معلومة

شطف الحمض النووي الريبي بيوتينيلاتيد

شطف الحمض النووي الريبي بيوتينيلاتيد


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أستخدم حبات Neutravidin Agarose لعزل الحمض النووي الريبي بيوتينيلاتيد. الشيء هو ، في الدليل ، أنه يستخدم 8M Guanidine-HCl ، pH 1.5 لتصفية الجزيئات الحيوية. بقدر ما أعلم ، هو شطف عازلة قاسية للغاية. هل تعتقد أنه سيؤثر على RNA الخاص بي؟ لقد قمت بعزل الحمض النووي الريبي الخاص بي باستخدام TRIzol الذي يحتوي أيضًا على ملح Guanidine ولكن التركيز ليس مرتفعًا.

كسؤال ثانٍ ، هل تعرف طرقًا أخرى لاستخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) الخاص بي من الخرز؟

شكرا!


يعتبر تفاعل البيوتين - الستربتافيدين قويًا للغاية ، وهو أحد أقوى التفاعلات (إن لم يكن كذلك ال أقوى) تفاعل غير تساهمي بين الجزيئات الحيوية. لذلك ستحتاج إلى ظروف قاسية جدًا على أي حال.

تعتبر قيم الأس الهيدروجيني المتطرفة بشكل عام فكرة سيئة للغاية بالنسبة للحمض النووي الريبي. أنا متأكد تمامًا من أن الشروط التي ذكرتها لا تهدف إلى شطف الأحماض النووية. تؤدي قيم الأس الهيدروجيني المنخفضة هذه (وقيم الأس الهيدروجيني العالية أيضًا) إلى تحلل مائي سريع لرابطة الفوسفويستر في الحمض النووي الريبي ، يمكنك قراءة المزيد عن آلية ذلك في هذه المراجعة.

يقودني بحث Google السريع إلى البروتوكول التالي:

لفصل الأحماض النووية بيوتينيلاتيد عن Streptavidin-Coupled Dynabeads® ، احتضان الخرز في 95 ٪ فورماميد + 10 ملي EDTA ، الرقم الهيدروجيني 8.2 لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية أو لمدة دقيقتين عند 90 درجة مئوية.

هذا يبدو معقولًا بالنسبة لي ، حيث يستخدم فورماميد أيضًا بشكل شائع في عينة المخزن المؤقت لتغيير طبيعة هلام الرحلان الكهربائي للـ RNA. لم أفعل شيئًا كهذا بنفسي ، لذا لا يمكنني ضمان أن هذا سيعمل في حالتك.


الاسترداد الكمي للبروتينات الحيوية من راتنجات كروماتوغرافيا التقارب القائمة على الستربتافيدين

يعد التفاعل القوي بين الستربتافيدين والبيوتين أحد أكثر الأدوات المستخدمة شيوعًا في الكيمياء والبيولوجيا. تم إدخال طرق للاشتقاق السهل لمجموعة متنوعة من الجزيئات (على وجه الخصوص ، البروتينات) مع البيوتين ، من أجل السماح باستعادتها بكفاءة وتثبيتها واكتشافها باستخدام الكواشف القائمة على الستربتافيدين. ومع ذلك ، عند الرغبة ، يظل إطلاق البروتينات المعالجة بالبيوتين من الكواشف القائمة على الستربتافيدين مشكلة كبيرة ، بسبب الاستقرار الاستثنائي لهذا المركب. يقدم هذا الفصل بروتوكولًا تم تطويره في مختبرنا من أجل الشطف الكمي للبروتينات المعالجة بالبيوتين من سيفاروز الستربتافيدين ، والذي يتميز بظروف شطف قاسية ومنافسة مع البيوتين الحر. تظهر فائدة هذه الطريقة من خلال استرجاع البروتينات المعالجة بالبيوتين من متجانسات الأعضاء ، التي تم الحصول عليها من الفئران التي تم تربيتها بمشتق استر تفاعلي من البيوتين.


اكتشاف تفاعل البيوتين - أفيدين

في أواخر الثلاثينيات من القرن الماضي ، لوحظ أن الحيوانات التي تتغذى على نظام غذائي يتكون من بياض البيض في المقام الأول ستصاب بآفات جلدية وغيرها من المشكلات الصحية الرهيبة. أُطلق على هذا المرض اسم "إصابة بياض البيض" وتم تحديده بسبب نقص فيتامين H الذي أعيدت تسميته لاحقًا بفيتامين B7 / البيوتين. من شأن إصابة بياض البيض أن تصيب هذه الحيوانات حتى لو تم استكمال نظامها الغذائي بالبيوتين. وهكذا فإن شيئًا ما في بياض البيض كان يعزل البيوتين من الامتصاص. في عام 1940 ، تمكن Esmond E. Snell من تنقية البروتين المسؤول عن ارتباط البيوتين ، أفيدين. سمي أفيدين باسم الدجاج ، "Avian" ، البيض الذي تمت تنقيته منه. أكد سنيل لاحقًا أن أفيدين كان بالفعل الجاني في إصابة بياض البيض عن طريق إطعام الفئران المنقى أفيدين (Kresege et al. ، 2004). Avidin هو بروتين سكري يتكون من أربع وحدات فرعية متطابقة يمكن لكل منها ربط جزيء واحد من البيوتين.

