنظيم توطين NMII و Dynein.

بعد ذلك ، حققنا فيما إذا كانت إعادة عرض NMII و dynein المستحثة بواسطة TCR تتطلب تراكم DAG محلي. ألغى PMA ، الذي يخفي تأثيرات تدرجات DAG عن طريق إحداث إشارات DAG غير مستقطبة ، كل من إعادة تشكيل NMII و dynein في تجارب التنشيط الضوئي (الشكل 4). أ و ب ). هذا يعني دورًا حاسمًا لـ DAG المترجمة في تنظيم كلا المحركين.

يتم تنظيم عدم تناسق NMII و dynein بواسطة نشاط nPKC في اتجاه مجرى DAG. (أ و ب) الخلايا التائية (5C7) التي تعبر إما عن MyoRLC-GFP (أ) أو DynIC-GFP (ب) تم تنشيطها ضوئيًا وتصويرها في وجود 5 نانوغرام / مل من PMA أو التحكم في السيارة. يتم عرض التحديد الكمي لتخليص NMII وتجنيد dynein (ن & # x02265 8 خلايا لكل عينة). (ج& # x02013ه) تم نقل الخلايا التائية (5C.C7) المستمدة من PKC & # x003b8 & # x02212 / & # x02212 (& # x003b8KO) الفئران باستخدام MyoRLC-GFP مع shRNAs المشار إليها واستخدامها في تجارب التنشيط الضوئي. (ج) التحقق من صحة ضربة قاضية لـ shRNA بواسطة طخة مناعية ، مع & # x003b2 actin بمثابة عنصر تحكم في التحميل. NT ، عدم استهداف تحكم shRNA. (د) المونتاج الزمني التمثيلي الذي يقارن توزيع MyoRLC في خلايا & # x003b8KO مع أو بدون PKC & # x003b7 و PKC & # x003b5. يُشار إلى وقت تشعيع الأشعة فوق البنفسجية بنص أصفر ، ويُشار إلى المنطقة المشعة بدوائر صفراء. (أشرطة النطاق: 5 & # x003bcm.) (ه) التحديد الكمي لتصفية NMII من المنطقة المشعة في خلايا & # x003b8KO مع أو بدون PKC & # x003b7 و PKC & # x003b5 (ن & # x02265 10 خلايا لكل عينة). تم قياس ديناميكيات MyoRLC و DynIC كما في الشكل 3 ، مع وجود خطوط أرجوانية تشير إلى الأشعة فوق البنفسجية. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM.

تعزز DAG إعادة التوجيه المركزي من خلال تجنيد PKC & # x003b5 و PKC & # x003b7 و PKC & # x003b8 إلى IS (5). لتحديد ما إذا كانت هذه الكينازات مطلوبة للتوزيع المتبادل للدينين و NMII ، قمنا بمراقبة ديناميكيات MyoRLC-GFP و DynLC-GFP في الخلايا التائية التي تفتقر إلى مجموعات مختلفة من nPKCs. لم يؤثر القمع المتزامن لـ PKC & # x003b7 و PKC & # x003b5 ، اللذان يعملان بشكل متكرر في هذا المسار (5) ، على إزالة NMII من المنطقة المشععة (الشكل 4)ج والشكل S5أ). وبالمثل ، لم تظهر الخلايا المشتقة من الفئران PKC & # x003b8 & # x02212 / & # x02212 عيبًا كبيرًا في إعادة تشكيل NMII (الشكل 4) د و ه ). قمع PKC & # x003b7 و PKC & # x003b5 في خلفية خروج المغلوب PKC & # x003b8 ، ومع ذلك ، فقد ألغيت تمامًا ديناميكيات NMII (الشكل 4) د و ه والشكل S5ب). تم حظر تراكم Dynein في المنطقة المشععة أيضًا في الخلايا التي تفتقر إلى PKC & # x003b7 و PKC & # x003b5 و PKC & # x003b8 (الشكل S5) ج و د). أشارت هذه النتائج إلى أن نشاط nPKC ضروري لإعادة توطين كل من NMII و dynein. تمشيا مع هذا التفسير ، أدت التركيزات المنخفضة نسبيًا (500 نانومتر) لمثبط PKC ذو الخصوصية الواسعة G & # x000f66983 إلى تثبيط استنفاد NMII الناجم عن TCR وتراكم الدينين (الشكل S5) ه و F). مجتمعة ، توضح هذه النتائج أن PKC & # x003b7 و PKC & # x003b5 و PKC & # x003b8 تعمل بشكل متكرر لتنظيم NMII و dynein أثناء الاستقطاب المركزي.

لتقييم ما إذا كان نشاط PKC كافيًا للحث على إعادة تصميم NMII ، استخدمنا الفحص المجهري TIRF لمراقبة تأثيرات تحفيز PKC الحاد على توطين MyoRLC. تسبب PMA ، التي تنشط PKCs عالميًا ، في التشتت الدراماتيكي لألياف NMII القشرية في غضون ثوانٍ (الشكل 5).أ والفيلم S3). لقد حددنا عملية إعادة التنظيم هذه عن طريق حساب SD لـ MyoRLC مضان في كل خلية ، مما يعكس درجة تجميعها (الشكل 5).ب ). كان للتثبيط الحاد لنشاط PKC باستخدام G & # x000f66983 تأثير معاكس ، مما أدى إلى تعزيز تكوين كتلة NMII تحت الغشاء (الشكل 5). أ و ج والفيلم S4). كما عززت الإضافة المتزامنة لكل من PMA و G & # x000f66983 التجميع ، مما يشير إلى أن قمع الكتلة بواسطة PMA يتطلب نشاط PKC (الشكل 5) أ و د والفيلم S5). تشير هذه النتائج بقوة إلى أن فسفرة NMII بوساطة PKC تعزز انفصالها عن مجمعات الغشاء. ومن المثير للاهتمام ، أن الإضافة الحادة لـ PMA أو G & # x000f66983 لم يكن لها أي تأثير على التوزيع القشري للداينين ​​(الشكل S6) ، مما يعني أن التحفيز العالمي لـ PKCs غير كافٍ للحث على تجنيد dynein. ومن ثم ، في حين أن تنشيط PKC كافٍ لقمع تجمع NMII ، فمن المحتمل أن يكون تنظيم Dynein أكثر تعقيدًا.

يؤدي التنشيط أو تثبيط نشاط PKC الحاد إلى إعادة تشكيل NMII. تم تصوير الخلايا التائية (5C.C7) التي تعبر عن MyoRLC-RFP في TIRF وعولجت بـ 5 نانوغرام / مل من PMA أو 500 نانومتر G & # x000f66983 كما هو موضح أثناء الحصول على الفاصل الزمني. (أ) المونتاج الزمني التمثيلي ، مع إضافة الكواشف المشار إليها بالخط الأحمر. (أشرطة النطاق: 5 & # x003bcm.) (ب& # x02013د) تم تحديد كمية تجميع MyoRLC في الغشاء عن طريق حساب SD لإشارات الفلورة لكل خلية (ن = 10 خلايا لكل منحنى انظر أيضًا المواد والأساليب). يشار إلى وقت إضافة الكاشف من خلال الفجوة في كل منحنى. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM.

مواقع الفسفرة PKC داخل MyoRLC مطلوبة لقمع NMII.

تم الإبلاغ عن الفسفرة بوساطة PKC لـ MyoRLC في Ser1 و Ser2 لمنع وظيفة NMII (19 & # x0201322). للتحقيق في أهمية أحداث الفسفرة هذه لاستقطاب الجسيم المركزي ، قمنا بتحليل توطين بنية MyoRLC [MyoRLC (S1AS2A)] ، مواقع الفسفرة الطرفية N التي تم تحويرها إلى Ala. تراكمت MyoRLC (S1AS2A) في مجموعات تحت البلازما غشاء مشابه شكليًا للهياكل التي تحتوي على MyoRLC من النوع البري (الشكل 6أ ). ومع ذلك ، في حين أن التنشيط الضوئي قمع باستمرار تجميع MyoRLC من النوع البري في المنطقة المشععة ، كان استنفاد MyoRLC (S1AS2A) ضعيفًا بشكل ملحوظ (الشكل 6). أ و ب ).

يرتبط توظيف nPKC و MyoRLC بإعادة عرض NMII. (أ و بتم إجراء تجارب التنشيط الضوئي TCR باستخدام خلايا 5CC7 T معبرة إما عن النوع البري MyoRLC-GFP أو MyoRLC (S1AS2A) -GFP. (أ) المونتاج الزمني التمثيلي ، مع وقت تشعيع الأشعة فوق البنفسجية المشار إليه بنص أصفر. الدوائر الصفراء تشير إلى المنطقة المشعة. (ب) التحديد الكمي لتصفية MyoRLC من المنطقة المشعة (ن & # x02265 10 خلايا لكل عينة). (ج& # x02013Fتم إجراء تجارب التنشيط الضوئي TCR باستخدام خلايا 5CC7 T التي تعبر عن MyoRLC-GFP مع PKC & # x003b7-RFP (ج و د) أو PKC & # x003b8-RFP (ه و F). (ج و ه) المونتاج الزمني التمثيلي ، مع وقت تشعيع الأشعة فوق البنفسجية المشار إليه بنص أصفر. الدوائر الصفراء تشير إلى المنطقة المشعة. تم تصوير جميع المجسات في TIRF. (د و F) التحديد الكمي لتخليص MyoRLC وتوظيف nPKC في المنطقة المشعة (ن = 10 خلايا لكل عينة). تم إجراء التحليل كما في الشكل 3 ، مع وجود خطوط أرجوانية تشير إلى إشعاع فوق البنفسجي. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. (جميع أشرطة المقياس: 5 & # x003bcm.)

لتحديد ما إذا كان توطين nPKC متسقًا مع دور في إعادة عرض NMII ، أجرينا تجارب التنشيط الضوئي باستخدام الخلايا التائية التي تعبر عن MyoRLC المسمى بـ GFP جنبًا إلى جنب مع PKC & # x003b8 أو PKC المسمى بـ RFP أو PKC & # x003b7 المسمى RFP. تمشيا مع العمل السابق (5) ، تسبب التنشيط الضوئي لـ TCR في التراكم القوي لكل من PKC & # x003b7 و PKC & # x003b8 في المنطقة المعرضة للإشعاع (الشكل 6). ج& # x02013F والأفلام S6 و S7). ارتبط تجنيد PKC & # x003b7 و PKC & # x003b8 بشكل ملحوظ مع NMII في جميع النقاط الزمنية (الشكل S4أ) ، بما يتفق مع الفكرة القائلة بأن nPKCs تقمع تجميع NMII. قمنا أيضًا بفحص العلاقة بين نشاط PKC و NMII باستخدام شكل مشهور من Marcksl1 ، وهو بروتين مرتبط بالغشاء ينفصل عند الفسفرة بواسطة PKCs (5 ، 23). كما هو متوقع ، أدى التنشيط الضوئي للخلايا التائية التي تعبر عن Marcksl1 المسمى بـ GFP مع MyoRLC المسمى RFP إلى إزالة كلتا التركيبات من المنطقة المشععة (الشكل S7). أ و ب). استنفاد Marcksl1 يسبق فقدان NMII بواسطة & # x0223c8 s (الشكل S7ج). وبالتالي ، حدث تنشيط PKC الناجم عن TCR في الوقت والمكان المناسبين للتوسط في إعادة عرض NMII.

من المعروف أيضًا أن PKCs تنظم الهيكل الخلوي للأكتين (24). وبالتالي ، لا يزال من الممكن أن تكون ديناميكيات NMII التي لاحظناها ثانوية لإعادة تشكيل الأكتين القشري. للتحقيق في هذه الفرضية ، قمنا بتصوير الخلايا التائية التي تعبر عن MyoRLC المسمى بـ GFP جنبًا إلى جنب مع Lifeact المسمى RFP ، والذي يرتبط على وجه التحديد بالخيط (F) -actin (25). كشف الفحص المجهري TIRF عن توزيع مبقع لـ F-actin تحت غشاء البلازما الذي تحول خلال دورات التوسع الخلوي والانكماش (الشكل S8).أ). على الرغم من أن هذا F-actin يتحد جزئيًا مع MyoRLC ، إلا أن تكوين مجموعات NMII لم يكن مرتبطًا بتخصيب F-actin في نفس المناطق. ومن المثير للاهتمام ، أن التنشيط الضوئي لـ TCR تسبب في استنفاد F-actin من المنطقة المشععة. ومع ذلك ، حدثت استجابة النضوب هذه 24.9 & # x000b1 10.0 ثانية بعد فقدان NMII (الشكل S8) ب و ج) ، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن يكون الدافع وراء إعادة عرض NMII بواسطة الأكتين في هذا السياق.

