معلومة

كيف تأخذ عدد دقيق / منخفض من الخلايا من الخلية المحللة؟

كيف تأخذ عدد دقيق / منخفض من الخلايا من الخلية المحللة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أود أن أعرف كيف يمكننا أخذ عدد قليل أو دقيق من الخلايا من خلية محللة؟ (بدون استخدام أي مقايسة كمية البروتين).

دعنا نقول ، إذا كان لدي خط خلية به كثافة خلية 5 × 10 ^ 5 خلايا / مل (ومتوسط ​​تركيز البروتين هو 0.1 نانوغرام / خلية)

إذا كنت أتعامل مع هذه الخلايا بتركيز 5 × 10 ^ 5 خلية / مل مع المخزن المؤقت (على سبيل المثال ، 0.1 ٪ منحدر + 10 ملي مولار DTT). بعد تحقيق محللة الخلية ، كيف يمكنني أخذ أرقام خلايا دقيقة من هذا المحللة لمزيد من معالجة العينات (مثل الألكلة والهضم وما إلى ذلك)؟

على سبيل المثال ، إذا كنت أرغب في الحصول على 100cells / 5ul أو 1000cells / 50ul ، فكيف يمكنني أخذه من محلول الخلية؟

أعلم أنني سأضطر إلى تخفيف محللتي ، لكنني مرتبك قليلاً في كيفية تحقيق ذلك بناءً على تركيز الخلية؟ ما هو مقدار عازلة التحلل والتخفيف المناسب؟

ملاحظة: في حالتي لا يمكنني استخدام أي مقايسة كمية البروتين لقياس تركيز البروتين.

سأكون ممتنا للغاية إذا كان أي شخص يمكن أن يساعد من فضلك.

نتطلع الى الاستماع قريبا.

بإخلاص،


يحتوي دماغ الثدييات على أكثر من 10000 نوع من الخلايا العصبية. لذلك ، تتطلب دراسة تنظيم الجينات في الدماغ استراتيجيات فعالة لاستهداف أنواع معينة من الخلايا ، خاصة تلك ذات الوفرة المنخفضة. قد يؤدي عزل الخلية إلى تغيير التعبير الجيني كما أنه يؤدي إلى تعطيل الخلايا العصبية الناضجة من خلال عمليات واسعة النطاق. يصف هذا البروتوكول التعبير الخاص بنوع الخلية عن الريبوسوم الموسوم واستخدام علامات الريبوسوم متبوعًا بـ RNA-seq لتحديد الترجمة ذات العدد المنخفض والخلايا المتناثرة في أدمغة الماوس دون عزل الخلية التخريبية.

للحصول على تفاصيل كاملة حول استخدام وتنفيذ هذا البروتوكول ، يرجى الرجوع إلى Gao et al. (2020)


مجاهر ثقافة الخلية

يتطلب الحفاظ على ثقافة خلوية صحية ومستقرة فحصًا مجهريًا يوميًا ، والذي يجب أن يكون سريعًا وسهلاً من أجل منع الإجهاد البيئي وتقليل مخاطر التلوث ، وكذلك للحفاظ على عبء عملك منخفضًا. يمكن أن يوفر تصوير ثقافة الخلية معلومات عن النمو والتلوث وتمايز الخلايا وحالتها ومعدلات تعداء الخلايا. تعتبر ممارسة زراعة الخلايا الجيدة والتوصيف من المتطلبات الأساسية لضمان نتائج قابلة للتكرار.

يجب أن يتناسب المجهر الذي تستخدمه في زراعة الخلايا بشكل مثالي داخل غطاء المزرعة ، أو يكون مضغوطًا بدرجة كافية لوضعه على مقعد مجاور. نظرًا لأن الخلايا المستنبتة يمكن أن تظهر شفافة تحت إضاءة المجال الساطع ، فإن تباين الطور يتيح تصور التشكل الخلوي وتصوير العضيات. يمكن أن يكون استخدام مصدر الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) مفيدًا حيث يمكن تشغيل وإيقاف مصابيح LED على الفور ، وتنتج كميات قليلة من الحرارة أو الأشعة فوق البنفسجية غير المرغوب فيها (UV) ، وبالتالي تقلل التأثيرات السمية الضوئية مقارنة بمصادر مثل مصابيح قوس الزئبق .

يتطلب تصور أفضل الهياكل في خلاياك تقنية تباين مناسبة تمامًا ، مثل تباين التداخل التفاضلي (DIC) و PlasDIC وتباين تعديل هوفمان المحسن (iHMC). يحسن DIC تباين العينات غير الملوثة وينتج صورًا عالية الدقة. في PlasDIC ، يتم إضاءة العينة بضوء غير مستقطب ، مما يجعل هذه التقنية مثالية عند استخدام حاويات الاستزراع البلاستيكية. يستخدم HMC مُعدلاً بثلاث مناطق ، كل منها يسمح بنقل محدد للضوء. مع الفتحة المدمجة التي توفر إضاءة نموذجية مائلة ، ينكسر الضوء أو يمر عبر المغير وفقًا لبنية العينة. يضمن HMC المحسن تباينًا حادًا وصورًا زائفة ثلاثية الأبعاد لأرقى الهياكل الخلوية.


كيف تأخذ عدد دقيق / منخفض من الخلايا من الخلية المحللة؟ - مادة الاحياء

الشكل 1: ظهر من حساب المغلف لعدد البروتينات لكل خلية في بكتيريا مميزة وخلية ثديية. يعتمد التقدير على قيم المعلمات العامة. للحصول على قيم محددة أكثر دقة للكائن انظر النص الرئيسي.