يمتلك البيوتين وأفيدين تقاربًا قويًا للغاية مع بعضهما البعض. في الواقع ، تعد الرابطة بينهما واحدة من أقوى تفاعلات البروتين - الترابطية غير التساهمية الموجودة في الطبيعة. بمجرد تكوين الرابطة فإنها لا تتأثر بالتغيرات في درجة الحموضة أو درجة الحرارة أو المذيبات العضوية.


فئات

المشاركات الاخيرة

بيان حقوق النشر

© Promega Corporation ، 2009-2020.
كل الحقوق محفوظة. يُحظر تمامًا الاستخدام غير المصرح به و / أو نسخ هذه المواد دون إذن صريح وخطي من شركة Promega. يمكن استخدام المقتطفات والروابط ، بشرط أن يتم منح ائتمان كامل وواضح لشركة Promega مع التوجيه المناسب والمحدّد للمحتوى الأصلي. راجع الشروط والأحكام الخاصة بنا للحصول على معلومات إضافية.

سياسة التحرير

بينما نشجع المحادثة المفتوحة والصادقة ، فإننا نحتفظ بالحق في تعديل أو إزالة التعليقات التي تحتوي على لغة مسيئة أو بذيئة أو نابية. نقوم أيضًا بإزالة التعليقات التي تحتوي على أكاذيب علمية أو معلومات مضللة أو تروّج لها.

الجوائز

X نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط والتقنيات المماثلة لجعل موقعنا يعمل ، وتشغيل التحليلات ، وتحسين موقعنا ، وإظهار المحتوى والإعلانات المخصصة لك. بعض ملفات تعريف الارتباط هذه ضرورية لكي يعمل موقعنا الإلكتروني. بالنسبة للآخرين ، لن نضعهم ما لم تقبلهم. لمعرفة المزيد حول نهجنا في الخصوصية ، ندعوك لقراءة المزيد

بالنقر فوق "قبول الكل" ، فإنك توافق على استخدام كافة ملفات تعريف الارتباط. ومع ذلك ، يمكنك زيارة إعدادات ملفات تعريف الارتباط لتقديم موافقة مضبوطة.

نظرة عامة على الخصوصية

نحن نستخدم ملفات تعريف الارتباط والتقنيات المماثلة لجعل موقعنا يعمل ، وتشغيل التحليلات ، وتحسين موقعنا ، وعرض المحتوى والإعلانات المخصصة لك. بعض ملفات تعريف الارتباط هذه ضرورية لكي يعمل موقعنا الإلكتروني. بالنسبة للآخرين ، لن نضعهم ما لم تقبلهم. لمعرفة المزيد حول ملفات تعريف الارتباط وكيفية إدارة ملفات تعريف الارتباط ، اقرأ سياسة ملفات تعريف الارتباط الخاصة بنا.

إذا كنت مقيمًا في المنطقة الاقتصادية الأوروبية أو المملكة المتحدة أو سويسرا ، فيمكنك تغيير إعداداتك في أي وقت عن طريق النقر فوق إدارة الموافقة على ملفات تعريف الارتباط في تذييل موقعنا على الويب.


الانتماءات

قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية ، جامعة جنوب ميسيسيبي ، هاتيسبرج ، 39406 ، ميسيسيبي ، الولايات المتحدة الأمريكية

فكينغ هوانغ ، جون هو وأمبير يلين تشانغ

قسم العلوم البيولوجية ، جامعة جنوب ميسيسيبي

هاتيسبرج ، 39406 ، ميسيسيبي ، الولايات المتحدة الأمريكية

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

المؤلف المراسل


رسم خرائط تفاعلات RNA-RNA عالميًا باستخدام سورالين Biotinylated

هنا ، نحن بالتفصيل طريقة سمعادلة صsoralen متشابك ، إلigated و سانتخب حybrids (SPLASH) ، والتي تتيح رسم خرائط على مستوى الجينوم لتفاعلات RNA-RNA داخل الجزيئات وبين الجزيئات في الجسم الحي. يمكن تطبيق SPLASH لدراسة تفاعلات الحمض النووي الريبي للكائنات بما في ذلك الخميرة والبكتيريا والبشر.

الهدف العام من هذا الفيديو هو وصف طريقة تسلسل الهجينة المتشابكة والمختارة أو SPLASH التي يتم فيها تعيين تفاعلات RNA-RNA الزوجية في الجسم الحي بطريقة الجينوم. هذه التقنية هي طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية لرسم خرائط تفاعل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن الأسئلة الرئيسية في مجال جينوم الحمض النووي الريبي مثل كيفية تفاعل مناطق مختلفة على طول خيط واحد من الحمض النووي الريبي أو بين خيوط مختلفة من الحمض النووي الريبي مع بعضها البعض.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الخميرة والخلايا البشرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على الدراسات التي أجريت على الكائنات الحية الحديثة الأخرى بما في ذلك البكتيريا والأغشية في الخلايا. كانت لدينا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا التوصل إلى طريقة لرسم خريطة التفاعل الجزيئي. لاحظ أن الإجراء التالي يحتوي على عدة نقاط توقف.