درسنا أيضًا العلاقة بين NMII والأنابيب الدقيقة المحيطية عن طريق تصوير الخلايا التائية التي تعبر عن MyoRLC-RFP و GFP-tubulin. كشف الفحص المجهري TIRF أن الأنابيب الدقيقة القريبة من غشاء البلازما كانت ديناميكية للغاية ، مما أدى إلى تغيير طولها واتجاهها أثناء استجابات الاستقطاب. ومع ذلك ، لم يكن هناك ارتباط واضح بين هذه الديناميكيات وإعادة تشكيل NMII (الشكل S8د). علاوة على ذلك ، لم يتأثر تجمع NMII في الجزء الخلفي من الخلية بإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة باستخدام نوكودازول أو التثبيت باستخدام التاكسول (الشكل S8). ه و F). ومن ثم ، فإن إعادة تنظيم NMII تحدث بشكل مستقل عن الأنابيب الدقيقة.

مطلوب Rho-kinase لتجميع NMII.

ينشط Rho kinase (ويسمى أيضًا ROCK) NMII عن طريق فسفرة MyoRLC في Thr18 و Ser19 (12 ، 26). لاختبار ما إذا كان ROCK ينظم توطين NMII في نظامنا ، قمنا بمعالجة الخلايا التائية التي تعبر عن MyoRLC التي تحمل علامة GFP مع Y27632 ، وهو مثبط ROCK. تسبب Y27632 في تشتت مجموعات NMII القشرية في أقل من دقيقة ، على غرار تأثيرات PMA (الشكل 7). أ و ب والفيلم S8). لم يتم عكس هذا التشتت بواسطة G & # x000f66983 ، مما يشير إلى أن ROCK مطلوب لتثبيت NMII في غشاء البلازما ، حتى في حالة عدم وجود نشاط PKC (الشكل 7) أ و ب ). لقد درسنا أيضًا ما إذا كانت مواقع الفسفرة ROCK داخل MyoRLC و Thr18 و Ser19 مطلوبة لإعادة عرض NMII في تجارب التنشيط الضوئي. أدى تحور كل من البقايا إلى Ala إلى تقليل تكتل MyoRLC عند الغشاء (الشكل 7ج ) ، ولم يؤدي التنشيط الضوئي لـ TCR إلى تعزيز هذا التجميع أو إحداث عدم تناسق في توزيع NMII (الشكل 7). ج و د ). أشارت هذه البيانات معًا إلى أن الفسفرة بوساطة ROCK تدفع مجموعات NMII أثناء استجابات الاستقطاب. تمشيا مع هذا التفسير ، وجدنا أن Y27632 يؤخر إعادة توجيه الجسيم المركزي ويقلل أيضًا سرعة الجسيم المركزي القصوى (الشكل 7). ه و F ). نستنتج أن ROCK و nPKCs يؤسسان عدم تناسق NMII الاستقطاب في الخلايا التائية من خلال معارضة تنظيم الفسفرة لـ MyoRLC.

مطلوب ROCK لتكتل NMII خلف الجسيم المركزي. (أ و ب) تم تصوير الخلايا التائية (5C.C7) التي تعبر عن MyoRLC-RFP في TIRF وعولجت بـ 50 & # x003bcM Y27632 و 500 نانومتر G & # x000f66983 كما هو موضح أثناء الحصول على الفاصل الزمني. (أ) المونتاج الزمني التمثيلي ، مع إضافة الكواشف المشار إليها بالخط الأحمر. (ب) القياس الكمي لتكتل MyoRLC كما هو موضح في الشكل 5 (ن = 8 خلايا لكل منحنى). (ج و دتم إجراء تجارب التنشيط الضوئي باستخدام خلايا 5CC7 T معبرة عن النوع البري MyoRLC-GFP أو MyoRLC (T18AS19A) -GFP. (ج) المونتاج الزمني التمثيلي ، مع وقت تشعيع الأشعة فوق البنفسجية المشار إليه بنص أصفر. الدوائر الصفراء تشير إلى المنطقة المشعة. (د) تم قياس عدم تناسق MyoRLC كما هو موضح في الشكل 3 (ن & # x02265 10 خلايا لكل عينة). (ه و F) تم تقييم الاستقطاب المركزي في وجود 50 & # x003bcM Y27632 أو التحكم في السيارة كما هو موضح في الشكل 2. (جميع أشرطة المقياس: 5 & # x003bcm.) تشير الخطوط الأرجوانية في الرسوم البيانية إلى تشعيع الأشعة فوق البنفسجية ، وتشير أشرطة الخطأ إلى SEM. ص تم حساب القيم باستخدام Student ر اختبار. ***ص & # x0003c 0.001.


تغيير التاريخ

ويليامز ، ب.ر. & أمبير آمون ، أ. اختلال الصيغة الصبغية: الخلل القاتل للسرطان؟ الدقة السرطان. 69, 5289–5291 (2009).

Lengauer ، C. ، Kinzler ، K.W & amp Vogelstein ، B. عدم الاستقرار الجيني في السرطانات البشرية. طبيعة سجية 396, 643–649 (1998).

ستريبهاردت ، ك. كينازات شبيهة بالبولو متعددة الأوجه: أهداف دوائية ومضادات لعلاج السرطان. نات. القس اكتشاف المخدرات. 9, 643–660 (2010).

Petronczki ، M. ، Lenart ، P. & amp Peters ، J.M Polo في الارتفاع من الدخول الانقسامي إلى الانقسام الخلوي مع Plk1. ديف. زنزانة 14, 646–659 (2008).

سومارا ، إ. وآخرون. أدوار كيناز 1 الشبيه بالبولو في تجميع المغازل الانقسامية الوظيفية. بالعملة. بيول. 14, 1712–1722 (2004).

لينارت ، ب. وآخرون. يكشف مثبط الجزيء الصغير BI 2536 عن رؤى جديدة حول الأدوار الانقسامية للكيناز 1 الذي يشبه لعبة البولو. بالعملة. بيول. 17, 304–315 (2007).

Elowe، S.، Hummer، S.، Uldschmid، A.، Li، X. & amp Nigg، E. A. الفسفرة Plk1 الحساسة للتوتر على BubR1 ينظم استقرار تفاعلات الأنابيب الدقيقة الحركية. تطوير الجينات. 21, 2205–2219 (2007).

مايا ، إيه آر وآخرون. يتوسط كل من Cdk1 و Plk1 مفتاح تبديل فوسفوري CLASP2 يعمل على تثبيت ملحقات الأنابيب الحركية الدقيقة. J. خلية بيول. 199, 285–301 (2012).

ينظم Liu، D.، Davydenko، O. & amp Lampson، M.A Polo-like kinase-1 ديناميات kinetochore - microtubule وإسكات نقطة تفتيش المغزل. J. خلية بيول. 198, 491–499 (2012).

لي ، ك.س وآخرون. آليات توطين كيناز 1 (Plk1) الشبيه بالبولو للثدييات: ذاتي مقابل غير فتيلة ذاتية. دورة الخلية 7, 141–145 (2008).

إيليا ، إيه إي وآخرون. الأساس الجزيئي لاستهداف الركيزة المعتمدة على الفوسفات وتنظيم Plks بواسطة مجال Polo-box. زنزانة 115, 83–95 (2003).

Cheng، K. Y.، Lowe، E. D.، Sinclair، J.، Nigg، E.A & amp Johnson، L.N. التركيب البلوري لمجال لعبة البولو التي تشبه لعبة البولو البشرية kinase-1 ومركبها الببتيد الفوسفوري. EMBO J. 22, 5757–5768 (2003).

Hanisch ، A. ، Wehner ، A. ، Nigg ، E. A. & amp Sillje ، H. H. تظهر وظائف Plk1 المختلفة تبعيات مميزة على الاستهداف بوساطة مجال Polo-Box. مول. بيول. زنزانة 17, 448–459 (2006).

Nigg، E. A. Mitotic kinases كمنظمين لانقسام الخلايا ونقاط التفتيش الخاصة بها. نات. القس مول. خلية بيول. 2, 21–32 (2001).

ماتيو ، إف ، فيدال-لاليينا ، إم ، بوجول ، إم جيه آند أمبير باكس ، أو.أسيتيل سيكلين أ: آلية تنظيم دورة الخلية الجديدة. بيوتشيم. شركة عبر. 38, 83–86 (2010).

Hershko، A. نظام يوبيكويتين لتحلل البروتين وبعض أدواره في التحكم في دورة انقسام الخلية. موت الخلية يختلف. 12, 1191–1197 (2005).

سلاسل Li و W. & amp Ye و Y. سلاسل Polyubiquitin: الوظائف والهياكل والآليات. زنزانة. مول. علوم الحياة. 65, 2397–2406 (2008).

Deshaies ، R. J. SCF و cullin / ring H2-based ligases يوبيكويتين. Annu. القس الخلية ديف. بيول. 15, 435–467 (1999).

Petroski، M.D & amp Deshaies، R. J. وظيفة وتنظيم ليجاسيس كولين رينج يوبيكويتين. نات. القس مول. خلية بيول. 6, 9–20 (2005).

Sumara ، I. ، Maerki ، S. & amp Peter ، M. E3 ubiquitin ligases and metosis: احتضان التعقيد. اتجاهات خلية بيول. 18, 84–94 (2008).

سومارا ، إ. وآخرون. يزيل Ligase E3 القائم على Cul3 Aurora B من الكروموسومات الانقسامية ، وينظم التقدم الانقسامي وإكمال الحركية الخلوية في الخلايا البشرية. ديف. زنزانة 12, 887–900 (2007).

ميركي ، إس وآخرون. يستهدف Cul3-KLHL21 E3 ubiquitin ligase الشفق القطبي إلى الأنابيب الدقيقة في منتصف المنطقة في الطور وهو مطلوب للحركة الخلوية. J. خلية بيول. 187, 791–800 (2009).

Li، Y. & amp Benezra، R. تحديد جين نقطة تفتيش انقسامية بشرية: hsMAD2. علم 274, 246–248 (1996).

ينظم Sumara، I. & amp Peter، M. A Cul3-based E3 ligase الانقسام ومطلوب للحفاظ على نقطة تفتيش تجميع المغزل في الخلايا البشرية. دورة الخلية 6, 3004–3010 (2007).

Matsumura ، S. ، Toyoshima ، F. & amp Nishida ، E. Polo-like kinase 1 يسهل محاذاة الكروموسوم خلال مرحلة ما قبل الطور من خلال BubR1. J. بيول. تشيم. 282, 15217–15227 (2007).

جوزيف ، جيه ، ليو ، إس تي ، جابلونسكي ، إس إيه ، ين ، تي. في الجسم الحي. بالعملة. بيول. 14, 611–617 (2004).

كيم ، دبليو وآخرون. التقييم المنهجي والكمي للبروتين المعدل يوبيكويتين. مول. زنزانة 44, 325–340 (2011).

واجنر ، إس إيه وآخرون. مسح كمي على مستوى البروتين في الجسم الحي تكشف مواقع الانتشار في كل مكان عن أدوار تنظيمية واسعة النطاق. مول. بروتينات الخلية 10, 013284 (2011).

بارك ، ج. إي وآخرون. مجال البولو بوكس: وسيط متعدد الاستخدامات لوظيفة كيناز تشبه لعبة البولو. خلية مول. علوم الحياة. 67, 1957–1970 (2010).

موغي ، إس وآخرون. ينظم ligase CUL3-KLHL18 الدخول الانقسامي وينتشر في كل مكان Aurora-A. بيول. افتح 1, 82–91 (2012).

Pintard ، L. ، Willems ، A. & amp Peter ، M. Cullin-based ubiquitin ligases: مجمعات Cul3-BTB تنضم إلى العائلة. EMBO J. 23, 1681–1687 (2004).