بالنظر إلى المكانة المركزية لتنظيم الجينات في جميع مجالات علم الأحياء ، هناك اهتمام كبير في تحديد تعداد mRNA في الخلايا من أنواع مختلفة. نحن مهتمون بكل من الجينات المحددة والنسخة بأكملها كدالة للظروف البيئية ومرحلة النمو. توفر هذه القياسات قراءة مباشرة للحالة التنظيمية اللحظية للخلية في وقت معين وعلى هذا النحو ، تعطينا أداة قوية لتحليل كيفية تنفيذ اتخاذ القرار الخلوي. نبدأ بتمرين للخيال لمعرفة ما إذا كان بإمكاننا استخدام بعض الحقائق الخلوية الأساسية لتقدير عدد mRNAs. نظرًا لمعرفتنا بحركية عمليات العقيدة المركزية خلال دورة خلية واحدة ، يمكن تحديد عدد جزيئات mRNA لكل خلية كما هو موضح في الشكل 1. جوهر التقدير هو استغلال التعرف على ذلك على مدار دورة الخلية الواحدة. في دورة الخلية ، يجب مضاعفة عدد البروتينات من خلال تخليق البروتين. يعتمد تخليق البروتين هذا بدوره على توزيع جزيئات الرنا المرسال الموجودة في الخلية. كما هو مبين في هذا الجزء الخلفي من حساب المغلف ، يمكننا استنباط تقدير لخلايا الانقسام السريع من 10 3-10 4 mRNA لكل خلية بكتيرية و 10 5-10 6 mRNA لكل حجم مميز 3000 ميكرومتر لخلية الثدييات.

الشكل 2: استخدام التسلسل للعثور على عدد mRNAs لكل خلية. (أ) يتم استخراج مرنا بعناية من الخلايا وخلطها مع مرنا المركب الذي يخدم المعايرة. يتيح التسلسل العميق حساب عدد النسخ من كل نوع من أنواع الرنا المرسال ومن هذا العدد الإجمالي للـ mRNAs يمكن استنتاجه. عدد (ب) مرنا للإشريكية القولونية المزروعة في الوسائط الغنية والحد الأدنى من الوسائط. (البيانات مقدمة من Zoya Ignatova)

لقد حلت التقنيات الحديثة الآن إلى حد كبير محل تلك التي أدت إلى أرقام التعداد الكلاسيكية. يتم توجيه نهج واحد نحو قياسات "على مستوى الجينوم" حيث يتم إجراء محاولة لقياس عدد mRNAs عبر النسخة بأكملها. تستند هذه النتائج إلى طريقة RNA-Seq حيث يتم تسلسل mRNAs الفردية من محللة الخلية. بالطبع ، نظرًا لأن العد يعتمد على تكرار قراءات التسلسل ، فإنه يتطلب معايرة. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم رفع العينة بمعايير mRNAs التي تعرف كميتها قبل التسلسل. يظهر مثال على مثل هذه النتيجة في الشكل 2 ، الذي يقدم تقارير عن توزيع mRNAs في بكتريا قولونية نمت في ظل ظروف الوسائط الغنية والمتدنية. نتيجة هذه الدراسة هي أن عدد النصوص لكل خلية (≈8000 نسخة / خلية mRNA) للخلايا المزروعة في وسائط LB أكبر بثلاث مرات تقريبًا من عدد النصوص لكل خلية (≈ 3000 نسخة / خلية mRNA) للخلايا نمت في الحد الأدنى من وسائل الإعلام. بالنظر إلى أن عدد الجينات يزيد عن 4000 ، فهذا يعني أن متوسط ​​عدد النسخ في LB يكون بترتيب واحد لكل خلية. بالنسبة لمعظم الجينات ، يكون في الواقع أقل من ذلك ، مما يعني أنه في معظم الخلايا لا توجد نسخ بينما في بعضها يوجد نسخة واحدة أو اثنتان. نجد أن هذه الحقيقة المذهلة هي مثال واحد على المكان الذي يتم فيه زيادة صورة محتويات الخلية بالنسبة لمعظم الناس ، وهي الخلية البكتيرية في هذه الحالة ، من خلال استخدام الأرقام باعتبارها حاسة سادسة لإدراك الخلايا.

الشكل 3: نهج الفحص المجهري الإسفار لأخذ تعداد مرنا. باستخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، من الممكن استخدام كثافة التألق لتحقيقات محددة تتهجين إلى mRNA ذي الأهمية لحساب هذه الرنا المرسال. (أ) رسم تخطيطي لتحقيقات الجزيء المفرد المستخدمة لتسمية مرنا. (ب) صورة مضان من حقل E. coli الخلايا مع mRNA لجين معين تصويره. (C) رسم بياني لمتوسط ​​عدد الرنا المرسال في E. coli لعدد من الجينات. (مقتبس من Taniguchi et al. Science، 329، 533 (2010)).

أحد أهم الأسئلة في مركز الحساب البيولوجي الذي دعا إليه كتابنا هو التكاثر ، خاصةً عندما يتم استخدام طرق مختلفة للتأثير على نفس المشكلة. تم بناء بديل مفيد للغاية لإجراء تعداد الرنا المرسال حول العد المباشر من خلال النظر إلى جزيئات الرنا المرسال الفردية تحت المجهر. على وجه التحديد ، فإن التحلل الجيني باستخدام تقنيات مثل التألق أحادي الجزيء في الموقع (FISH) يكمل منظور RNA-Seq الموصوف أعلاه. يوفر FISH نافذة على توزيع mRNA المكاني ومن خلية إلى خلية لأنواع معينة من جزيء mRNA كما هو موضح هنا في الشكل 3 وكما هو موضح في الشكل 2 من المقالة القصيرة حول "مقدار التباين من خلية إلى خلية في البروتين التعبير؟". الفكرة في هذه الحالة هي تصميم مجسات ترتبط بـ mRNA ذي الأهمية من خلال الاقتران الأساسي التكميلي. يحتوي كل مسبار من هذا القبيل على حامل فلور ، وبالتالي ، عندما يتم فحص الخلايا الثابتة في المجهر ، يتم استخدام شدة التألق لهذه المجسات كقراءة لعدد mRNAs. كما هو موضح في الشكل 3 ب ، يكون عدد الرنا المرسال لكل خلية بشكل عام بين 0.1 و 1 ، مع وجود العديد من القيم المتطرفة التي تحتوي على عدد أصغر وأكبر من الرنا المرسال. كما تم التأكيد أيضًا في جميع أنحاء الكتاب ، تؤدي الظروف المختلفة إلى أرقام مختلفة ونتائج FISH المعاد إنشاؤها هنا تتوافق مع النمو البطيء.