في هذه الأوقات ، يمكن إيقاف التجربة مؤقتًا لفترة وجيزة أو إلى أجل غير مسمى. يمكن العثور على التفاصيل في النص المصاحب. ابدأ هذا الإجراء بغسل خلايا هيلا مرتين بخمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.

ضع الطبق عموديًا لمدة دقيقة واحدة لتصريف أي برنامج تلفزيوني زائد تمامًا. بعد ذلك ، أضف مليلتر واحد من برنامج تلفزيوني يحتوي على 200 ميكرومولار من السورالين بيوتينيلاتيد و 0.01٪ ديجيتونين مما يزيد من نفاذية الخلية. احرص على إضافة المحلول بالتساوي على سطح الخلايا.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بإزالة غطاء الطبق وضعه على الجليد داخل كروسلينكر الأشعة فوق البنفسجية على بعد ثلاثة سنتيمترات من لمبة الأشعة فوق البنفسجية. إشعاع الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر لمدة 20 دقيقة.

بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة الطبق من Crosslinker ثم عزل الجزء وتعجيل الحمض النووي الريبي من خلايا هيلا وفقًا للتعليمات الواردة في المستند المصاحب. تحميل عينات من الحمض النووي الريبي وسلم تشوه الصفات على 8.6 سنتيمتر مربع 6٪ TBE- هلام اليوريا. تجزئة الحجم بالرحلان الكهربي عند 180 فولت لمدة 40 دقيقة.

قم بتلوين الجل في 10 مللي لتر من محلول TBE الذي يحتوي على 1: 10.000 تخفيف من بقعة هلام الحمض النووي لمدة خمس دقائق في الظلام. أثناء تلطيخ الجل ، استخدم إبرة قياس 24 لثقب أنبوب ميكروفيج نظيف 0.6 مليلتر في الأسفل. ضعه في أنبوب ميكروفيوج بسعة 2 مل.

باستخدام أداة ترانسلومينيتور ، تصور العصابات الموجودة على الجل الملطخ وقم بقطع شريحة هلامية تقابل 90 إلى 110 نيوكليوتيدات. نقل شريحة الجل إلى أنبوب ميكروفيوج 0.6 مليلتر الذي تم ثقبه في أنبوب ميكروفيوج المليليترين. يتيح لنا اختيار الحجم تحديد الحد الأدنى لطول الأجزاء الخيمرية والتمييز بين المنتجات المربوطة والمنتجات غير المرتبطة فيما بعد.

قم بالطرد المركزي لشرائح الجل عند 12000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لتقطيع شريحة الهلام وجمعها في أنبوب ميكروفيوج مليليتر. بعد الدوران ، تخلص من أنبوب ميكروفيوج 0.6 مليلتر الفارغ. إلى شريحة الجل المبشورة ، أضف 700 ميكرولتر من محلول الشطف.

احتضان عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع دوران مستمر للسماح بنشر العينات في المخزن المؤقت. نقل شرائح الجل والمخزن شطف إلى مرشح أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 20 ، 000 مرة ز لمدة 20 دقيقة. بعد العصر ، سيتم حبس شرائح الهلام في الجزء العلوي من المرشح والتي قد يتم التخلص منها.

تعجل وقياس الحمض النووي الريبي كما هو موضح في الوثيقة المصاحبة. تجميد الفلاش وتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية تحت الصفر في النيتروجين السائل حتى يتم استخدامه. لإثراء مناطق الربط المتشابك للحمض النووي الريبي ، ابدأ بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التحلل الذي يحتوي على مثبط RNase لغسل حبات مغناطيسية مغلفة بالستربتافيدين في أنبوب دقيق.

إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي سعة 15 مليلترًا ، أضف 2 مليلتر من محلول التهجين المُعد حديثًا ، ومليلتر واحد من محلول التحلل المضاف ، و 1.5 ميكروغرام من الرنا المجزأ الحجم ، و 100 ميكرولتر من الخرز المعلق. دوامة الأنبوب برفق. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوران من طرف إلى طرف.

بعد الحضانة ، اغسل الخرز خمس مرات مع غسل العازلة قبل تسخينها. في نهاية الغسيل الخامس ، ضع أنبوب microfuge الذي يحتوي على الخرزات على حامل المغناطيس لمدة دقيقة واحدة ثم قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل. إضافة مليلتر واحد من عازلة T4 بولينوكليوتيد كيناز الباردة إلى الحبيبات المغسولة.

احتضان الخرز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية مع الدوران من طرف إلى طرف. ضع أنبوب microfuge الذي يحتوي على حبات على الشريط المغناطيسي. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة المخزن المؤقت برفق.

كرر هذه الخطوة لما مجموعه غسلتين وقم بإزالة المخزن المؤقت بعد الغسيل الأخير. بعد ذلك ، اتبع التعليمات الواردة في المستند المصاحب لتحويل الأطراف الخمسة الأولية والثلاثة الأساسية لتكون متوافقة مع الربط وإجراء الربط التقريبي. بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت RNA PK إلى الخرز وأعد تعليقه عن طريق الأنابيب لأعلى ولأسفل.