Villeneuve ، N.F ، Lau ، A. & amp Zhang ، D. D. تنظيم استجابة مضادات الأكسدة Nrf2-Keap1 بواسطة نظام بروتوزوم يوبيكويتين: نظرة ثاقبة على ليغازات يوبيكويتين كولين الدائري. مضادات الأكسدة. الأكسدة والاختزال. الإشارة 13, 1699–1712 (2010).

Huotari ، J. et al. ينظم Cullin-3 النضج الداخلي المتأخر. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 109, 823–828 (2012).

بويدن ، إل م وآخرون. الطفرات في kelch-like 3 و cullin 3 تسبب ارتفاع ضغط الدم وشذوذ الكهارل. طبيعة سجية 482, 98–102 (2012).

يوان ، دبليو سي وآخرون. يستهدف مسار Cullin3-KLHL20 المعتمد على Ubiquitin ligase PML لتحفيز إشارات HIF-1 وتطور سرطان البروستاتا. الخلايا السرطانية 20, 214–228 (2011).

هرنانديز مونوز ، آي وآخرون. يتضمن تعطيل كروموسوم X المستقر مركب PRC1 Polycomb ويتطلب هيستون MACROH2A1 و CULLIN3 / SPOP ubiquitin E3 ligase. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 102, 7635–7640 (2005).

جين ، ل. وآخرون. التنظيم المعتمد على Ubiquitin لحجم ووظيفة طبقة COPII. طبيعة سجية 482, 495–500 (2012).

Howell ، B. J. et al. يحرك Dynactin / dynactin السيتوبلازمي نقل البروتين الحركي إلى أقطاب المغزل وله دور في تعطيل نقطة تفتيش المغزل الانقسامي. J. خلية بيول. 155, 1159–1172 (2001).

Varma، D.، Monzo، P.، Stehman، S.A & amp Vallee، R.B. J. خلية بيول. 182, 1045–1054 (2008).

Yang، Z.، Tulu، U. S.، Wadsworth، P. & amp Rieder، C.L. Kinetochore dynein مطلوب لحركة الكروموسوم والكونغرس المستقل عن نقطة تفتيش المغزل. بالعملة. بيول. 17, 973–980 (2007).

Bennett ، E. J. ، Rush ، J. ، Gygi ، S.P & amp Harper ، J.W. زنزانة 143, 951–965 (2010).

Musacchio، A. & amp Salmon، E.D. نقطة تفتيش تجميع المغزل في المكان والزمان. نات. القس مول. خلية بيول. 8, 379–393 (2007).

يون ، إس إم وآخرون. التحليلات الهيكلية والوظيفية للحد الأدنى من الببتيدات الفوسفاتية التي تستهدف مجال البولو بوكس ​​من كيناز 1 الشبيه بالبولو. نات. هيكل. مول. بيول. 16, 876–882 (2009).

Steigemann ، P. et al. تحمي نقطة تفتيش انفصال الشفق القطبي B من تيترابلويدز. زنزانة 136, 473–484 (2009).

بيلوف ، جي إيه وآخرون. زيادة ثنائية الاتجاه في نفاذية الغلاف النووي عند الإصابة بفيروس شلل الأطفال والتغيرات المصاحبة للمسام النووية. J. فيرول. 78, 10166–10177 (2004).

بيدريولي ، بي.جي وآخرون. تمثيل مفتوح شائع لبيانات قياس الطيف الكتلي وتطبيقه على أبحاث البروتينات. نات. التكنولوجيا الحيوية. 22, 1459–1466 (2004).

MacLean، B.، Eng، J. K.، Beavis، R.C & amp McIntosh، M. إطار عام لتطوير وتقييم خوارزميات تسجيل قاعدة البيانات باستخدام محرك البحث TANDEM. المعلوماتية الحيوية 22, 2830–2832 (2006).


ما الذي يجعل الخلايا الليمفاوية خلية بائية؟

تمت دراسة تطور الخلايا البائية في الفئران 24 والبشر 25 على نطاق واسع ، وإعادة الترتيب الوظيفي لمكان Ig هو شرط لا غنى عنه. يحدث هذا من خلال عملية عرضة للخطأ تنطوي على إعادة ترتيب اندماجي لمقاطع الجينات V و D و J في موضع السلسلة H ومقاطع الجين V و J في مواقع السلسلة L. 26 حصل سوسومو تونيغاوا على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 1987 لهذا الاكتشاف. في الفئران والبشر ، يحدث هذا بشكل أساسي في كبد الجنين ونخاع البالغين ، وبلغ ذروته في تطوير ذخيرة متنوعة من VDJ الوظيفيةح و VJإل إعادة ترتيب ترميز مستقبلات الخلايا البائية (BCR). ومع ذلك ، في الأنواع الأخرى (على سبيل المثال ، الدجاج والأرانب) يحدث تطوير ذخيرة Ig السابقة للمناعة بشكل أساسي في GALT ، ويستخدم تنويع المرجع آلية تحويل الجينات. 27،28 اكتشاف جينات تنشيط إعادة التركيب 1/2 (RAG-1/2) في أواخر الثمانينيات من قبل ديفيد بالتيمور وزملاؤه قدموا التفسير الآلي للخطوات الأولية لتكسير خيوط الحمض النووي في إعادة ترتيب مستقبلات الخلايا Ig و T (Schatz et al 29 and Oettinger et al 30).

يتميز التطور المبكر للخلايا B بإعادة الترتيب المنظم لمواضع السلسلة Ig H و L ، وتلعب بروتينات Ig نفسها دورًا نشطًا في تنظيم تطور الخلايا البائية. كان اكتشاف سلاسل L البديلة (SLCs) أمرًا محوريًا لفهم كيفية تنظيم التطور المبكر للخلايا البائية.تم تحديده في الأصل في خلايا سلالة الفئران B ، 32 SLC عبارة عن مغاير مغاير يتكون من بروتينين متميزين تم تحديدهما في الأصل λ5 و VpreB. يتزاوج هذان البروتينان مع سلسلة μ H لتشكيل ما يسمى بـ pre-BCR في الفئران والخلايا البشرية السابقة لـ B. 33 تنشأ خلايا ما قبل B من الخلايا السلفية (المؤيدة لـ B) التي لا تعبر عن ما قبل BCR أو Ig السطحي (الشكل 1). ما إذا كانت تفاعلات ما قبل BCR مع يجند (ق) يمكن أن تكون بمثابة حافز تكاثري وبالتالي توسيع خلايا ما قبل B مع إعادة ترتيب سلسلة وظيفية μ H لا يزال غير معروف. على الرغم من أنه قد تم وصف الروابط المحتملة قبل BCR ، فإن حل التركيب البلوري الحديث لشكل قابل للذوبان من قبل BCR البشري يشير إلى أن عملية oligomerization المستقلة عن الترابط هي آلية محتملة للإشارة السابقة لـ BCR. 36 بعد ذلك ، يعد تعبير BCR ضروريًا لتطور الخلايا البائية والبقاء على قيد الحياة في المحيط. 37

يتم التوسط في تنشيط الخلايا البائية المستحثة بالمستضد والتمايز في الأنسجة اللمفاوية الثانوية عن طريق التغيرات الديناميكية في التعبير الجيني التي تؤدي إلى تفاعل المركز الجرثومي (GC) (انظر القسم الخاص بنضج الخلايا البائية). يتميز تفاعل GC بالتمدد النسيلي ، وإعادة تركيب مفتاح الفصل (CSR) في موضع IgH ، والطفرة الجسدية المفرطة (SHM) لـ Vح الجينات ، والاختيار لزيادة تقارب BCR من أجل حاتمة المستضد الفريدة من خلال نضوج التقارب. تم عرض CSR ، المعروف أيضًا باسم تبديل النمط المتماثل ، لأول مرة في الدجاج. 38 بعد عقد من اكتشاف RAG1 / 2 ، أظهر هونجو وزملاؤه (Muramatsu et al 39) أن CSR و SHM يتم توسطهما بواسطة إنزيم معين من قبل التنشيط الناجم عن تنشيط سيتيدين ديميناز (AID). من المتوقع أن يتم إحداث تعبير B-cell AID في GCs حيث تحدث CSR و SHM. هناك نظريتان حول كيفية عمل AID لتعزيز تنويع الأجسام المضادة. يقترح أحدهم أن AID يقوم بوظيفة "تحرير RNA" - ليس مصدر نشاط hypermutator ، في حد ذاته ، ولكنه يتعاون مع بروتين آخر للتوسط في SHM. تفترض وجهة النظر الأكثر شيوعًا أن AID يشارك بشكل مباشر أكثر في إحداث طفرة في جينات IgH على مستوى الحمض النووي. 41 لسوء الحظ ، يمكن أن يكون إنشاء مجموعة متنوعة وقائية من Ig ضارًا لأن AID يمكن أن يتعاون مع إنزيمات أخرى لتوليد عمليات نقل الكروموسومات التي تنطوي على ج- myc وموضع IgH في بعض الأورام اللمفاوية للخلايا البائية. 42

يتطلب تطوير الخلايا الليمفاوية العمل المتضافر لشبكة من السيتوكينات وعوامل النسخ التي تنظم التعبير الجيني بشكل إيجابي وسلبي. إن الإنترلوكين 7 المشتق من الخلايا اللحمية النخاعية (IL-7) هو سيتوكين غير فائض لتطور خلايا الفئران B التي تعزز إعادة ترتيب V إلى DJ وتنقل إشارات البقاء / الانتشار. 43 يلعب FLT3-ligand و TSLP أدوارًا مهمة في تطور الخلايا البائية الجنينية. 24 لم يتم فهم السيتوكين (السيتوكين) الذي ينظم تطور الخلايا البائية البشرية جيدًا. 25 ومع ذلك ، فإن وجود أعداد طبيعية من الخلايا البائية المنتشرة في مرضى نقص المناعة الأولي الذين يعانون من طفرات في الجينات المشفرة لـ IL-7R يجادل بأن تطور الخلايا البائية في هذه المرحلة من الحياة لا يتطلب إشارات IL-7R. قد تكون تجربة الطبيعة مفيدة لمريض لديه طفرة فارغة في جين IL-7 ، ولكن لم يتم وصف مثل هذا المريض بعد. لا يزال السيتوكين (أو السيتوكينات) الذي يعزز نمو خلايا النخاع B في جميع مراحل الحياة البشرية غير معروف.

تنظم 10 عوامل نسخ متميزة على الأقل المراحل المبكرة من تطور الخلايا البائية ، مع أهمية E2A و EBF و Pax5 بشكل خاص في تعزيز التزام النسب B والتمايز. 45 Pax5 ، الذي يتميز في الأصل بقدرته على الارتباط بتسلسلات المحفز في مواضع Ig ، قد يكون أكثر عوامل النسخ متعددة الوظائف للخلايا البائية. 46 الفئران التي تعاني من نقص Pax5 لديها توقف في تطوير الخلايا البائية عند الانتقال من إعادة ترتيب DJ إلى VDJ. جاء اكتشاف مهم من اكتشاف أن Pax5 يمكن أن ينشط الجينات اللازمة لتطور الخلايا B وقمع الجينات التي تلعب أدوارًا حاسمة في تطوير الخلايا غير السلالة B. وهكذا ، فإن الخلايا المؤيدة لـ Pax5 التي تعاني من نقص Pax5 تمتلك القدرة على التكيف مع مصائر غير سلالة B وتتطور إلى سلالات أخرى مكونة للدم. 47 ينظم Pax5 أيضًا التعبير عن 170 جينًا على الأقل ، وعدد كبير منها مهم لإشارات الخلايا البائية ، والالتصاق ، وهجرة الخلايا البائية الناضجة. 46 شرطي باكس 5 يمكن أن يؤدي الحذف في خلايا الفئران B الناضجة إلى عدم التمايز إلى سلف مكون للدم غير ملتزم به والتمايز اللاحق إلى خلايا سلالة T في ظل ظروف معينة. من اللافت للنظر أن إلغاء وظيفة عامل النسخ الفردي هذا يمكن أن يؤدي إلى مثل هذا التغيير العميق في مصير النمو. أحد الأسئلة الواضحة هو ما إذا كان هذا التباين يحدث في الفئران العادية (أو البشر الأصحاء)؟ التعديلات في باكس 5 قد يكون للموضع أيضًا عواقب وخيمة على الفئران التي تفتقر إلى Pax5 كثيرًا ما تصاب بأورام ليمفاوية عالية الجودة. 48 علاوة على ذلك ، فإن ما يصل إلى 30٪ من الحالات التي تم تشخيصها حديثًا من سلالة B في مرحلة الطفولة كلها تأوي جسديًا PAX5 الطفرات ، التي تمثل بشكل أساسي عمليات الحذف أحادية الموازي. 49 يوفر هذا منظورًا جديدًا حول توقف النضج المعروف في التطور المبكر للخلايا البائية التي تميز جميع حالات الطفولة بشكل أساسي.