الشكل 4: توزيعات مرنا في الخميرة. (أ) توزيع مرنا في الخميرة الناشئة المزروعة في وسائط غنية (YPD) والحد الأدنى من الوسائط (SD) كما تم قياسه باستخدام PCR. (ب) توزيع مرنا في خميرة الانشطار المقاسة باستخدام RNA-Seq. ((A) مقتبس من F.Miura، BMC Genomics، 9، 574 (2008) (B) مقتبس من S. Marguerat، Cell، 151: 671 (2012)).

ماذا عن تعداد الرنا المرسال في أنواع الخلايا الأخرى إلى جانب البكتيريا؟ مرة أخرى ، تم تطبيق كل من طرق التسلسل والفحص المجهري على هذه الأسئلة في الخميرة وحقيقيات النوى الأخرى. يعرض الشكل 4 نتائج تعداد الرنا المرسال في كل من الخميرة في مهدها وخميرة الانشطار. يتراوح إجمالي عدد الرنا المرسال لكل خلية بين 20000 و 60.000 في الخميرة المتنامية باطراد (BNID 104312 ، 102988 ، 103023 ، 106226 ، 106763). كما هو الحال مع نتائجنا السابقة للبكتيريا ، نجد هنا أيضًا أن كل جين بشكل عام يحتوي فقط على عدد قليل من جزيئات mRNA الموجودة في الخلية في أي وقت. المقالة القصيرة على "ما هي نسبة البروتين إلى mRNA في الخلايا؟" يوفر نافذة على عامل التضخيم الذي يحضر mRNA معين حيث يتم تحويله إلى بروتينات الخلية في عملية الترجمة. بالنسبة لخلايا الثدييات "النموذجية" ، فإن القيمة المقتبسة البالغة 200000 مرنا لكل خلية (BNID 109916) تتماشى مع تقديرنا البسيط أعلاه ويظهر أن قياس عدد الرنا المرسال بالتناسب مع الحجم ومعدل النمو يبدو أنه أول تخمين مفيد.


الشكل 2

الشكل 2. (أ) منحنى استجابة الجرعة لفحص نشاط المؤتلف Akt و MK2 و PKA. حدود الكشف هي 1 و 1.2 و 0.7 نانوغرام / مل على التوالي. (ب) منحنيات استجابة الجرعة التي تُظهر تنظيم نشاط Akt عن طريق الأنسولين وتنظيم نشاط PKA بواسطة forskolin (25 ميكرومتر ، 30 دقيقة). تشير القيم المرسومة إلى المتوسط ​​± sem للقياسات المكررة.

فحص نشاط كيناز من محلول الخلية السائبة

مقايسة نشاط كيناز من خلية واحدة المحللة


كيف تأخذ عدد دقيق / منخفض من الخلايا من الخلية المحللة؟ - مادة الاحياء

قسم الهندسة الطبية الحيوية ، جامعة ييل ، نيو هافن ، CT 06520 ، الولايات المتحدة الأمريكية
بريد الالكتروني: [email protected]
الفاكس: +1 203-432-6441
الهاتف: +1 203-432-9905

(ب) قسم علم الوراثة ، كلية الطب بجامعة ييل ، نيو هافن ، كونيتيكت 06510 ، الولايات المتحدة الأمريكية
بريد الالكتروني: [email protected]
الفاكس: +1 203-785-4305
الهاتف: +1 203-737-3426

ج مركز ييل للخلايا الجذعية ، مركز ييل للسرطان ، نيو هافن ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية

د مركز ييل لعلوم وطب الحمض النووي الريبي ، نيو هافن ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية

الملخص

MicroRNAs (miRNAs) عبارة عن رنا صغيرة غير مشفرة تتحكم في التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ عبر شبكة تنظيمية معقدة تتطلب تنميط ميرنا على مستوى الجينوم لتشريح. تعد أنماط تعبير ميرنا على نطاق الجينوم غنية بالمعلومات التشخيصية والإنذارية للأمراض البشرية مثل السرطانات. ومع ذلك ، يتطلب هذا التحليل تنقية متعددة الخطوات للـ RNAs من كميات كبيرة من الخلايا ، وهو ليس فقط مضيعة للوقت ومكلفًا ولكنه صعب أيضًا في المواقف التي تكون فيها أعداد الخلايا محدودة. في هذه الدراسة ، نُبلغ عن الالتقاط المباشر والتضخيم وإعداد المكتبة للـ miRNAs من محلول الخلية بالكامل دون الحاجة إلى تنقية مسبقة. ونتيجة لذلك ، فإنه يتيح التنميط ميرنا على مستوى الجينوم بشكل متكاثر بكمية منخفضة من عينات الخلايا (∼ 500 خلية مكونة للدم). على وجه التحديد ، أجرينا تحقيقًا منهجيًا لخطوتين رئيسيتين - تحلل الخلايا لإطلاق ميرنا وربط 3-محول المطلوب لالتقاط وتضخيم ميرنا المباشر. لا يميز ملف تعريف التعبير الذي تم الحصول عليه أنواع الخلايا فحسب ، بل يكتشف أيضًا تعديلات ميرنا الفردية في خطوط الخلايا المتجانسة وثيقة الصلة. هذا النهج ، الذي يعد بسيطًا إلى حد كبير مقارنة بالطرق القياسية بسبب التخلص من الحاجة إلى تنقية الحمض النووي الريبي ، مفيد لقياس عينات الكمية المنخفضة.