تسخين العينات على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على كتلة حرارية. بعد ذلك ، تبرد العينة على الجليد لمدة دقيقة واحدة. أضف 500 ميكرولتر من جوانيدينيوم ثيوسيانات-فينول-كلوروفورم إلى العينة.

اخلط بالدوامة بقوة لمدة 10 ثوانٍ. احضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، استخدم مجموعة لترسيب الحمض النووي الريبي وتنظيفه واستعادته ، وتأكد من الاحتفاظ حتى بـ RNAs الصغيرة.

أزل الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز. انقل 100 ميكرولتر من العينات المعبأة إلى بئر من صفيحة 24 بئراً في مكان جيد. إبقاء العينة على الجليد ، تشعيعها الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر لمدة خمس دقائق.

نقل العينة المتشابكة العكسي إلى أنبوب microfuge نظيف. أضف 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم وميكروليتر واحد من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. قم بترسيب الحمض النووي الريبي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة على الأقل.

لاستعادة الحمض النووي الريبي ، قم بالطرد المركزي للحمض النووي الريبي المترسب عند 20000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة طافية وإضافة مليلتر واحد من الإيثانول البارد 70٪ لغسل بيليه الحمض النووي الريبي. الطرد المركزي الحبيبات المغسولة عند 20000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل وإضافة 4.25 ميكرولتر من الماء الخالي من نوكلياز لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي. نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب PCR 0.2 ملليلتر. أخيرًا ، عكس النسخ والتعميم وتضخيم (كدنا) وفقًا للتعليمات الواردة في المستند المصاحب.

هذا التخطيطي يصور سير عمل SPLASH. عند إضافة السورالين المعالج بالبيوتينيلات في وجود 0.01٪ من الديجيتونين والأشعة فوق البنفسجية ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا ويتم إجراء لطخة نقطية للتأكد من كفاءة الربط المتشابك. ثم يتم استخدام 20 oligos أساسها Biotinylated كعناصر تحكم إيجابية لمعايرة كمية السورالين biotinylated المراد إضافتها إلى الخلايا بحيث يتم ربط واحدة تقريبًا من كل 150 قاعدة.

ثم يتم إجراء تضخيم PCR على نطاق صغير باستخدام عدد متزايد من دورات PCR لتحديد الحد الأدنى لعدد الدورات المطلوبة للتسلسل العميق. في عملية إعداد مكتبة فعالة ، يمكن تضخيم مكتبة تسلسل (كدنا) من 1.5 ميكروغرام من حجم إدخال الحمض النووي الريبي المحدد في أقل من 15 دورة من تضخيم PCR. يتم بعد ذلك ترتيب المكتبة باستخدام قراءتين من 150 زوجًا أساسيًا على مستوى عالٍ في آلة التسلسل.

ثم تتم معالجة قراءات التسلسل وفقًا لخط الأنابيب الحسابي. النتيجة النهائية هي قائمة من التفاعلات الكيميرية التي تمت تصفيتها والتي تتضمن تفاعلات RNA-RNA داخل الجزيئية وبين الجزيئات في الترنسكريبتوم. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من دمج السورالين الحيوي عند استخدام SPLASH على الكائنات الحية الجديدة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي لاستكشاف تفاعلات الحمض النووي الريبي في الكائنات الحية المتنوعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مكتبة تسلسل تلتقط تفاعلات RNA على مستوى العالم في الخلية.


المقدمة

يعد رسم خرائط البروتين وتفاعلات البروتين # x02212 (PPIs) والبروتينات دون الخلوية استراتيجية مهمة للكشف عن الظواهر البيولوجية وآليات المرض. تسهل طرق التضمين الحيوي المعتمدة على القرب المطورة حديثًا مثل APEX و BioID اكتشاف مثبطات مضخة البروتون والبروتينات تحت الخلوية داخل الخلايا الحية. في هذه الطرق ، يؤدي التعبير الخلوي لبروتين مهم (طُعم) مدمج مع إنزيم مُهندَس إلى ارتباط حيوي يعتمد على التقارب للبروتينات ذات الأهمية. تستخدم كلتا الطريقتين البيوتين المقدم خارجيًا أو نظيره للعمل كمجسات جزيئية تستخدمها الإنزيمات. يستفيد نظام APEX من إنزيم بيروكسيديز أسكوربات المصمم هندسيًا والمسمى APEX2 والذي يستخدم بيروكسيد الهيدروجين لتحفيز نقل البيوتين الفينول إلى بقايا التيروزين في البروتينات. يعتمد 2،3 BioID بالمثل على بيوتين يجاز هندسيًا يسمى BirA * 4،5 لتوليد biotinoyl-5 & # x02032-AMP ، والذي يتفاعل مع بقايا الليسين للبروتينات. 6