نتائج

رابطة الغشاء لـ Tiam1 مطلوبة للتجاذب بالغشاء

لقد أظهرنا سابقًا أن Tiam1 كامل الطول (FL1591) أو جزء كبير من COOH طرفي من بروتين Tiam1 (C1199) يتسبب في تحريض يعتمد على Rac1 لتضخم الغشاء في خلايا الخلايا الليفية NIH3T3 (Michiels et al. ، 1995). خطوط الخلايا NIH3T3 المنشأة التي تعبر عن أي من هذه البروتينات مسطحة وشبيهة بالظهارية وتحتوي على العديد من الكشكشة الغشائية (الشكل 1 ،ب) ، وهو النمط الظاهري الناجم أيضًا عن ترنسفكأيشن أو الحقن المجهري للركب المنشط بشكل أساسي (V12) Rac1 (Ridley et al. ، 1992 Michiels et al. ، 1995 Van Leeuwen et al. ، 1995). في المقابل ، فإن جزءًا أصغر من COOH من بروتين Tiam1 (C682) ، والذي يحتوي فقط على مجال DH ومجال PH المجاور ، لم يحفز هذا النمط الظاهري (الشكل 1 ،ج). كما يتضح من الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، كان بروتين C1199 Tiam1 الكبير المقطوع موجودًا في السيتوبلازم وتم تنسيقه مع F-actin في الكشكشة الغشائية (الشكل 1 ،ب). في المقابل ، يبدو أن بروتين C682 Tiam1 القصير يقتصر على السيتوبلازم (الشكل 1 ،ج). تحليلات اللطخة الغربية (انظر الشكل 4 ، الممرات 1–3) أشار إلى أن كلا البروتينين كانا سليمين ويتم التعبير عنهما بشكل متساوٍ. يشير هذا إلى أن الاختلاف في الأنماط الظاهرية التي تحدثها هذه البروتينات المبتورة ربما يكون ناتجًا عن توطين مختلف داخل الخلايا ، وليس بسبب الاختلافات في الاستقرار. أكد الفحص المجهري المناعي (immuno-EM) بالفعل أن بروتين C1199 Tiam1 موجود في السيتوبلازم وكذلك في غشاء الخلية وخاصة في الكشكشة الغشائية ، في حين أن بروتين C682 Tiam1 موجود بشكل حصري تقريبًا في السيتوبلازم (الشكل 2) . لذلك افترضنا أن توطين الغشاء لـ Tiam1 مطلوب للتحول المورفولوجي لخلايا NIH3T3 ، بما في ذلك تشكيل الكشكشة الغشائية.

NH2- مجال PH النهائي ضروري للتوطين الغشائي لـ Tiam1

للتحقيق في أي من المجالات المحفوظة في Tiam1 يحدد التوطين داخل الخلايا ، تم إجراء عمليات حذف صغيرة في كل من هذه المجالات داخل بنية C1199 (انظر الشكل 3 والمواد والطرق). تم التعبير عن هذه البروتينات الطافرة بشكل عابر في خلايا COS-7 لتحليل توطينها داخل الخلايا وقدرتها على تحفيز الغشاء. نتج عن ترنسفكأيشن من هذه التركيبات Tiam1 المتحولة في خلايا NIH3T3 نفس التغييرات المظهرية (غير معروضة). على الرغم من أن Tiam1 يتم التعبير عنه داخليًا في خلايا COS-7 وخلايا NIH3T3 ، إلا أن المستويات منخفضة جدًا بحيث لا يمكن تصورها بواسطة الكيمياء المناعية أو النشاف الغربي. إذا تم إحداث تغييرات النمط الظاهري عن طريق تعداء طفرات Tiam1 ، فقد تم العثور عليها في & gt80 ٪ من الخلايا المنقولة.

كما هو مبين في الشكل 3 ،ب، كان بروتين C1199 Tiam1 الذي يحمل حذفًا داخليًا صغيرًا في الجزء الطرفي COOH المحفوظ من مجال PH المجاور لـ DH (C1199-ΔPHc) لا يزال قادرًا على تحفيز الغشاء. كان هذا اكتشافًا غير متوقع منذ أن تداخلت عمليات الحذف في مجال PH المجاور لبروتينات GDS الأخرى في أدائها السليم (Hart et al. ، 1994 Whitehead et al. ، 1995ب) ، والطفرات في هذه المنطقة من مجال PH من β-Ark ألغت التفاعلات مع كل من Gβγ البروتينات والفوسفوليبيدات (Touhara et al. ، 1995). على النقيض من ذلك ، فإن بروتين C1199 Tiam1 مع حذف في مجال DH (C1199ΔDH) لا يؤدي إلى انتفاخ الغشاء (الشكل 3 ،ج) ، مما يدعم الوظيفة التحفيزية المقترحة سابقًا لمجال DH (Hart et al. ، 1994). لم يؤثر حذف معظم منطقة DHR (C1199-ΔDHR) على التجاذب (الشكل 3 ،د) ، مما يشير إلى أن مجال DHR غير مطلوب لتحريض الكشكشة الغشائية. ومع ذلك ، حذف صغير في NH2-مجال PH النهائي (C1199-ΔPHn) ، الذي يمكن مقارنته بالحذف الذي تم إجراؤه في مجال PH طرفي COOH ، تم إلغاء تكدس الغشاء تمامًا (الشكل 3 ،ه). أظهرت تحليلات اللطخة الغربية أن جميع البروتينات الطافرة كانت بالحجم المتوقع وتم التعبير عنها بمستويات مماثلة (انظر الشكل 4 ، الممرات 4–9) ، على الرغم من أنها أقل إلى حد ما من بروتين C1199 Tiam1. يستبعد هذا احتمال أن تكون هذه النتائج بسبب اختلافات كبيرة في استقرار البروتين. نستنتج أن كلاً من مجال DH التحفيزي و NH2يعد مجال PH المحيطي ضروريًا للتشويش الغشائي الناجم عن Tiam1.

أظهرت التحليلات المناعية- EM لخلايا COS المنقولة أن جميع البروتينات الطافرة كانت موجودة بالتساوي في السيتوبلازم وفي غشاء البلازما (الشكل 5) ، باستثناء C1199 Tiam1 المتحولة ، والتي تحتوي على حذف في NH2مجال PH الطرفي (C1199-ΔPHn). تم توطين هذا البروتين بشكل حصري تقريبًا في السيتوبلازم (الشكل 5 ،د) ، على غرار بروتين C682 Tiam1 (الشكل 2 ،ب). كان بروتين C1199-ΔDH Tiam1 ، الذي يحمل حذفًا في مجال DH التحفيزي ولا يؤدي إلى حدوث انتفاخ في الغشاء ، لا يزال قادرًا على الارتباط بغشاء البلازما (الشكل 5). ب). يوضح هذا بوضوح أن توطين غشاء Tiam1 ليس نتيجة لتحريض الغشاء. لذلك ، يمكن استنتاج أن NH2يعد مجال PH المحيطي ضروريًا لتوطين غشاء C1199 Tiam1 وأن ​​هذا التوطين الغشائي ضروري لتشكيل الكشكشة الغشائية.

NH2- مجال PH النهائي لـ Tiam1 يمكن استبداله وظيفيًا بمجال التعريب الغشائي c-Src ، ولكن ليس بواسطة مجالات PH أخرى

لتحديد ما إذا كان توطين الغشاء هو الوظيفة الوحيدة لـ NH2-مجال PH النهائي ، قمنا بدمج NH2محطة 20 من الأحماض الأمينية من c-Src ، تحتوي على موقع myristoylation ومنطقة أساسية ، أمام بروتين C580 Tiam1 ، مما أدى إلى M S -C580 Tiam1 (انظر المواد والطرق). يشمل C580 Tiam1 الأحماض الأمينية COOH-terminal 580 وترميز مجال DH ومجال PH المجاور (الشكل 6 ،أ). على غرار بروتين C682 Tiam1 (انظر الشكل 2 ،ب) ، فإن بروتين C580 Tiam1 لم يحرض على غشاء الغشاء ولم يكن موضعيًا في غشاء البلازما (الأشكال 6 ،أ و 7أ). في المقابل ، تسبب بروتين M S -C580 Tiam1 في حدوث تشوش في كل من خلايا NIH3T3 وخلايا COS-7 (الشكل 6 ،ب) ، وإن كان أقل انتشارًا من C1199 Tiam1 (الشكل 3 ،أ). لم يلاحظ أي اختلافات في مستويات التعبير عن هذه البروتينات (الشكل 4 ، الممرات 10–12). أظهر Immuno-EM أن M S -C580 Tiam1 كان قادرًا على الارتباط بغشاء البلازما (الشكل 7 ،ب) ، على الرغم من أن هذا البروتين يبدو أنه يقع داخليًا أكثر من بروتينات C1199 Tiam1 الطافرة (قارن الشكلين 5 و 7 ،ب). علاوة على ذلك ، كان جزء من بروتين M S -C580 Tiam1 المعبر عنه موجودًا حول الهياكل الشبيهة بالحويصلة في السيتوبلازم ، على غرار بروتينات الاندماج Tiam1 الأخرى التي تحتوي على M S (انظر على سبيل المثال الشكل 6). ه, أقحم). بروتين اندماج يحتوي على NH2كان مجال Src -terminal أمام بروتين C1199-ΔPHn Tiam1 قادرًا أيضًا على التوطين في غشاء البلازما والتسبب في حدوث تشوش (لا تظهر البيانات). وبالتالي فإن مجال توطين الغشاء Src يمكّن C580 Tiam1 و C1199-ΔPHn من تحفيز الغشاء عن طريق ربط هذه البروتينات بغشاء البلازما.

لاختبار ما إذا كان NH2- مجال PH النهائي لـ Tiam1 كافٍ لتوطين الغشاء ، قمنا بدمج منطقة تحتوي على مجال PH هذا لبروتين C580 Tiam1 (انظر المواد والطرق). ومع ذلك ، فإن البروتين الناتج لم يتسبب في حدوث تشوش في الأغشية ولم يكن مرتبطًا بغشاء البلازما (نتائج غير منشورة Michiels و F. و JC Stam). قد يجادل هذا بأن التسلسلات الإضافية مطلوبة لضمان توطين الغشاء. بدلاً من ذلك ، قد يتداخل تجاور مجال PH مع مجال DH مع الطي المناسب لهذه المجالات. بناء يعبر فقط عن المنطقة التي تحتوي على NH2- لم يعمل مجال PH النهائي كمتحول Tiam1 سالب سلبي. ومع ذلك ، فإن C1199-ΔDH ، الذي يحتوي على حذف في مجال DH التحفيزي ، لا يتداخل أيضًا مع تحريض الغشاء بواسطة Tiam1. سبب ذلك غير واضح في الوقت الحالي.

لتحليل خصوصية NH2-مجال PH النهائي لـ Tiam1 ، تم تبادل منطقة تحتوي على مجال PH هذا للمناطق المقابلة التي تحتوي على مجال PH لـ DbL ، أو مجال PH لـ β-ARK ، أو مجال COOHterminal PH لـ Tiam1 (انظر المواد والطرق). ومع ذلك ، لم يتم توطين أي من بروتينات Tiam1 الطافرة هذه في غشاء البلازما وتضخم الغشاء المستحث (البيانات غير معروضة). وهذا يعني إما أن التسلسلات الإضافية مطلوبة من أجل الأداء الصحيح لمجالات PH هذه أو أن الوظيفة الأساسية لـ NH2لا يمكن استبدال مجال PH الطرفي ، أي توطين Tiam1 من خلال تفاعلات محددة مع مكونات غشاء البلازما ، بمجالات PH أخرى.