خلفية

تم التعرف على الخصائص الغذائية لحليب الأم لمئات السنين. تعتبر الرضاعة الطبيعية من أهم الإجراءات لتحسين صحة الأطفال في العديد من المجتمعات ، ويعتبر حليب الثدي الآن عاملًا علاجيًا مناسبًا للاستخدام بالتوازي مع العلاج الدوائي [1،2،3].

يحتوي حليب كل نوع على تركيبة فريدة تطورت على مدى ملايين السنين لتناسب احتياجات الرضع من هذا النوع. يحتوي على عدد لا يحصى من المكونات المناعية والكيميائية الحيوية والخلوية التي لديها القدرة على تغيير مناعة الأطفال حديثي الولادة بشكل كبير والتعرض للعدوى [1 ، 4]. ينتج التعقيد الإضافي عن الاختلافات الفردية في تكوين حليب الثدي ، والتي تُعزى إلى مرحلة الإرضاع ، ودرجة امتلاء الثدي ، ورضاعة الطفل ، وصحة الصبيا الذي يرضع من الثدي ، وعوامل أخرى.

على الرغم من الاختلاف في تكوين الحليب ، فإن اللبنات الأساسية للحليب مشتركة بين جميع الثدييات. من الناحية الوظيفية ، من الممكن التمييز بين المكونات الغذائية والنشطة بيولوجيًا في حليب الأم. هذه الأخيرة هي عوامل النمو والمناعة والمكونات الخلوية. عادة ، يُعتقد أن حليب الثدي يحتوي على الخلايا الظهارية والخلايا المناعية. أظهرت الاختراقات الحديثة أن حليب الثدي غير متجانس أكثر مما كان يعتقد سابقًا وأنه يحتوي أيضًا على خلايا جذعية. علاوة على ذلك ، يعتبر حليب الأم أيضًا مصدرًا مستمرًا للبكتيريا المتعايشة والمفيدة ، بما في ذلك بكتيريا حمض اللاكتيك والبكتيريا المشقوقة. أظهرت مقارنة عدد الخلايا الجسدية والحمل البكتيري في نفس العينات عدم وجود ارتباط معنوي. يتم تلخيص المعرفة الحالية للتركيب الخلوي للحليب البشري في الشكل 1.

الخلايا الموجودة في حليب الثدي البشري

أظهرت الأبحاث ارتباطًا وثيقًا بين دهون الحليب ومحتويات الخلايا التي تتغير مع درجة امتلاء الثدي [5]. الآليات التي لا يزال يتعين توضيحها تشمل تنظيم تخليق حليب الثدي ، وهجرة الخلايا إلى حليب الثدي ، وإنشاء تكوين الخلايا الجذعية / السلفية ، وإنشاء مساهمة الميكروبيوم. يثير التنوع التركيبي لمجموعات خلايا حليب الثدي أسئلة حول وظيفة الخلايا غير المناعية والخلايا الجذعية / السلفية ، والارتباطات بين ميكروبيوتا الحليب والخلايا الجسدية والمغذيات الكبيرة. تسلط هذه المراجعة الضوء على الحالة الحالية للمعرفة حول التركيب الخلوي لحليب الثدي البشري.

الخلايا المناعية

لطالما عُرفت حماية الرضيع بوساطة لبن الإنسان ودُرست بشكل مكثف. يمنح حليب الأم مناعة فعالة وسلبية للرضيع لأنه مصدر غني بالجلوبيولين المناعي واللاكتوفيرين والليزوزيمات والسيتوكينات والعديد من العوامل المناعية الأخرى.

في أواخر الستينيات ، كشفت الدراسات أن اللبأ غني بالكريات البيض [6 ، 7] ، والتي كانت تعتبر أكثر خلايا لبن الثدي وفرة. ومع ذلك ، فإن التحديد البصري ينتج عنه خطأ في تحديد وتقدير تركيز كريات الدم البيضاء ، في حين أن الطرق الجديدة مثل قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان توفر تحديدًا وتقديرًا ممتازًا لجميع خلايا حليب الثدي. كشفت البيانات الجديدة أن الكريات البيض لا تشكل سوى أقلية صغيرة (& lt2٪) من الخلايا في الحليب الناضج للأم السليمة [8]. توفر الكريات البيض في المقام الأول مناعة نشطة وتعزز تطوير الكفاءة المناعية لدى الرضيع ، ولكن من المحتمل أيضًا أنها تحمي الغدة الثديية من العدوى.

يبدأ نقل عوامل المناعة من الأم إلى الرضيع في الرحم ويستمر بعد الولادة من خلال الرضاعة الطبيعية [9]. تشير الدلائل المستمدة من الدراسات التي أجريت على الحيوانات إلى أن كريات الدم البيضاء في لبن الثدي تعيش عند المرور عبر الجهاز الهضمي للرضيع ، ثم تنتقل من القناة الهضمية إلى الدم والمواقع البعيدة ، بما في ذلك العقد الليمفاوية والطحال والكبد [10 ، 11]. ومع ذلك ، هناك فجوات عديدة في معرفة تطور الجهاز المناعي والجهاز الهضمي عند الرضع. من المعروف أن كريات الدم البيضاء الأمومية من لبن الأم توفر مناعة فعالة للرضيع من خلال محاربة مسببات الأمراض مباشرة عن طريق البلعمة ، أو إنتاج مكونات نشطة بيولوجيًا ، أو المساعدة في تطوير الجهاز المناعي لحديثي الولادة ، أو تعديل البيئة المكروية للجهاز الهضمي للرضع [12]. هناك العديد من الاحتمالات للمرور عبر الجهاز الهضمي للرضيع والانتقال من الجهاز الهضمي إلى الدم (الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي). لقد ثبت أن كريات الدم البيضاء في لبن الأم نشطة ومتحركة وتفاعلية ، ويمكن نقلها عبر الدورة الدموية الجهازية إلى الأنسجة البعيدة [13]. لقد تم افتراض أن miRNAs ، الموجودة بكثرة في حليب الثدي ، تشارك أيضًا في بقاء الكريات البيض في الجهاز الهضمي للرضيع ، مما قد يمنح وظائف مناعية وتنموية [14].