حتى الآن ، اعتمد تحديد البروتينات المعالجة بالبيوتين التي يتم إنشاؤها باستخدام هذه الاستراتيجيات على الالتقاط باستخدام عائلة البروتينات الستربتافيدين ، متبوعًا إما بالهضم على الخرزة أو الهضم داخل الهلام ، متبوعًا بتحليل LC & # x02212MS / MS. في حين تم استخدام هذه الطرق بنجاح ، كلاهما يعتمد على استخدام الببتيدات التي تم تحديدها nonbiotinylated كبديل للارتباط الحيوي ، حيث نادرًا ما يتم اكتشاف الببتيدات المعالجة بالبيوتينيل ، إذا تم اكتشافها على الإطلاق. نادرًا ما يتم تحديد سبب تحديد الببتيدات المعالجة بالبيوتين في المقام الأول بسبب التقارب القوي للستربتافيدين للبيوتين. عند استخدام عملية الهضم في الهلام ، يلزم شطف البروتينات المعالجة بالبيوتين قبل الرحلان الكهربائي. تم تطوير العديد من طرق الشطف باستخدام المنظفات ، 7 درجة حموضة منخفضة للغاية 8 أو المذيبات 9 وتم استخدام استراتيجيات بديلة بما في ذلك ضعف تقارب الستربتافيدين / أفيدين إلى البيوتين من خلال الوسائل الكيميائية 10 أو الوسائل الجينية 11. ومع ذلك ، حتى هذه التعديلات لا تؤدي إلا إلى الاسترداد الجزئي للبروتينات المعالجة بالبيوتين من الستربتافيدين 12 والببتيدات غير المشبعة بالبيوتين دائمًا ما يفوق عدد الببتيدات المعالجة بالبيوتين بشكل كبير. 2 لقد تم الالتفاف على الحاجة إلى استراتيجيات شطف جيدة من خلال استخدام عملية الهضم على الحبة ، والتي أصبحت طريقة ملائمة ومستخدمة على نطاق واسع في تجارب الارتباط الحيوي المعتمدة على القرب. ومع ذلك ، تظل الببتيدات المعالجة بالبيوتين مرتبطة بالخرز ولا يتم اكتشافها حيث لا يتم تعطيل تفاعل الستربتافيدين & # x02212 بيوتين. في نهج مختلف ، والذي لا يعاني من القيود الموضحة للتو ، Schiapparelli et al. وصفوا إستراتيجية محددة لـ DiDBiT (الكشف المباشر عن العلامات المحتوية على البيوتين) ، حيث قاموا أولاً بهضم البروتينات في الببتيدات ثم إثراء الببتيدات المعالجة بالبيوتين باستخدام NeutrAvidin. نظرًا لأن هذه الطريقة قد تم اختبارها في الغالب باستخدام البروتينات المعالجة بالبيوتين في المختبر ، فقد استنتجنا أن التقارب القوي لـ NeutrAvidin للبيوتين يمكن أن يحد من اكتشاف الببتيدات biotinylated ، خاصة في سياق biotinylated في الجسم الحي مثل طرق biotinylation المعتمدة على القرب ، حيث قد يكون المستوى العام لمستوى biotinylation منخفضًا.

لتحسين اكتشاف الببتيدات المعالجة بالبيوتين ، قمنا بتطوير استراتيجية محددة السيرة الذاتيةالدقيقة ساي تي أناdenti & # x000ae الكاتيون تيعلم التاريخ (بيوسيت) ، والذي يعتمد على استخدام الأجسام المضادة للبيوتين لالتقاط وتحديد الببتيدات المعالجة بالبيوتين بشكل مباشر في تشغيل LC & # x02212MS / MS واحد. لقد أظهرنا أن اكتشاف الببتيدات المعالجة بالبيوتين يزيد بشكل كبير من الثقة في تحديد البروتين المرشح في طرق الارتباط الحيوي المعتمدة على القرب. من خلال توفير موقع biotinylation على البروتينات الموصوفة في هذه الطرق ، يقدم هذا النهج أيضًا مستوى جديدًا من المعلومات حول الجوانب الهيكلية لمؤشرات PPIs وطوبولوجيا البروتين. أخيرًا ، نصف نهجًا بسيطًا لتجارب BioSITe الكمية من خلال استخدام البيوتين المسمى بالنظائر ، مما يؤدي إلى تجنب استخدام الاستراتيجيات الكمية القائمة على وضع العلامات الأيضية مثل SILAC. 14 بينما كان يتم الانتهاء من هذه الورقة للنشر ، تم نشر تقرير عن استراتيجية مماثلة باستخدام نهج الجسم المضاد للتخصيب المباشر للببتيد الحيوي. 15