NH2- مجال PH النهائي مطلوب لتحريض الكشكشة الغشائية بواسطة بروتين Tiam1 كامل الطول

يحمل بروتين Tiam1 كامل الطول (FL1591) تسلسل إجماع myristoylation في NH2 نهاية. من خلال وضع العلامات بـ [3 H] myristate ، تأكدنا من NH2 نهاية Tiam1 هي myristoylated (غير معروض). لاختبار ما إذا كانت myristoylation كافية لربط الغشاء لـ Tiam1 كامل الطول ، تم إجراء حذف صغير أيضًا في NH2-مجال PH النهائي لطول FL1591 Tiam1. ومع ذلك ، على غرار C1199-ΔPHn ، كان متحولة الطول الكامل Tiam1 (FL1591-ΔPHn) غير قادر على تحفيز الغشاء في خلايا NIH3T3 أو خلايا COS (الشكل 6 ، ج و د) ، وأظهر مناعي EM أن البروتين لم يتم توطينه في غشاء البلازما (البيانات غير معروضة). على ما يبدو ، NH2- العضل العضلي الطرفي لـ Tiam1 كامل الطول وحده لا يكفي لتوطين الغشاء. لإثبات هذا ، NH2تم دمج متواليات c-Src النهائية أمام بروتين FL1591-ΔPHn1 Tiam1. تحتوي هذه المنطقة من Src على منطقة أساسية مطلوبة لإزاحة الغشاء الأمثل بالإضافة إلى تسلسل myristoylation ، في حين أن كينازات التيروزين الأخرى الشبيهة بـ Src تحتوي على سيستين بالميتويل في هذه المنطقة (Superti-Furga and Courtneidge ، 1995). كلا التسلسلين الإضافيين غائبان في Tiam1. أظهرت الخلايا التي تعبر عن بروتين M S -FL1591-ΔPHn1 Tiam1 مرة أخرى انتفاخًا في الغشاء ، على الرغم من أنه أقل اتساعًا من الخلايا التي تعبر عن FL1591 Tiam1 (الشكل 6 ، C –E). مرة أخرى ، لم يلاحظ أي اختلافات رئيسية في مستويات التعبير بين هذه البروتينات (البيانات غير معروضة). أكد Immuno-EM أن بروتين M S -FL1591-ΔPHn1 Tiam1 كان موجودًا بالقرب من غشاء البلازما ، كما هو موجود في M S -C580 Tiam1 (البيانات غير معروضة). على ما يبدو ، فإن المنطقة الأساسية للملحق في c-Src تعمل أيضًا على توطين M S -FL1591ΔPHn1 Tiam1 بشكل صحيح. على غرار M S -C580 ، أدى التعبير عن M S FL1591-ΔPHn Tiam1 إلى تكوين هياكل صغيرة تشبه الحويصلة السيتوبلازمية ، وكان البروتين موجودًا أيضًا حول هذه الهياكل (الشكل 6). ه). تشير هذه الملاحظات إلى أن NH2يعمل مجال PH -terminal أيضًا كعلامة غشاء أساسية ، أو ربما مرساة غشائية ، لكامل الطول Tiam1.

التوطين الخلوي المتحكم به لـ Tiam1

تم تحديد مجالات PH في جزيئات تأشير أخرى مثل عناصر التفاعل بين البروتين والبروتين و / أو البروتين والفوسفوليبيد المطلوبة للاستهداف المضبوط لهذه البروتينات لغشاء البلازما (Lemmon et al. ، 1996). في أقسام الأنسجة من الجلد وبعض أنواع السرطان ، يوجد Tiam1 الداخلي في الغالب في السيتوبلازم. أيضًا في بعض خطوط الخلايا ، حيث يمكننا تخيل Tiam1 الداخلي عن طريق النشاف الغربي ، بما في ذلك خلايا T-lymphoma والخلايا العصبية ، يتم تحديده بشكل أساسي في الجزء السيتوبلازمي (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى أن Tiam1 قد ينتقل إلى غشاء البلازما بعد المستقبل تنشيط. ومع ذلك ، لم نتمكن حتى الآن من تحديد مسار تأشير بوساطة مستقبلات يتضمن تنشيط Tiam1. لاستكشاف ما إذا كان يمكن تصور انتقال غشاء Tiam1 الخارجي في خلايا NIH3T3 ، قمنا بتحليل ما إذا كان المصل يمكن أن يؤثر على توطين وقدرة Tiam1 للحث على الغشاء. كما هو مبين في الشكل 8 ،أ، أظهرت خلايا NIH3T3 التي تعبر بشكل عابر عن بروتين C1199 Tiam1 عدم وجود غشاء مزعج بعد تجويع المصل لمدة 24 ساعة. لم يكن هناك بروتين Tiam1 تقريبًا في غشاء البلازما ، وكان F-actin يتركز في الغالب في lamellipodia في الخلايا التي تعبر عن Tiam1. نظرًا لأن هذه المقاطع الضوئية تم التقاطها في الموقع الأساسي للخلايا لتوضيح الأرجل الصفائحية ، فإن ألياف الإجهاد تكون مرئية أيضًا. لاحظ أنه بعد تجويع المصل لمدة 24 ساعة ، لا تزال خلايا NIH3T3 تحتوي على بعض ألياف الإجهاد ، على عكس الخلايا السويسرية 3T3. أكد Immuno-EM أن معظم الخلايا تحتوي على كمية أقل من Tiam1 في غشاء البلازما بعد تجويع المصل (الشكل 8 ، د و F). قد يكون Tiam1 المرتبط بالغشاء كافياً لوجود lamellipodia في ظل هذه الظروف. إضافة توطين الغشاء الذي يسببه المصل والاضطراب اللاحق للخلايا التي تعبر عن C1199 Tiam1 بعد ساعتين (الشكل 8 ، ب و ه) ، وعند هذه النقطة تكون ألياف الإجهاد الناتجة عن المصل قد انخفضت بالفعل. ويرد تقدير كمي لهذه النتائج في الشكل 8 ،F. تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام FL1591 Tiam1 و C1199-ΔPHc و C1199ΔDHR Tiam1 (البيانات غير معروضة). في المقابل ، بعد 24 ساعة من تجويع المصل ، بقي بروتين M S -C580 Tiam1 في غشاء البلازما ولا يزال يتسبب في انتفاخ الغشاء (الشكل 8). ج). يشير هذا إلى أن إزاحة الغشاء الناجم عن المصل لـ Tiam1 يتم توسطها بواسطة NH2-مجال PH النهائي.

بشكل غير متوقع ، لا PDGF ولا الأنسولين يمكن أن يحل محل المصل في تحريض الغشاء (البيانات غير معروضة). يحفز كل من عاملي النمو تكوين lamellipodia في خلايا NIH3T3 في غضون 5 دقائق ، والتي يمكن تمييزها بسهولة عن الازدحام الناجم عن Tiam1. قد يشير هذا إلى أن Tiam1 لا يتم تنشيطه بواسطة PDGF أو الأنسولين.

Tiam1 المرتبط بالغشاء ينشط JNK

لاستكشاف ما إذا كان ارتباط الغشاء لـ Tiam1 مطلوبًا أيضًا لتحريض مسارات إشارات أخرى بوساطة Rac إلى جانب تشويش الغشاء ، تم تحديد نشاط JNK بعد انتقال العدوى مع طفرات Tiam1 المختلفة (انظر المواد والطرق). في كل من خلايا COS-7 وخلايا NIH3T3 ، أدى النقل المشترك للطول الكامل Tiam1 إلى تحفيز سبعة أضعاف تقريبًا لنشاط JNK ، على غرار التنشيط الأساسي (V12) Rac1 (الشكل 9 ،أ). لم ينتج عن نقل Cotransfection الخاص ببروتين كيناز منشط بالميتوجين (MAPK) مع Tiam1 كامل الطول أو متحولة Tiam1 أو (V12) Rac تنشيط MAPK (غير معروض). كان تحفيز JNK بواسطة Tiam1 يعتمد على تنشيط Rac ، نظرًا لأن النقل المشترك للسلبية المهيمنة (N17) Rac1 منع جزئيًا تنشيط JNK بواسطة Tiam1 (الشكل 9 ،أ). تداخلت كميات أكبر من (N17) Rac مع تعبير JNK. علاوة على ذلك ، منع الحذف في مجال DH التحفيزي لـ Tiam1 تنشيط JNK (غير معروض). لم يتداخل Cotransfection لـ Cdc42 السائد (N17) Cdc42 مع تنشيط JNK بواسطة Tiam1 (البيانات غير معروضة). حفز تعداء C1199 Tiam1 نشاط JNK إلى حد مماثل لـ FL1591 (الشكل 9 ،ب). ومع ذلك ، فإن شظايا COOH-terminal Tiam1 الأقصر مثل C682 و C580 Tiam1 ، والتي لم تتمركز في غشاء البلازما ، لم تكن قادرة على تنشيط JNK فوق مستويات الخلفية. أيضًا ، متحولة C1199-ΔPHn Tiam1 ، والتي لم تتمركز في غشاء البلازما بسبب الحذف في NH2-مجال PH النهائي ، غير قادر على تنشيط JNK (الشكل 9 ،ب). لم يتسبب M S -C580 Tiam1 في تحفيز نشاط JNK (الشكل 9 ،ب) ، وكذلك M S -C1199-ΔPHn أو M S -FL1591-ΔPHn Tiam1 (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، فإن هذه البروتينات تسببت في إثارة الغشاء وكانت موجودة في غشاء البلازما (الشكل 6). التفسير المحتمل لهذه النتيجة غير المتوقعة إلى حد ما هو أن تنشيط Rac الداخلي بواسطة M S الذي يحتوي على بروتينات Tiam1 كافٍ لتحريض الغشاء ولكن ليس لتحفيز JNK. بدلاً من ذلك ، يحدث نقص تحريض نشاط JNK بسبب توطين البنية التحتية المختلفة لبروتين M S -C580 Tiam1 (قارن الشكلين 5 و 7) أو قد يعكس الحاجة إلى NH سليم.2-مجال PH النهائي. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام p110 phosphoinositide-3-kinase الموجه للأغشية والذي كان قادرًا على تحفيز الغشاء ولكن ليس النسخ الجيني من محفز Jun-inducible Fos المروج (Reif et al. ، 1996). مهما كانت الآلية ، تشير هذه النتائج إلى أن توطين Tiam1 في غشاء البلازما مطلوب أيضًا لتحفيز نشاط JNK بوساطة Rac.


محتويات

تسمى الجزيئات الخاصة بالميكروبات التي يتعرف عليها PRR بالأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) وتشمل الكربوهيدرات البكتيرية (مثل عديدات السكاريد الدهنية أو LPS ، المانوز) ، الأحماض النووية (مثل الحمض النووي البكتيري أو الفيروسي أو الحمض النووي الريبي) ، والبكتيريا الببتيدات (السوط ، عوامل استطالة الأنابيب الدقيقة) ، الببتيدوغليكان والأحماض الدهنية (من البكتيريا موجبة الجرام) ، ن- الفورميل ميثيونين والبروتينات الدهنية والجلوكان الفطرية والكيتين.

تسمى إشارات الإجهاد الداخلية بالأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMPs) وتشمل حمض البوليك و ATP خارج الخلية ، من بين العديد من المركبات الأخرى. [2]

هناك عدة مجموعات فرعية من PRRs. يتم تصنيفها وفقًا لخصوصية الترابط والوظيفة و / أو التوطين و / أو العلاقات التطورية. بناءً على توطينها ، يمكن تقسيم PRRs إلى PRRs المرتبطة بالغشاء و PRRs السيتوبلازمية.

تحرير PRRs المرتبطة بالغشاء

تحرير كينازات المستقبل

تم اكتشاف PRRs لأول مرة في النباتات. [6] منذ ذلك الوقت ، تم التنبؤ بالعديد من معدلات الحد من مخاطر التلوث للنبات من خلال التحليل الجيني (370 في الأرز 47 في نبات الأرابيدوبسيس). على عكس PRRs الحيوانية ، التي ترتبط بالكينازات داخل الخلايا عبر بروتينات المحول (انظر كينازات غير RD أدناه) ، تتكون PRRs النباتية من مجال خارج الخلية ، مجال عبر الغشاء ، مجال juxtamembrane ومجال كيناز داخل الخلايا كجزء من بروتين واحد.