ترتبط مرحلة الرضاعة بتغيرات كبيرة في تكوين كريات الدم البيضاء في اللبن [15]. باستخدام قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان لتحديد وقياس مجموعات الكريات البيض الفرعية في حليب الثدي التي تم الحصول عليها من النساء الأصحاء ، Trend et al. وجد أن اللبأ يحتوي على ما يقرب من 146000 خلية / مل وأن الكمية تقل في الحليب الانتقالي (8-12 يومًا بعد الولادة) والحليب الناضج (26-30 يومًا بعد الولادة) إلى 27500 و 23650 خلية / مل على التوالي [15]. أظهروا أيضًا أن حليب الثدي يحتوي على تنوع وتعقيد أكبر من مجموعات الكريات البيض الفرعية أكثر مما كان يعتقد سابقًا. من بين الخلايا التي تم تحديدها ، كانت الكريات البيض الرئيسية الموجودة هي السلائف النخاعية (9-20٪) ، العدلات (12-27٪) ، الخلايا الحبيبية غير الناضجة (8-17٪) ، والخلايا التائية غير السامة للخلايا (6-7٪). يرتبط تقدم الإرضاع بتناقص تركيز CD45 + الكريات البيض ، والحمضات ، وسلائف الخلايا النخاعية والخلايا البائية ، و CD16 - وحيدات. ازدادت التكرارات النسبية للعدلات والخلايا الحبيبية غير الناضجة معنويا في اللبن الناضج بالمقارنة مع اللبأ.

Hassiotou et al. أظهرت زيادة محددة في كريات الدم البيضاء في حليب الثدي عندما كانت الأم المرضعة مصابة بعدوى [8]. ومن المثير للاهتمام أن ريسكين وآخرون. أبلغ أيضًا عن زيادة في كريات الدم البيضاء في حليب الثدي عندما يكون الرضيع مصابًا بعدوى ، مما يشير إلى تفاعل ديناميكي بين الأطفال المرضى وأمهاتهم [16]. تشير الاستجابة الديناميكية لخلايا الدم البيضاء في حليب الثدي للعدوى إلى أن هذه عملية منظمة بإحكام تهدف إلى منح دعم مناعي إضافي للرضيع [8 ، 16]. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لإلقاء الضوء على الآليات المناعية الكامنة وراء هذه الاستجابات ، فضلاً عن أهميتها السريرية.

بالإضافة إلى الكريات البيض المشتقة من الدم ، تشير الدراسات الأولية إلى وجود الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم في اللبأ ، والتي تنشأ من مجرى دم الأم [17]. تتطلب خصائصها ودورها وآلية نقلها من دم الأم إلى حليب الثدي مزيدًا من الدراسة.

الخلايا غير المناعية وخلايا حليب الثدي البشرية الجذعية / السلفية

بينما تم فحص الوظيفة الغذائية والوقائية لحليب الثدي سابقًا ، لا يُعرف الكثير عن خصائص وأدوار الخلايا غير المناعية الموجودة. كشفت الدراسات التي أجريت في الخمسينيات من القرن الماضي أن اللبأ يحتوي على خلايا طلائية [18]. في العقد الماضي ، تبين أنه بالإضافة إلى مجموعات الخلايا هذه ، يحتوي حليب الثدي على الخلايا الجذعية والسلفية [19 ، 20]. تم افتراض وجود الخلايا الجذعية والسلفية في الغدة الثديية ولبن الثدي في وقت سابق بناءً على قدرة الغدة الثديية على برمجة التغييرات وتتحول إلى الحالة الإفرازية الكاملة أثناء الحمل وفي فترة ما بعد الولادة.

وهكذا ، يحتوي حليب الأم البشري على مجموعات خلايا غير متجانسة بما في ذلك الخلايا اللبنية (خلايا إفراز الحليب) ، وخلايا الظهارة العضلية (من القنوات والحويصلات الهوائية في الغدة الثديية) وتسلسل هرمي للخلايا السلفية والجذعية. التركيب الخلوي للحليب البشري ديناميكي ويمكن تغيير نسبة أنواع الخلايا المختلفة بعدة عوامل ، مثل مرحلة الرضاعة والصحة وتغذية الرضع. تم تلخيص التقارير المختارة عن الخلايا الجسدية المعزولة من حليب الثدي للنساء الأصحاء في الجدول 1.

تمثل الخلايا اللمعية والظهارية العضلية وسلائفها ما يقرب من 98٪ من أنواع الخلايا غير المناعية في لبن الإنسان في ظل ظروف صحية. إنها تعبر عن عدد قليل من مستضدات الغشاء: CK5 و CK14 و CK18 ، وهي علامات على تمايز الخلايا الظهارية للثدي. تبني الخلايا العضلية الظهارية ألياف عضلية ملساء تحيط بالحويصلات الهوائية. يؤدي تقلصها إلى طرد الحليب من الحويصلات الهوائية إلى قنوات الحليب. تعبر الخلايا اللمعية عن جزيء التصاق الخلايا الظهارية (EPCAM) ، بينما تعبر الخلايا الظهارية العضلية عن أكتين العضلات الملساء (SMA) وسيتوكيراتين 14 (CK14). تصطف الخلايا اللبنية الحويصلات الهوائية في الغدة الثديية البشرية وهي مسؤولة عن تخليق وإفراز الحليب في التجويف السنخي. تُعبِّر هذه الخلايا السنخية عن السيتوكيراتين 18 (CK18) وتصنع بروتينات الحليب مثل α-lactalbumin و ß-casin [21]. سلائف الثدي لكل من أنواع الخلايا اللمعية والظهارية العضلية تعبر عن α6 إنتغرين (CD49f) وسيتوكيراتين 5 (CK5). تظهر العديد من الدراسات أن الخلايا الظهارية المعزولة من لبن الثدي الطازج هي خلايا ملتصقة تشكل مستعمرات من أشكال مختلفة يمكن الحفاظ عليها من خلال ممرات استنبات مختبرية متعددة [22 ، 23]. لوحظ أيضًا شكل خلية مماثل في مختبرنا (الشكل 2).