الإجراءات التجريبية

يبني. منطقة الترميز الخاصة بـ الإشريكية القولونية تم استنساخ جين birA biotin – protein ligase (20) من الحمض النووي الجيني بواسطة PCR كجزء 1 كيلو بايت باستخدام بوليميراز DNA Deep-VENT (New England Biolabs) وتم التحقق منه عن طريق التسلسل. تم إعادة ترتيب جين birA في Bglالموقع الثاني لمتجه تعبير الكريات الحمر pEV-puromycin ، والذي يتكون من منطقة التحكم في موقع β-globin البشري (miniLCR) ، ومروج β-globin البشري ، و intron الثاني β-globin (21). تم استنساخ GATA-1 (كدنا) في pEV-Neomycin تم وضع علامة نهائية عليه من خلال إدخاله في Ncoأنا موقع في البداية كودون ، رابط قليل النوكليوتيد مع Ncoأنا أفرط في الترميز لعلامة 23-aa biotinylation (16). تم إنشاء عامل شبيه كروبل (EKLF) (كدنا) الذي تم وضع علامة عليه في pBluescript عن طريق الاستنساخ بالتسلسل في Ncoأبدأ موقع الكودون أولاً ، وهو ترميز قليل النوكليوتيد لثلاث نسخ من علامة هيماجلوتينين ، متبوعًا بتشفير قليل النوكليوتيد للعلامة 23-aa biotinylation. ثم تم استنساخ EKLF الموسوم في pEV-Neomycin.

تحولات خلايا خلايا الدم الحمراء (MEL). تم تزويد خلايا MEL (22) بالكهرباء في البداية باستخدام BirA / pEV الخطي ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة المستقرة تحت puromycin. تم فحص النسخ المستنسخة لتعبير BirA RNA عن طريق تحليل اللطخة الشمالية. تم نقل استنساخ BirA / pEV MEL المحدد باستخدام GATA-1 / pEV ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة المستقرة مرتين من أجل puromycin و neomycin (Invitrogen).

تحضير مستخلص نووي. تم تحفيز خلايا MEL المستزرعة في DMEM المضاف إليها 10 ٪ FCS عند 37 درجة مئوية للتمايز إلى خلايا كريات حمراء ناضجة مع 2 ٪ DMSO لمدة 3 أيام على الأقل (22). تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي عند 640 × ز وغسلها مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني بارد. تم تعليق بيليه الخلية في 2.2 مولار سكروز في 10 ملي مولار Hepes ، ودرجة الحموضة 7.9 / 25 ملي مول كلوريد / 0.15 ملي من الحيوانات المنوية / 0.5 ملي مولار سبيرميدين / 1 ملي EDTA وحضنت لمدة 20 دقيقة. تم تحلل الخلايا باستخدام خلاط ، وتم فحص التحلل تحت المجهر الضوئي عن طريق تلطيخ النوى باستخدام Unna (Methylgreen-Pyronin). تم تكوير النوى بواسطة تنبيذ فائق عند 141000 × ز لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية ، معلق في المخزن المؤقت للتحلل (10 ملي مولار Hepes ، الرقم الهيدروجيني 7.9 / 100 ملي بوكل / 3 ملي مولار MgCl2/ 0.1 ملي مولار EDTA / 20٪ جلسرين) ، ويتم استخراجه عن طريق الإضافة المنقطرة لـ 3.3 مولار بوكل حتى كان التركيز النهائي 400 ملي مولار. تمت إزالة المواد غير القابلة للذوبان عن طريق التنبيذ الفائق عند 300000 × ز لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. تم اقتطاع المستخلصات النووية وتخزينها في درجة حرارة -70 درجة مئوية.

تحليل اللطخة المناعية. لتحليل تعبير GATA-1 و في الجسم الحي تم تحليل المستخلصات الحيوية ، والمستخلصات النووية (1–2.5 ميكروغرام / ممر) بواسطة SDS / PAGE في هلام 8٪ وتم مسحها على غشاء نيتروسليلوز ProTran (Schleicher & amp Schuell) باستخدام الإجراءات القياسية. تم حظر المرشحات لمدة ساعة واحدة في 5 ٪ BSA / 1 × TBS / 0.2 ٪ Tween-20 وحضنت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ GATA-1 N6 (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ، التخفيف 1: 5000) أو الستربتافيدين - اقتران بيروكسيداز الفجل (HRP) (NEN ، التخفيف 1: 10000). تم غسل المرشحات في 1 × TBS / 0.5M NaCl / 0.3٪ Triton X-100 وحضنت في جسم مضاد ثانوي مضاد للفئران (DAKO ، التخفيف 1: 3000) ، على النحو الوارد أعلاه. لم تكن هناك حاجة إلى خطوة جسم ثانوية بعد احتضان المرشحات باستخدام الستربتافيدين- HRP. تم تطوير المرشحات باستخدام التلألؤ الكيميائي المعزز (Amersham Pharmacia).

ملزمة لخرز الستربتافيدين. تم منع حبات الستربتافيدين البارامغناطيسية [Dynabeads M-280 ، Dynal (Great Neck ، NY)] بالغسيل ثلاث مرات في TBS مع 200 نانوغرام / ميكرولتر من ألبومين مصل الدجاج المنقى (Sigma-Aldrich). استخدمنا ≈20 ميكرولتر من الخرز لكل 1 مجم من المستخلص النووي. تم إجراء الربط في 1 × TBS / 0.3٪ Nonidet P-40 عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة إلى طوال الليل على منصة هزازة ، تليها ست غسلات في محلول ربط عند درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة المادة المربوطة بالغليان لمدة 5 دقائق في محلول تحميل عينة بروتين Laemmli وتحليلها عن طريق التكتل المناعي على النحو الوارد أعلاه.