المستقبلات الشبيهة بالرصد (TLR) تحرير

يتم التوسط في التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة خارج الخلية أو من خلال بروتينات الغشاء المعروفة باسم المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLRs). [7] تشترك المستقبلات TLRs في فكرة هيكلية نموذجية ، التكرارات الغنية بـ Leucine (LRR) ، والتي تمنحها مظهرها الخاص وهي أيضًا مسؤولة عن وظائف TLR. [8] تم اكتشاف المستقبلات الشبيهة بالرسم لأول مرة في ذبابة الفاكهة وتحفيز تخليق وإفراز السيتوكينات وتفعيل برامج دفاع المضيف الأخرى الضرورية لكل من الاستجابات المناعية الفطرية أو التكيفية. تم وصف 10 أعضاء عاملين من عائلة TLR في البشر حتى الآن. [5] تم إجراء دراسات على TLR11 أيضًا ، وقد ثبت أنه يتعرف على البروتينات التي تشبه السلاجلين والبروفيلين في الفئران. [9] ومع ذلك ، فإن TLR11 ليس سوى جين زائف في البشر بدون وظيفة مباشرة أو تعبير بروتيني وظيفي. لقد ثبت أن كل TLR يتفاعل مع PAMP محدد. [5] [10] [11]

تحرير إشارات TLR

تميل TLRs إلى ثنائياتها ، وتشكل TLR4 أجهزة homodimers ، ويمكن أن تتضاءل TLR6 مع TLR1 أو TLR2. [10] يتم التوسط في تفاعل المستقبلات TLRs مع PAMP الخاص بها من خلال المسار المعتمد على MyD88 ويطلق الإشارات من خلال مسار NF-κB ومسار كيناز MAP وبالتالي إفراز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والجزيئات التنشيطية المشتركة أو الإشارات المعتمدة على TRIF مسار. [2] [5] [10] يتم تحفيز المسار المعتمد على MyD88 بواسطة العديد من PAMPs التي تحفز TLRs على البلاعم والخلايا التغصنية. يجذب MyD88 جزيء IRAK4 ، ويقوم IRAK4 بتجنيد IRAK1 و IRAK2 لتشكيل مجمع إشارات. يتفاعل مجمع الإشارات مع TRAF6 مما يؤدي إلى تنشيط TAK1 وبالتالي تحريض السيتوكينات الالتهابية. يتم تحفيز المسار المعتمد على TRIF بواسطة الضامة و DCs بعد تحفيز TLR3 و TLR4. [2] تم إطلاق الجزيئات بعد إشارة تنشيط TLR إلى خلايا أخرى من جهاز المناعة مما يجعل TLRs عناصر أساسية للمناعة الفطرية والمناعة التكيفية. [2] [12] [13]

مستقبلات لكتين من النوع C (CLR) تحرير

تعبر العديد من الخلايا المختلفة للجهاز المناعي الفطري عن عدد لا يحصى من CLRs التي تشكل المناعة الفطرية بحكم قدرتها على التعرف على الأنماط. [14] على الرغم من أن معظم فئات مسببات الأمراض البشرية مغطاة بـ CLRs ، فإن CLRs هي مستقبل رئيسي للتعرف على الفطريات: [15] [16] ومع ذلك ، تم تحديد PAMPs الأخرى في الدراسات كأهداف لـ CLRs أيضًا على سبيل المثال المانوز هو حافز التعرف على العديد من الفيروسات والفطريات والمتفطرات وبالمثل ، فإن الفوكوز يقدم نفس الشيء بالنسبة لبعض البكتيريا والديدان الطفيلية والجلوكان الموجودة على الفطريات والفطريات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الأسطح غير الذاتية المكتسبة على سبيل المثال المستضدات الجديدة السرطانية المضغية / الورمية التي تحمل "مصدر خطر داخلي" / نمط الممرض من النوع "تحول ذاتيًا غير ذاتي" يتم تحديدها أيضًا وتدميرها (على سبيل المثال عن طريق التثبيت المكمل أو الهجمات السامة للخلايا الأخرى) أو عزلها (ملتهمة أو مغلفة) بواسطة جهاز المناعة بحكم CLRs. يعتبر اسم لكتين مضللًا بعض الشيء لأن العائلة تحتوي على بروتينات ذات مجال واحد على الأقل من النوع C (CTLD) وهو نوع معين من مجال التعرف على الكربوهيدرات. CTLD هو نموذج ربط يجند موجود في أكثر من 1000 بروتين معروف (أكثر من 100 بروتين في البشر) وغالبًا ما تكون الروابط ليست سكريات. [17] إذا كان اللجند عبارة عن سكر ، فإنهم يحتاجون إلى Ca2 + - ومن هنا جاء اسم "C-type" ، لكن العديد منهم لا يمتلك حتى رابطة سكر معروفة ، وبالتالي على الرغم من حمل بنية أضعاف نوع الليكتين ، فإن بعضها من الناحية الفنية ليس "محاضرة" في الوظيفة.

تحرير إشارات CLR

هناك عدة أنواع من الإشارات المتضمنة في الاستجابة المناعية التي تسببها CLRs ، وقد تم تحديد اتصال رئيسي بين إشارات TLR و CLR ، وبالتالي فإننا نفرق بين الإشارات المعتمدة على TLR والإشارات المستقلة عن TLR. DC-SIGN المؤدية إلى سلسلة RAF1-MEK-ERK ، وإشارات BDCA2 عبر ITAM والإشارات من خلال ITIM تنتمي بين الإشارات المعتمدة على TLR. تؤدي الإشارات المستقلة عن TLR مثل Dectin 1 و Dectin 2 - mincle إلى تنشيط MAP kinase و NFkB. [18] [15]

تم تقسيم CLRs لمستقبلات الغشاء إلى 17 مجموعة بناءً على التركيب والأصل النشئي. [19] بشكل عام هناك مجموعة كبيرة تتعرف على الكربوهيدرات وتربطها ، وتسمى مجالات التعرف على الكربوهيدرات (CRDs) و CTLDs المذكورة سابقًا.

يمكن أن يكون التوصيف المحتمل الآخر لـ CLRs في مستقبلات مانوز ومستقبلات بروتين أسيوجليكوبروتين. [18]

المجموعة الأولى CLRs: تحرير مستقبلات المانوز

مستقبل مانوز (MR) [20] هو PRR موجود بشكل أساسي على سطح الضامة والخلايا التغصنية. إنه ينتمي إلى مجموعة CRD المتعددة المعتمدة على الكالسيوم. [15] ينتمي MR إلى مجموعة بروتين مستقبلات multilectin ، ومثل TLRs ، يوفر رابطًا بين المناعة الفطرية والتكيفية. [21] [22] يتعرف على وحدات مانوز المتكررة على أسطح العوامل المعدية ويرتبط بها ويؤدي تنشيطها إلى حدوث عملية الالتقام الخلوي والبلعمة للميكروب عبر النظام التكميلي. على وجه التحديد ، يؤدي ربط المانوز إلى تجنيد بروتياز السيرين المرتبط بـ MBL (MASPs). تنشط بروتينات السيرين نفسها في سلسلة ، مما يضخم الاستجابة المناعية: تتفاعل MBL مع C4 ، وتربط الوحدة الفرعية C4b وتطلق C4a في مجرى الدم بشكل مشابه ، ويؤدي ارتباط C2 إلى إطلاق C2b. تُعرف MBL و C4b و C2a معًا باسم C3 convertase. ينقسم C3 إلى وحدتيه الفرعية a و b ، ويربط C3b المحول. هذه معًا تسمى C5 convertase. وبالمثل مرة أخرى ، يكون C5b ملزمًا ويتم تحرير C5a. يقوم C5b بتجنيد C6 و C7 و C8 و C9s المتعددة. تشكل C5 و C6 و C7 و C8 و C9 مجمع هجوم الغشاء (MAC).

المجموعة الثانية CLRs: عائلة مستقبلات البروتين الأسيوجليكوبروتين تحرير

هذه عائلة كبيرة أخرى من CLRs تتضمن

  1. مستقبلات البلاعم الكلاسيكية من نوع الجالاكتوز (MGL) (CLEC4L) (CLEC4K) (CLEC5A).
  2. DC ‑ المرتبط بـ C نوع محاضرة 1 (Dectin1) عائلة فرعية تشمل
      / CLEC7A / CLEC9A
  3. (MICL) (CLEC12A) من النوع النخاعي C
  4. CLEC2 (ويسمى أيضًا CLEC1B) - مستقبل تنشيط الصفائح الدموية للبودوبلانين على الخلايا البطانية اللمفاوية وغزو بعض السرطانات.
    1. / CLEC4A / CLEC6A
    2. مستضد الدم DC 2 (BDCA2) (CLEC4C) ، أي الضامة ‑ المستحثة من النوع C (CLEC4E)

    المصطلح (مانوز مقابل بروتين أسيوجليكوبروتين) مضلل بعض الشيء لأن هذه المستقبلات للبروتين الأسيوجليكوبروتين ليست بالضرورة جالاكتوز (أحد أكثر المخلفات الخارجية شيوعًا للبروتين الجليكوبروتين الأسيالو) وحتى العديد من أفراد هذه العائلة يمكنهم أيضًا الارتباط بمانوز بعد ذلك تم تسمية المجموعة.

    تحرير PRRs السيتوبلازمية

    تحرير مستقبلات تشبه NOD (NLR)

    لمزيد من التفاصيل ، راجع NOD-like receptor.

    المستقبلات الشبيهة بـ NOD (NLRs) هي بروتينات حشوية تتعرف على الببتيدوغليكان البكتيري وتزيد من الاستجابة المناعية المسببة للالتهابات والمضادة للميكروبات. [23] تم العثور على ما يقرب من 20 من هذه البروتينات في جينوم الثدييات وتشمل مجال قليل القلة المرتبط بالنيوكليوتيدات (NODs) ، والذي يربط نوكليوزيد ثلاثي الفوسفات. من بين البروتينات الأخرى الأكثر أهمية: معاملات MHC Class II (CIITA) ، IPAF ، BIRC1 إلخ. [24]

    تحرير إشارات NLR

    تتعرف بعض هذه البروتينات على الجزيئات الذاتية أو الميكروبية أو استجابات الإجهاد وتشكل أوليغومرات التي ، في الحيوانات ، تنشط الكاسبيسات الالتهابية (مثل كاسباس 1) مما يتسبب في انشقاق وتنشيط السيتوكينات الالتهابية المهمة مثل IL-1 ، و / أو تنشيط NF-B مسار الإشارات للحث على إنتاج الجزيئات الالتهابية.

    تُعرف عائلة NLR بالعديد من الأسماء المختلفة ، بما في ذلك عائلة CATERPILLER (أو CLR) أو NOD-LRR. [24] [25] أهم أعضاء NLRs هم NOD1 و NOD2. إنهم يستشعرون الببتيدوغليكان الميكروبي المحفوظ في سيتوبلازم الخلية ، وبالتالي يمثلون مستوى آخر من الاستجابة المناعية بعد المستقبلات المرتبطة بالغشاء مثل TLRs و CLRs. [23] هذه العائلة من البروتينات تتوسع بشكل كبير في النباتات ، وتشكل مكونًا أساسيًا من مكونات الجهاز المناعي للنبات. [26]

    تحرير NODs
    تحرير NLRPs
    تحرير NLRs الأخرى

    مستقبلات تشبه RIG-I (RLR) تحرير

    تم وصف ثلاث مروحيات RLR حتى الآن: RIG-I و MDA5 (مع التعرف على 5'triphosphate-RNA و dsRNA ، على التوالي) ، والتي تنشط الإشارات المضادة للفيروسات ، و LGP2 ، الذي يبدو أنه يعمل كمثبط سلبي مهيمن. تبدأ RLRs في إطلاق السيتوكينات الالتهابية والنوع الأول من الإنترفيرون (IFN I). [2]

    تحرير إشارات RLR

    RLRs ، عبارة عن مروحيات RNA ، والتي ثبت أنها تشارك في التعرف داخل الخلايا على الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة (ds) والفيروسي الذي تقطعت به السبل والذي يجند عوامل عبر نطاقات N-terminal CARD المزدوجة لتنشيط برامج الجينات المضادة للفيروسات ، والتي يمكن استغلالها في علاج عدوى فيروسية. [32] [33] لقد تم اقتراح أن البرنامج الرئيسي المضاد للفيروسات الذي يسببه RLR يعتمد على نشاط ATPase. [34] غالبًا ما تتفاعل RLRs وتخلق حديثًا متبادلًا مع TLRs في الاستجابة المناعية الفطرية وفي تنظيم الاستجابة المناعية التكيفية. [35]

    مسار الإشارات بوساطة RIG-I و Mda5.