مورفولوجيا الخلايا المشتقة من حليب الثدي. أ عدد الخلايا غير المتجانسة بما في ذلك الكريات البيض. ب تم إنشاء Mammosphere بواسطة hBSCs في Matrigel (في اليوم الثامن بعد العزلة). ج تكاثر الخلايا اللبنية وخلايا الظهارة العضلية في اليوم الثاني بعد العزلة ، الثقافة في المختبر على لوحات زراعة الأنسجة

تم الإبلاغ أيضًا عن وجود nestin ، وهو علامة للأديم العصبي ، في مجموعة سكانية فرعية من الخلايا المشتقة من حليب الثدي. ومع ذلك ، فإن تواتر الخلايا الإيجابية nestin منخفض في السكان غير المتجانسين من حليب الأم [24].

كريجان وآخرون. أظهر أن لبن الثدي يحتوي على خلايا ذات خصائص جذعية / سلفية [19]. حسيني وآخرون. وجدت أن الخلايا الجذعية المشتقة من حليب الثدي لديها القدرة على التمايز إلى سلالات الخلايا العصبية وأظهرت تشابهها مع كل من الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية الوسيطة. أدى تعرض مجموعة الخلايا من حليب الثدي إلى الوسط العصبي في المختبر إلى التمايز في جميع الأنساب العصبية الثلاثة: الخلايا العصبية التي تعبر عن ß-tubulin كعلامة عصبية ، وخلايا قليلة التغصن التي تعبر عن علامة O4 ، والخلايا النجمية التي تعبر عن علامة GFAP [23]. كل من الغدة الثديية والجهاز العصبي لهما نفس الأصل الجنيني ، لذلك يمكن أن تكون خلايا حليب الأم مصدرًا جيدًا لتمايز سلالة الخلايا العصبية. من الممكن أن تشارك الخلايا في تطوير الجهاز العصبي المعوي ، وهو أحد الأجزاء الرئيسية للجهاز العصبي ، ويتكون من نظام شبكي من الخلايا العصبية التي تتحكم في وظيفة الجهاز الهضمي. يُظهر الأطفال المولودين قبل أوانهم ممن لا يرضعون رضاعة طبيعية خطرًا أكبر للإصابة بأمراض مثل الإسهال عند الأطفال والتهاب الأمعاء والقولون الناخر.

اقترحت بعض الدراسات أن لبن الأم يحتوي على الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs). في دراسة أجريت في عام 2013 ، تم عزل الخلايا التي تعبر عن علامات MSC النموذجية ، مثل CD90 و CD105 و CD73 ، من حليب الثدي [22 ، 25]. ومع ذلك ، وفقًا لـ Kakulas et al. ، لا يوجد دليل مقنع حاليًا يدعم وجود MSCs في حليب الثدي [26].

تم الإبلاغ عن وجود خلايا جذعية متعددة القدرات في حليب الثدي البشري (الخلايا الجذعية لحليب الثدي البشري ، hBSCs) لأول مرة في عام 2012 بواسطة Hassiotou et al. [20]. أظهر المؤلفون قدرة hBSC على إنتاج خلايا جذعية ذاتية التجديد ، مع إمكانية تمايز متعددة السلالات لجميع طبقات الجراثيم الثلاث: الأديم الظاهر والأديم المتوسط ​​والأديم الباطن. لقد أظهروا التعبير عن عوامل الخلايا الجذعية الجنينية النموذجية: عامل النسخ 4 المرتبط بالأوكتامر (OCT4) ، والمنطقة المحددة للجنس Y-box (SOX2) ، والصندوق المثلي (NANOG). أظهروا أيضًا تكوين شكل مستعمرة ونمط ظاهري يشبه ESC ، لكنهم لم ينتجوا ورمًا مسخيًا في الجسم الحي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة [27].

ومن المثير للاهتمام ، لوحظ زيادة كبيرة في تنظيم الجينات ESC أثناء تكوين كروي. كانت مساوية أو تجاوزت في بعض الأحيان مستويات التعبير لـ hESCs. كشف تحليل الدورة الزمنية لتعبير OCT4 و SOX2 و NANOG mRNA من الأيام 1 إلى 12 من تكوين كروي عن انتظام مستقر لهذه الجينات.

لقد ثبت أن hBSCs قد تتمايز في المختبر إلى الخلايا الدهنية والخلايا الغضروفية وخلايا العظم والخلايا العصبية والخلايا الشبيهة بخلايا الكبد وخلايا بيتا البنكرياسية. كما أنها قادرة على التمايز إلى الخلايا اللبنية وخلايا الظهارة العضلية. يمكن إثراء الخلايا الجذعية للثدي البشري في الثقافات المعلقة كغلاف جوي. ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن سلوك هذه الخلايا. من الممكن أن تكون hBSCs مسؤولة ليس فقط عن إعادة تشكيل الثدي الضروري لدعم تطوره نحو عضو ناضج لإفراز الحليب ، ولكن أيضًا تكاثر أو تطوير أو تنظيم الأنسجة اللاجينية في الرضيع. تقدم الدراسات التي أجريت على الفئران دليلاً على هجرة الخلايا الجذعية لحليب الثدي وتكاملها مع أعضاء حديثي الولادة. وقد ثبت أن هذه الخلايا تعيش وتعبر الغشاء المخاطي للجهاز الهضمي من صغار الفئران التي تم رعايتها في الجسم الحي ، ثم تنتقل إلى مجرى الدم ثم إلى أعضاء مختلفة حيث تندمج وتتمايز في خلايا وظيفية [28]. يمكن أن يكون هذا مثالًا على الخيمرية الدقيقة البشرية. لم يتم ملاحظة أي خلايا من أصل جنيني في العزلات [29].