السيدة. تم فصل البروتينات المستخلصة من الحبيبات بعد ربط مستخلص BirA النووي بواسطة الرحلان الكهربائي SDS / PAGE على هلام بولي أكريلاميد 8٪ وملطخة باللون الأزرق الغرواني (Invitrogen). تم قطع المسار بالكامل وتقسيمه إلى ما لا يقل عن 20 سدادة هلامية ، والتي تم تقليل كل منها إلى 1 مم 3 قطعة هلامية وتجفيفها باستخدام 100٪ أسيتونيتريل (فلوكا) في 60٪ من أنابيب أسيتونتريل مُعالجة مسبقًا (بيوكوت ، يورك ، المملكة المتحدة). تم هضم البروتينات في الهلام باستخدام التربسين المعدل (Roche Diagnostics) في 50 ملي من بيكربونات الأمونيوم. تم تحليل الملخصات عن طريق كروماتوجرافيا السائل النانوي - الترادفي MS باستخدام مطياف كتلة زمن الرحلة الرباعي (Q-Tof ، Micromass ، مانشستر ، المملكة المتحدة) يعمل في وضع الأيونات الموجبة. تم إقران نظام nanoLC بـ Q-Tof بشكل أساسي كما هو موصوف (23). تم تسليم مخاليط الببتيد إلى النظام باستخدام جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي Famos (حزم LC ، أمستردام) بمعدل 3 ميكرولتر / دقيقة ومحاصرة في عمود Aqua C18RP [أبعاد عمود الظواهر 1 سم × 100 ميكرون ، معبأة في المنزل ]. بعد تقسيم التدفق إلى 150-200 نيوتن / دقيقة ، تم نقل الببتيدات إلى العمود التحليلي (أبعاد عمود مخطط Pep-Map ، LC Packings 25 سم × 50 ميكرومتر ، معبأة داخليًا) في تدرج من الأسيتونيتريل (1٪ لكل دقيقة. ). تم إجراء تجزئة للببتيدات التالفة في الوضع المعتمد على البيانات ، وتم الحصول على أطياف الكتلة في وضع المسح الكامل. تم إجراء عمليات البحث في قاعدة البيانات باستخدام التميمة (www.matrixscience.com).

فحوصات الكروماتين المنسدلة. عولجت خلايا MEL مع 1٪ فورمالدهايد في 40 ملي مولار من Hepes ، ودرجة الحموضة 7.9 ، عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، تليها التبريد باستخدام 0.125 مولار جليكاين. تم تجزئة الكروماتين المتشابك عن طريق الصوتنة [رشقات 10 × 30 ثانية بسعة 5 ، تليها رشقات 10 × 30 ثانية بسعة 8 باستخدام Sanyo Soniprep (Loughborough ، المملكة المتحدة) 150 sonicator] وقسامات مقابلة لـ 4-10 OD 260 تم تجميد الوحدات بسرعة. تم إجراء عمليات السحب لأسفل عن طريق احتضان قسامة من الكروماتين المتشابك لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 4 درجات مئوية مع 20 ميكرولتر من Dynabeads المطلي بالستربتافيدين ، والمغلق مسبقًا بـ 1 مجم / مل من BSA و 0.4 مجم / مل من الحمض النووي للحيوانات المنوية لسمك السلمون الصوتي. تم إجراء عمليات الغسيل وفقًا للبروتوكولات القياسية (www.upstate.com/misc/protocols.asp). تم إجراء شطف المواد المقيدة وعكس الروابط المتقاطعة في 1 ٪ SDS في محلول TE (10 ملي مولار تريس / 1 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 8.0) عن طريق الحضانة طوال الليل عند 60 درجة مئوية مع الاهتزاز. تم استرداد الحمض النووي بعد نزع البروتين ، وتم فحص قسامات من الحمض النووي المسحوب بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات ضد محفز maj globin لفأر الكريات الحمر كما هو موصوف في المواد والطرق الداعمة، والتي تم نشرها كمعلومات داعمة على موقع الويب PNAS ، www.pnas.org.

الفئران المعدلة وراثيا. تم إطلاق شظايا الحمض النووي التي تحتوي على علامات EKLF و BirA من متواليات ناقلات بدائية النواة عن طريق الهضم المزدوج باستخدام Aat II / Asp 718. تمت تنقية الحمض النووي باستخدام Gelase (Epicenter Technologies، Madison، WI) وتم تحضيره للحقن المجهري بواسطة استخدام EluTip (Schleicher & amp Schuell) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء الحقن المجهري في بويضات الفئران المخصبة وفقًا للإجراءات القياسية (24). تم إجراء فحص الفئران بحثًا عن الجينات المعدلة عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية باستخدام BirA (كدنا) والإنسان β-globin intron II كمجسات.


راتنج الستربتافيدين الثابت (1 اقتباسات)

الستربتافيدين هو بروتين رباعي يحتوي على 4 مواقع مرتبطة بالبيوتين. في كثير من النواحي ، يشبه الستربتافيدين أفيدين ، لكنه لا يحتوي على كربوهيدرات ، ووزنه الجزيئي (حوالي 60 كيلو دالتون) أقل قليلاً. إن قابلية ذوبان الستربتافيدين (الأس الهيدروجيني الكهربي 5) في المخزن المائي أقل بكثير من أفيدين ، ومع ذلك ، فإن ارتباط الستربتافيدين بالبيوتين يشبه إلى حد كبير ارتباط أفيدين.