    تحتوي النباتات على عدد كبير من PRRs التي تشترك في تشابه هيكلي ووظيفي ملحوظ مع drosophila TOLL و TLRs للثدييات. كان أول PRR تم تحديده في النباتات أو الحيوانات هو بروتين Xa21 ، مما يمنح مقاومة لمسببات الأمراض البكتيرية سالبة الجرام Xanthomonas oryzae الكهروضوئية. اوريزي. [6] [36] منذ ذلك الوقت ، تم عزل نباتين آخرين PRRs ، Arabidopsis FLS2 (فلاجيلين) و EFR (مستقبل عامل الاستطالة Tu). [37] تم تحديد PAMPs المقابلة لـ FLS2 و EFR. [37] عند التعرف على الترابط ، تنقل PRRs النباتية "المناعة المحفزة بـ PAMP" (PTI). [38] تقوم أجهزة المناعة النباتية أيضًا بتشفير بروتينات المقاومة التي تشبه مستقبلات NOD (انظر أعلاه) ، والتي تتميز بمجالات NBS و LRR ويمكنها أيضًا أن تحمل مجالات تفاعل أخرى محفوظة مثل المجال السيتوبلازمي لـ TIR الموجود في مستقبلات تول وإنترلوكين. [39] البروتينات NBS-LRR مطلوبة من أجل المناعة المحفزة للمستجيب (ETI).

    عادةً ما ترتبط PRRs بأعضاء مجموعة أحادية النواة من كينازات تسمى عائلة كيناز المرتبطة بمستقبلات إنترلوكين -1 (IRAK) والتي تشمل ذبابة الفاكهة بيلي ، و IRAKs البشرية ، والأرز XA21 و Arabidopsis FLS2. في الثدييات ، يمكن أن ترتبط PRR أيضًا بأعضاء من عائلة كيناز البروتين المتفاعل مع المستقبل (RIP) ، الأقارب البعيدين لعائلة IRAK. تندرج بعض كينازات عائلة IRAK و RIP في فئة وظيفية صغيرة من كينازات تسمى non-RD ، وكثير منها لا يفسد حلقة التنشيط تلقائيًا. كشفت دراسة استقصائية عن الخميرة والذباب والديدان والإنسان وأرابيدوبسيس وحينيات الأرز (3723 كينازات) أنه على الرغم من قلة عدد كينازات غير RD في هذه الجينومات (9٪ -29٪) ، فإن 12 من 15 كينازات معروفة أو متوقعة لتعمل في إشارات PRR تندرج في فئة non-RD. في النباتات ، تنتمي جميع PRRs المميزة حتى الآن إلى فئة non-RD. تشير هذه البيانات إلى أن الكينازات المرتبطة بـ PRR يمكن التنبؤ بها إلى حد كبير من خلال عدم وجود بقايا واحدة محفوظة وتكشف عن فصائل فرعية جديدة محتملة لـ PRR. [40] [41]

    لا يظل عدد من PRRs مرتبطًا بالخلية التي تنتجها. المستقبلات المكملة ، التجميعات ، الفيكولين ، البنتراكسينات مثل الأميلويد المصل والبروتين التفاعلي C ، نقل الدهون ، بروتينات التعرف على الببتيدوغليكان (PGRPs) [42] و LRR ، XA21D [43] كلها بروتينات مُفرزة. أحد المجموعات المهمة جدًا هو الليكتين المرتبط بالمانان (MBL) ، وهو PRR رئيسي للجهاز المناعي الفطري الذي يرتبط بمجموعة واسعة من البكتيريا والفيروسات والفطريات والأوليات. تتعرف MBL في الغالب على مجموعات معينة من السكر على سطح الكائنات الحية الدقيقة ولكنها تربط أيضًا الدهون الفوسفورية والأحماض النووية والبروتينات غير الجليكوزيلية. [44] بمجرد ربط أوليغومرات MBL و Ficolin بالروابط ، تقوم بتجنيد MASP1 و MASP2 وبدء مسار المحاضرة لتنشيط المكمل الذي يشبه إلى حد ما المسار التكميلي الكلاسيكي.

    أجرت المجموعات البحثية مؤخرًا بحثًا مكثفًا حول المشاركة والاستخدام المحتمل لجهاز المناعة لدى المريض في علاج الأمراض المختلفة ، ما يسمى بالعلاج المناعي ، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، والعلاجات المناعية غير النوعية ، والعلاج بالفيروسات الورمية ، وعلاج الخلايا التائية ، ولقاحات السرطان. . [45] ارتبط NOD2 من خلال فقدان واكتساب الوظيفة بتطور مرض كرون والساركويد المبكر. [23] [46] الطفرات في NOD2 بالتعاون مع العوامل البيئية تؤدي إلى تطور التهاب مزمن في الأمعاء. [23] [47] لذلك ، تم اقتراح علاج المرض عن طريق تثبيط الجزيئات الصغيرة القادرة على تعديل إشارات NOD2 ، وخاصة RIP2. تمت الموافقة على علاجين من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية حتى الآن لمنع الفسفرة في RIP2 ، وهو أمر ضروري لعمل NOD2 السليم ، gefitinib و erlotinib. [48] ​​[49] بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء بحث على GSK583 ، مثبط RIP2 عالي التحديد ، والذي يبدو واعدًا للغاية في تثبيط إشارات NOD1 و NOD2 وبالتالي الحد من الالتهاب الناجم عن مسارات إشارات NOD1 و NOD2. [50] الاحتمال الآخر هو إزالة مستشعر NOD2 ، والذي ثبتت فعاليته في نماذج الفئران في محاولة لقمع أعراض مرض كرون. [51] مثبطات الكيناز من النوع الثاني ، وهي محددة للغاية ، أظهرت نتائج واعدة في منع عامل نخر الورم الناشئ عن المسارات المعتمدة على NOD ، والتي تُظهر إمكانات عالية في علاج الأورام المصاحبة للالتهاب. [52]

    هناك استغلال آخر محتمل لـ PRRs في الطب البشري مرتبط أيضًا بالأورام الخبيثة للأمعاء. هيليكوباكتر بيلوري أثبتت الدراسات أنه يرتبط ارتباطًا وثيقًا بتطور أورام الجهاز الهضمي. في الفرد السليم هيليكوباكتر بيلوري يتم استهداف العدوى من خلال مجموعة من PRRs ، وهي TLRs و NLRs و RLRs و CLR DC-SIGN. في حالة حدوث خلل وظيفي ، تم ربط هذه المستقبلات أيضًا بالتسرطن. عندما هيليكوباكتر بيلوري تُترك العدوى لتتطور في الأمعاء وتتطور إلى التهاب مزمن وضمور وفي النهاية خلل التنسج مما يؤدي إلى تطور السرطان. نظرًا لأن جميع أنواع PRR تلعب دورًا في تحديد العدوى والقضاء عليها ، فإن ناهضاتها المحددة تصنع استجابة مناعية قوية للسرطانات والأمراض الأخرى المرتبطة بـ PRR. لقد ثبت أن تثبيط TLR2 يرتبط ارتباطًا وثيقًا بتحسن حالة المريض وقمع سرطان المعدة الغدي. [53]

    ترتبط PRRs أيضًا ارتباطًا وثيقًا بالوظيفة المناسبة للشبكات والأنسجة العصبية ، خاصة بسبب مشاركتها في عمليات الالتهاب ، والتي تعتبر ضرورية للوظيفة المناسبة ولكنها قد تسبب أضرارًا لا يمكن إصلاحها إذا لم يتم التحكم فيها. يتم التعبير عن المستقبلات TLRs في معظم خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورًا مهمًا في الالتهاب العقيم. بعد الإصابة ، تؤدي إلى ضعف نمو المحور العصبي وتبطئ أو حتى توقف الانتعاش تمامًا.الهيكل المهم الآخر المتضمن في العلاج بعد الإصابة والذي يحتمل أن يكون قابلاً للاستغلال هو الجسيم الملتهب. من خلال تحريض السيتوكينات المنشطة للالتهابات ، IL-1β و IL-18 ، تم اقتراح أن تثبيط التهاب الجسد قد يكون أيضًا وسيلة علاجية فعالة. [54] كما تم بحث تورط الجسيم الملتهب في العديد من الأمراض الأخرى بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ومرض الزهايمر ومرض باركنسون وتصلب الشرايين المرتبط بمرض السكري من النوع الثاني في المرضى. تشمل العلاجات المقترحة تحلل NLRP3 أو تثبيط السيتوكينات المسببة للالتهابات. [54]


    ملاحظات ختامية

    استنادًا إلى البيانات التي تمت مناقشتها في هذه المراجعة ، نقترح أن الحفظ التطوري لاثنين من أذرع تجنيد CPC المركزية تضمن تراكم كميات كافية من Aurora B النشط بالقرب من kinetochores. نقترح أنه يجعل نظام تصحيح الخطأ KT-MT قويًا ، مما يجعل تقسيم الخلايا أكثر مرونة للظروف التي من شأنها إضعاف نقطة التفتيش الانقسامية أو التي من شأنها زيادة فرصة الحصول على مرفقات KT-MT الخاطئة ، مثل الاضطرابات في هندسة المغزل الانقسامي (Ertych et al. ، 2014). بمعنى آخر ، قد يحافظ على إخلاص فصل الكروموسوم في المواقف الشاذة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يظل توطين السنترومير الداخلي لـ Aurora B مناسبًا للتحكم في حالة الفسفرة لعدد من ركائز الحركية الخارجية ، ولكن ليس جميعها. من المحتمل أن يعتمد هذا أيضًا على تنظيم الفوسفاتيز الذي يزيل الفسفرة ركيزة معينة. إذا كان الفوسفاتيز المعادي موجودًا في الحركية بكميات عالية نسبيًا ، فقد يكون للتغيير الطفيف في مسافة الركيزة كيناز تأثير كبير على حالة الفسفرة في الركيزة. أخيرًا ، فإن إدراك أن وحدة CEN في CPC تقوي تماسك centromere وتشارك في تجميع kinetochore الداخلي يفتح إمكانية أن يتطلب & # x0201Cactivity & # x0201D من وحدة CEN توطين مركزي داخلي.