لا يُعرف سوى القليل جدًا عن خلايا الحليب وأصلها وخصائصها والعوامل التي تؤثر عليها. وقد وجد أن بعض هذه الخلايا على الأقل تنشأ من النسيج الطلائي للثدي المرضع ، لكن العوامل التي تنشطها أثناء الحمل والرضاعة ما زالت مجهولة. من الممكن أن تنشأ hBSCs من مجرى دم الأم ، مثل CD34 + الخلايا الجذعية المكونة للدم الموجودة أيضًا في لبن الإنسان [17].

بدون أدنى شك ، يحتوي حليب الثدي على تسلسل هرمي للخلايا من الخلايا الجذعية الشبيهة بالجنين في المراحل المبكرة إلى الخلايا الظهارية الثديية المتمايزة تمامًا. سوف تستكشف الدراسات المستقبلية إمكانات وفوائد الخلايا غير المناعية وخلايا لبن الثدي الجذعية / السلفية في تغذية الرضع ، ولكن أيضًا في العلاج والطب التجديدي.

البروبيوتيك: البكتيريا النافعة في حليب الأم

حليب الإنسان بعيد كل البعد عن كونه سائلًا معقمًا. تم اكتشاف وجود ميكروبيوم اللبن البشري قبل عقد من الزمان فقط. تشير التقديرات إلى أن الرضيع الذي يتغذى على 800 مل من حليب الثدي يوميًا يمكن أن يبتلع 10-7-10 8 خلايا بكتيرية يوميًا [30]. تشير التطورات في تقييم التفاعلات المبكرة بين المضيف والميكروب إلى أن الاستعمار المبكر لأمعاء الرضيع بواسطة بكتيريا الحليب قد يكون له تأثير على الوقاية من الأمراض لدى الأطفال ولصحتهم لاحقًا.

البكتيريا الأكثر شيوعًا الموجودة في حليب الأم هي تلك التي تنتمي إلى النوع المكورات العنقودية, Acinetobacter, العقدية, الزائفة, المكورات اللبنية, المكورات المعوية و اكتوباكيللوس [31]. البعض ، مثل المكورات العنقودية, الوتدية أو Propionibacteriumيمكن عزله عن الجلد ويوجد أيضًا بشكل متكرر في حليب الأم. من المحتمل أنها تمنع استعمار العائل بمسببات الأمراض الأكثر خطورة ، مثل بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية [32]. آخرون ، بما في ذلك L. gasseri, اللعاب, L. rhamnosus, L. الأخمصية و الخميرة ، تعتبر من أنواع الكائنات الحية المجهرية من قبل هيئة سلامة الأغذية الأوروبية (EFSA).

حدد التحليل المتعمق للمجتمعات البكتيرية في الحليب باستخدام تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية تنوعًا أكبر بكثير من البكتيريا في الحليب مما تم الإبلاغ عنه سابقًا في الدراسات المستقلة عن الثقافة التي اعتمدت على نطاق أضيق (PCR الكمي) أو دقيق (PCR-DGGE) أساليب.

لا شك أن البكتيريا ليست تلوثًا يحدث أثناء استخلاص العينة ، كما كان يُفترض في الماضي [33 ، 34 ، 35]. ومع ذلك ، قد تُعزى الاختلافات إلى الاختلافات الجينية أو الثقافية أو البيئية أو الغذائية بين المجموعات السكانية المدروسة وتغيرات ميكروبيوم اللبن البشري أثناء الرضاعة [30 ، 36]. ومن المثير للاهتمام ، أن لبن الأم وُجد أن له سمات جرثومية متشابهة بشكل مستقل عن عمر الحمل أو طريقة الولادة [37]. تعد بكتيريا البروبيوتيك في حليب الأم مجالًا حديثًا للبحث.

تم تلخيص تقارير منتقاة عن الأنواع البكتيرية المعزولة من حليب الثدي للنساء الأصحاء في الجدول 2. تشير بعض الدراسات إلى أن البكتيريا المختارة من الميكروبات المعوية المعوية للأم يمكنها الوصول إلى الغدة الثديية من خلال مسار معوي - ثديي. تتضمن الآلية الخلايا التغصنية وخلايا CD18 + ، والتي يمكن أن تمتص البكتيريا غير المسببة للأمراض من تجويف الأمعاء وتحملها إلى الغدة الثديية المرضعة [38 ، 39]. بويكس أموروس وآخرون. أكد وجود بكتيريا حية تتحرك داخل المصفوفة خارج الخلية للخلايا المناعية [30]. في دراسة أخرى ، لوحظ انتقال البكتيريا من الأمعاء إلى الغدد الليمفاوية المساريقية والغدد الثديية في الفئران الحوامل والمرضعات [40]. لقد تم اقتراح أن الانتقال البكتيري إلى الأنسجة خارج الأمعاء هو حدث فسيولوجي مفيد في مضيف سليم ، وقد يرتبط بنضج الجهاز المناعي لحديثي الولادة.