ميزة الستربتافيدين هي أن نقص الكربوهيدرات يقلل بشكل كبير من كمية الارتباط غير المحدد.

الستربتافيدين المستخدم للتثبيت على الاغاروز المسامي المترابط بنسبة 6٪ هو شكل مؤتلف بكتلة 53 كيلو دالتون ودرجة حموضة قريبة من المحايدة. يقترن الستربتافيدين تساهميًا بالأغاروز ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من الترشيح ، ويكون مستقرًا على نطاق الأس الهيدروجيني من 2 إلى 11.

تم تصميم Streptavidin Resin لتنقية تقارب البروتينات والأجسام المضادة والجزيئات الأخرى بخطوة واحدة وصغيرة وكبيرة الحجم باستخدام علامة البيوتين. يمكن أيضًا استخدام الراتينج لتطوير المقايسة والاستلام المناعي للبروتينات باستخدام الأجسام المضادة التي تحمل علامات البيوتين.

يتم توفير الستربتافيدين الخاص بنا كملاط راتينج أو في شكل عمود دوران 1 مل.


انتقاء وشطف الأبتاميرات باستخدام مصفوفات هلام محلول النانو مع مسخنات دقيقة متكاملة

إذا لم تكن مؤلف هذه المقالة وترغب في إعادة إنتاج مادة منها في منشور تابع لجهة خارجية بخلاف RSC ، فيجب عليك طلب الإذن رسميًا باستخدام مركز حقوق النشر والتخليص. انتقل إلى تعليمات استخدام صفحة مركز ترخيص حقوق النشر للحصول على التفاصيل.

لا يحتاج المؤلفون الذين يساهمون في منشورات RSC (مقالات المجلات والكتب أو فصول الكتب) إلى طلب إذن رسمي لنسخ المواد الواردة في هذه المقالة بشرط أن يتم تقديم الإقرار الصحيح مع المواد المنسوخة.

يجب أن تُنسب المواد المستنسخة على النحو التالي:

  • لاستنساخ المواد من NJC:
    مستنسخة من المرجع. XX بإذن من المركز الوطني للبحوث العلمية (CNRS) والجمعية الملكية للكيمياء.
  • لاستنساخ المواد من PCCP:
    مستنسخة من المرجع. XX بإذن من الجمعيات المالكة لـ PCCP.
  • لاستنساخ المواد من PPS:
    مستنسخة من المرجع. XX بإذن من الجمعية الأوروبية لعلم الأحياء الضوئية ، والجمعية الأوروبية للكيمياء الضوئية ، والجمعية الملكية للكيمياء.
  • لاستنساخ المواد من جميع المجلات والكتب الأخرى الخاصة بمركز البحوث والدراسات:
    مستنسخة من المرجع. XX بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء.

إذا تم تعديل المادة بدلاً من استنساخها من منشور RSC الأصلي "مستنسخ من" يمكن استبداله بـ "مقتبس من".

في جميع الحالات المرجع. XX هو المرجع XX في قائمة المراجع.

إذا كنت مؤلفًا لهذه المقالة ، فلست بحاجة إلى طلب إذن رسمي لنسخ الأرقام والمخططات وما إلى ذلك الواردة في هذه المقالة في منشورات طرف ثالث أو في أطروحة أو أطروحة شريطة أن يتم تقديم الإقرار الصحيح مع المواد المنسوخة.

يجب أن تُنسب المواد المستنسخة على النحو التالي:

  • لاستنساخ المواد من NJC:
    [الاقتباس الأصلي] - مستنسخ بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء (RSC) نيابة عن المركز الوطني للبحث العلمي (CNRS) ومركز البحوث العلمية
  • لاستنساخ المواد من PCCP:
    [الاقتباس الأصلي] - مستنسخ بإذن من الجمعيات المالكة لـ PCCP
  • لاستنساخ المواد من PPS:
    [الاقتباس الأصلي] - مستنسخ بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء (RSC) نيابة عن الجمعية الأوروبية لعلم الأحياء الضوئية ، والجمعية الأوروبية للكيمياء الضوئية ، و RSC
  • لنسخ المواد من جميع مجلات RSC الأخرى:
    [الاقتباس الأصلي] - نُسخ بإذن من الجمعية الملكية للكيمياء

إذا كنت مؤلفًا لهذه المقالة ، فلا تزال بحاجة إلى الحصول على إذن لنسخ المقالة بأكملها في منشور تابع لجهة خارجية باستثناء إعادة إنتاج المقال بأكمله في أطروحة أو أطروحة.

تتوفر معلومات حول إعادة إنتاج المواد من مقالات RSC بتراخيص مختلفة في صفحة طلبات الأذونات الخاصة بنا.


شاهد الفيديو: حديث الطباشير الحمض النووي الريبي المنقوص الأكسجين DNA (شهر اكتوبر 2022).