    نقاش

    في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في أدوار المنطقتين N و C من P4-ATPases فيما يتعلق بتوطينها الخلوي. الأهم من ذلك ، وجدنا أن مناطق NT لعائلة ATP10 ومناطق التصوير المقطعي المحوسب لعائلة ATP11 ضرورية لتوطينها الخلوي ، مما يشير إلى أن هذه المناطق السيتوبلازمية تتضمن استهداف غشاء محدد و / أو إشارات احتفاظ. علاوة على ذلك ، فإن الطرف N لـ ATP10B والطرف C لـ ATP11B يعملان كإشارات استهداف داخلية لهذه الإنزيمات. مطلوب N-termini لـ ATP9B و ATP13A2 ، P5-ATPase ، من أجل Golgi والتوطين الداخلي المتأخر ، على التوالي (Takatsu وآخرون.، 2011 هولمانز وآخرون.، 2015). علاوة على ذلك ، فإن N-termini لـ ATP9B و ATP13A2 وحدها كافية لتوطينها من خلال تفاعلها مع أغشية عضيات معينة. ومع ذلك ، فإن الطرف N لـ ATP10B والنهاية C لـ ATP11B لم تكن كافية لاستهداف أغشية داخلية معينة لأن N- و C-termini بقيت موزعة في العصارة الخلوية عند التعبير عنها بمفردها (الشكل التكميلي S1). على النقيض من ذلك ، عندما يستهدف غشاء البلازما لين11 تم دمج التسلسل مع ATP10B-NT أو ATP11B-CT ، وأصبحت التركيبات الكيميرية مترجمة إلى مقصورات داخلية محددة (الإندوسومات المتأخرة أو الإندوسومات المبكرة / إعادة التدوير ، على التوالي) ولكن ليس لغشاء البلازما. لذلك ، من المحتمل أن يكون ATP10B-NT و ATP11B-CT بمثابة إشارات تهريب داخل الخلايا واستهداف لتوجيه البروتينات من غشاء البلازما إلى مقصورات داخلية محددة. العديد من بروتينات الغشاء التي تتمركز في الأجزاء داخل الخلايا ، بما في ذلك مستقبلات المصباح 1 و TGN46 ومستقبلات مانوز 6-فوسفات ، وهي دورة بين غشاء البلازما والإندوسومات (Dell’Angelica وآخرون.، 1999 إيشيزاكي وآخرون.، 2008 ناكاي وآخرون.، 2013) ، و ATP11A و ATP11C ، التي تتمركز في غشاء البلازما ، وتتنقل أيضًا بين غشاء البلازما والداخلية (Steinberg وآخرون.، 2013 تاكاتسو وآخرون.، 2017). يتم تقليل التعبير السطحي للخلية لـ ATP11A و ATP11C في الخلايا المستنفدة SNX27- أو VPS35 (Steinberg وآخرون.، 2013). وهكذا ، ينظم SNX27 ومجمع retromer إعادة تدوير ATP11A و ATP11C من الإندوسومات إلى غشاء البلازما. مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن حركة مرور ATP10B و ATP11B بين الأجزاء داخل الخلايا وغشاء البلازما ، ولديها استهداف داخلي و / أو إشارة استبقاء داخل منطقتي NT و CT ، على التوالي.

    نظرًا لأن تسلسلات NT متنوعة بين بروتينات ATP10 ، فقد تلعب هذه المناطق أدوارًا محددة في البروتينات الفردية (الشكل التكميلي S2). تمشيا مع هذا ، فإن الطرف N أمر بالغ الأهمية لتحديد توطين ATP10A و ATP10B و ATP10D ، والمحطة N لـ ATP10B كافية للاستهداف الداخلي المتأخر لبروتينات غشاء البلازما ، بما في ذلك Lyn11-EGFP. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي ATP10B-NT على نموذج ExxxLL شبيه بالديليوسين (الشكل التكميلي S2) ، وبالفعل فإن بقايا الليوسين مطلوبة لتهريب Lyn11-EGFP-ATP10B-NT من غشاء البلازما إلى الجسيمات الداخلية المتأخرة (الشكل 7) ، بينما يبدو أن بقايا الغراء يمكن الاستغناء عنها. تحتوي P1B-ATPases و ATP7A و ATP7B أيضًا على إشارات تهريب داخل الخلايا شبيهة بالديليوسين في مناطق التصوير المقطعي المحوسب (Greenough). وآخرون.، 2004 لاليوتي وآخرون.، 2014). يبقى أن نوضح ما إذا كان ATP10B ينتقل من غشاء البلازما إلى الإندوسومات المتأخرة أو ينتقل من مجمع جولجي مباشرة إلى الإندوسومات أثناء التخليق الحيوي. ومع ذلك ، عندما يتم نقل ATP10B إلى غشاء البلازما ، فإن عزر الديليوسين يعمل كإشارة تهريب لاستهداف الإندوسومات المتأخرة (الشكل 8). بشكل ملحوظ ، على الرغم من أن D-ATP10B المترجمة إلى غشاء البلازما ، Lyn11ظهر -EGFP-ATP10D-NT في بعض الهياكل النقطية داخل السيتوبلازم وكذلك في غشاء البلازما. لذلك ، قد تحتوي النهاية N لـ ATP10D أيضًا على إشارة للالتقام الخلوي.

    لقد أظهرنا سابقًا أن تسلسل C-terminal SVRPLL لـ ATP11C-a يعمل كعنصر شبيه بالديليوسين عندما يتم فسفرة Ser بواسطة بروتين كيناز C (PKC) α ويتم تنظيمه لاحقًا عن طريق الالتقام الخلوي (الشكل التكميلي S3 Takatsu وآخرون.، 2017). علاوة على ذلك ، فإن تسلسل C-terminal LLxYKH لـ ATP11C-b أمر بالغ الأهمية لتوطينه المستقطب (Takayama وآخرون.، 2019). لذلك ، تلعب المحطة C لبروتينات ATP11 دورًا رئيسيًا في تنظيم توطينها الخلوي ونشاطها الأنزيمي في غشاء البلازما. في الواقع ، يمكن أن تحدد المحطة C توطين ATP11A و ATP11B و ATP11C (الشكل 4) ، والمحطة C لـ ATP11B كافية لاستهداف بروتينات غشاء البلازما ، بما في ذلك Lyn11-EGFP ، إلى الإندوسومات المبكرة / إعادة التدوير (الشكل 6). على الرغم من أن بقايا إشارات الخلايا الداخلية لـ ATP11B-CT غير معروفة ، فقد تكون هناك إشارة للاتجار و / أو استهداف الإندوسومات.

    ترتبط المنطقة السيتوبلازمية C- الطرفية لـ Drs2p بـ phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) ، وينظم هذا التفاعل النشاط الأنزيمي لـ Drs2p. يعرض الطرف C لـ Drs2p نشاطًا ذاتيًا تثبيطًا ، ويبدو أن التفاعل مع PI4P يخفف من التأثير المثبط (Natarajan) وآخرون.، 2009 تشو وآخرون.، 2013 العزاوي وآخرون.، 2017 Timcenko وآخرون.، 2019). علاوة على ذلك ، يخضع الطرف C لـ ATP8A2 للفسفرة التي تخفف منعه الذاتي (Chalat وآخرون.، 2017). بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط شكل GYAFS للطرف C لـ ATP8A1 بالمجال N لـ ATP8A1 في حالة E2P (Hiraizumi وآخرون.، 2019). لذلك ، يبدو أن الطرف C متورط في تنظيم الأنشطة الأنزيمية لهذه البروتينات. من ناحية أخرى ، فإن تبديل N- أو C-termini لبروتينات ATP10 احتفظ بنشاطها الأنزيمي أو خصوصية الركيزة (الشكل 3) ، ولم يؤثر تبديل الطرف C لـ ATP11C على نشاط التقليب PS / PE (Takatsu وآخرون.، 2017). نظرًا لوجود قدر كبير من الاختلاف بين تسلسل NT و CT لـ P4-ATPases (الأشكال التكميلية S2 و S3) ، قد تلعب هذه المناطق السيتوبلازمية أدوارًا تنظيمية محددة فيما يتعلق بنشاطها الأنزيمي والاتجار داخل الخلايا.


    الفرق بين الخلايا التائية والخلايا البائية

    تعريف

    الخلايا التائية: الخلايا التائية هي نوع من الخلايا الليمفاوية ، التي تتطور في الغدة الصعترية ، وتدور في الدم واللمف وتتوسط الاستجابة المناعية ضد الخلايا الخبيثة أو المصابة في الجسم عن طريق إفراز اللمفوكينات أو عن طريق الاتصال المباشر.

    خلايا ب: الخلايا البائية هي نوع من الخلايا الليمفاوية ، التي تتطور في نخاع العظام ، وتدور في الدم واللمف ، وعند التعرف على مسببات مرض معينة ، تتمايز إلى استنساخ خلية بلازما ، وتفرز أجسامًا مضادة محددة ونسخة خلية ذاكرة ، من أجل المواجهة اللاحقة لـ نفس العامل الممرض.

    أصل

    الخلايا التائية: تنشأ الخلايا التائية في نخاع العظام وتنضج في الغدة الصعترية.

    خلايا ب: تنشأ الخلايا البائية وتنضج في نخاع العظام.

    موقع

    الخلايا التائية: تحدث الخلايا التائية الناضجة داخل العقد الليمفاوية.

    خلايا ب: تحدث الخلايا البائية الناضجة خارج العقد الليمفاوية.

    مستقبلات الغشاء

    الخلايا التائية: تحمل الخلايا التائية مستقبلات TCR.

    خلايا ب: تحمل الخلايا البائية مستقبلات BCR.

    التعرف على المستضدات

    الخلايا التائية: تتعرف الخلايا التائية على المستضدات الفيروسية على السطح الخارجي للخلايا المصابة.

    خلايا ب: تتعرف الخلايا البائية على المستضدات الموجودة على سطح البكتيريا والفيروسات.

    توزيع

    الخلايا التائية: تحدث الخلايا التائية في المناطق المجاورة للجريب من قشرة الغدد الليمفاوية والغمد اللمفاوي المحيط بالطحال.

    خلايا ب: تحدث الخلايا البائية في المراكز الجرثومية ، والحبال تحت المحفظة والنخاع من الغدد الليمفاوية والطحال والأمعاء والجهاز التنفسي.

    فترة الحياة

    الخلايا التائية: تتمتع الخلايا التائية بأعمار أطول.

    خلايا ب: عمر الخلايا البائية قصير.

    الأجسام المضادة السطحية

    الخلايا التائية: تفتقر الخلايا التائية إلى مستضدات سطحية.

    خلايا ب: تحتوي الخلايا البائية على مستضدات سطحية.

    إفراز

    الخلايا التائية: تفرز الخلايا التائية اللمفوكينات.

    خلايا ب: تفرز الخلايا البائية الأجسام المضادة.

    نوع المناعة

    الخلايا التائية: تشارك الخلايا التائية في المناعة الخلوية (CMI).

    خلايا ب: تشارك الخلايا البائية في المناعة الخلطية أو المناعة بوساطة الجسم المضاد (AMI).

    النسب في الدم

    الخلايا التائية: 80٪ من الخلايا الليمفاوية في الدم هي خلايا تي.

    خلايا ب: 20٪ من الخلايا الليمفاوية في الدم هي الخلايا البائية.

    أنواع

    الخلايا التائية: الأنواع الثلاثة من الخلايا التائية هي الخلايا التائية المساعدة ، والخلايا التائية السامة للخلايا ، والخلايا التائية الكابتة.

    خلايا ب: نوعان من الخلايا البائية هما خلايا البلازما وخلايا الذاكرة.

    الانتقال إلى الموقع المصاب

    الخلايا التائية: تنتقل الخلايا التائية إلى موقع الإصابة.

    خلايا ب: لا تنتقل الخلايا البائية إلى موقع الإصابة.

    الخلايا السرطانية وزرعها

    الخلايا التائية: تعمل الخلايا التائية ضد الخلايا السرطانية وعمليات الزرع.

    خلايا ب: لا تعمل الخلايا البائية ضد الخلايا السرطانية أو عمليات الزرع.

    تأثير كابح

    الخلايا التائية: للخلايا التائية الكابتة تأثير مثبط على جهاز المناعة.

    خلايا ب: ليس للخلايا البائية أي تأثير مثبط على جهاز المناعة.

    الدفاع ضد

    الخلايا التائية: تدافع الخلايا التائية عن مسببات الأمراض بما في ذلك الفيروسات والطلائعيات والفطريات التي تدخل الخلايا في الجسم.

    خلايا ب: تدافع الخلايا البائية عن البكتيريا والفيروسات في مجرى الدم أو اللمف.

    استنتاج

    الخلايا التائية والخلايا البائية نوعان من الخلايا الليمفاوية التي تؤدي إلى استجابة مناعية ضد المواد الغريبة في الجسم. تتعرف الخلايا التائية على المستضدات الأجنبية الموجودة على سطح APS. تحفز الخلايا التائية المساعدة إنتاج الأجسام المضادة بواسطة خلايا البلازما. تدمر الخلايا التائية السامة للخلايا مسببات الأمراض عن طريق إحداث موت الخلايا المبرمج. تنتج الخلايا البائية أجسامًا مضادة محددة لمسببات الأمراض المختلفة ، من خلال التعرف على المستضدات في نظام الدورة الدموية. الفرق الرئيسي بين الخلايا التائية والخلايا البائية هو طريقتها في التعرف على المستضدات.


    شاهد الفيديو: أداة حساب نسبة السعودة وفقا لبرنامج نطاقات المطور تم التحديث (شهر فبراير 2023).