الترقيات

حزم فارز BD FACSMelody ™ رباعية الاتجاهات

حزم محدودة الوقت على فارز الخلايا رباعية الاتجاهات BD FACSMelody ™ لتلبية احتياجات مختبرك. وفِّر في تكوينات أو ملحقات أو خدمات الأدوات ذات القيمة المدفوعة.


استفد من استشارات تصميم التجربة الفردية والدعم وأسعار اللوحات الخاصة.

حزم الأحياء عالية الأبعاد

قم بتحسين سير عمل قياس التدفق الخلوي للوصول إلى رؤى أعمق باستخدام علم الأحياء عالي الأبعاد. لفترة محدودة ، استفد من الحزم التي تتضمن مقاييس التدفق الخلوي والكواشف والمعلوماتية جنبًا إلى جنب مع أجهزة متعددة الخلايا أحادية الخلية.

حلول مبتكرة لدعم التشخيصات والأبحاث الخاصة بك

مدعومة بأحدث التقنيات وأكثر من 45 عامًا من الخبرة في قياس التدفق الخلوي

BD FACSMelody ™
فارز الخلية رباعي الاتجاهات

اكتشف حل فرز الخلايا رباعي الاتجاهات سهل الوصول إليه وبأسعار معقولة وآلية

BD FACSymphony ™ S6
فارز الخلية

فارز الخلايا مصمم لدعم اكتشافاتك العلمية بفرز سداسي وما يصل إلى 60 معلمة

كواشف BD Horizon ™ Red 718

تم تصميم الفلوروكروم المبتكر لتوفير قوة حل أكبر من Alexa Fluor ™ 700

"تقدم كواشف BD Horizon ™ Red 718 بديلاً أكثر إشراقًا لـ Alexa Fluor ™ 700 وتزيد من دقة الألواح عالية الأبعاد عندما تكون العلامات التقليدية باهتة للغاية."

"تقدم كواشف BD Horizon ™ Red 718 بديلاً أكثر إشراقًا لـ Alexa Fluor ™ 700 وتزيد من دقة الألواح عالية الأبعاد عندما تكون العلامات التقليدية باهتة للغاية."

“BD is positioned with BD ® CS&T and BD ® FC Bead technology to enable instrument standardization simply from day to day, instrument to instrument, and lab to lab. Reference control–based instrument standardization is the next step for flow cytometry.”

“BD is positioned with BD ® CS&T and BD ® FC Bead technology to enable instrument standardization simply from day to day, instrument to instrument, and lab to lab. Reference control–based instrument standardization is the next step for flow cytometry.”

“At last, a fully integrated end-to-end walkaway solution, which is going to make our lives significantly easier. It reduces errors in both the pre-analytical and analytical phases, leading to increased productivity and efficiency, but most importantly provides a comprehensive fully audit-able account of the whole process. Finally, a solution that creates capacity to allow us to meet our key performance indicators.”

“At last, a fully integrated end-to-end walkaway solution, which is going to make our lives significantly easier. It reduces errors in both the pre-analytical and analytical phases, leading to increased productivity and efficiency, but most importantly provides a comprehensive fully audit-able account of the whole process. Finally, a solution that creates capacity to allow us to meet our key performance indicators.”


محتويات

In a viscous fluid, the معدل of sedimentation of a given suspended particle (as long as the particle is more dense than the fluid) is largely a function of the following factors:

  • Gravitational force
  • Difference in density
  • Fluid viscosity
  • Particle size and shape

Larger particles sediment more quickly and at lower centrifugal forces. If a particle is less dense than the fluid (e.g., fats in water), the particle will not sediment, but rather will float, regardless of strength of the g-force experienced by the particle. Centrifugal force separates components not only on the basis of density, but also of particle size and shape. In contrast, a more specialized equilibrium density-gradient centrifugation produces a separation profile dependent on particle-density alone, and therefore is suitable for more fine-grained separations.

High g-force makes sedimentation of small particles much faster than Brownian diffusion, even for very small (nanoscale) particles. When a centrifuge is used, Stokes' law must be modified to account for the variation in g-force with distance from the center of rotation. [6]

  • D is the minimum diameter of the particles expected to sediment (m)
  • η (or μ) is the fluid dynamic viscosity (Pa.s)
  • رF is the final radius of rotation (m)
  • رأنا is the initial radius of rotation (m)
  • ρص is particle volumetric mass density (kg/m 3 )
  • ρF is the fluid volumetric mass density (kg/m 3 )
  • ω is the angular velocity (radian/s)
  • t is the time required to sediment from Rأنا to RF (س)

Differential centrifugation can be used with intact particles (e.g. biological cells, microparticles, nanoparticles), or used to separate the component parts of a given particle. [7] Using the example of a separation of eukaryotic organelles from intact cells, the cell must first be lysed and homogenized (ideally by a gentle technique, such as Dounce homogenization harsher techniques or over homogenization will lead to a lower proportion of intact organelles). Once the crude organelle extract is obtained, it may be subjected to a varying centrifugation speeds to separate the organelles:

Typical differential centrifugation parameters for a biological sample [2] (path length of centrifugation ≈1–5 cm)
Sample input G force زمن Instrument needed Pellet contents Supernatant contents
Unlysed (eukaryotic) cells 100 x g 5 min Benchtop fixed-angle centrifuge, or swinging bucket centrifuge Intact (eukaryotic) cells, macroscopic debris Varies depending on sample
Gently lysed cells (e.g. dounce homogenizer) 600 x g 10 دقائق Benchtop fixed-angle centrifuge, or swinging bucket centrifuge Nuclei Cytosol, non-nuclei organelles
Supernatant of previous row 15,000 x g 20 دقيقة Benchtop fixed-angle centrifuge Mitochondria, chloroplasts, lysosomes, peroxisomes Cytosol, microsomes (known as post mitochondrial supernatant)
Supernatant of previous row 50,000 x g - 100,000 x g 60 دقيقة High speed fixed-angle centrifuge, or vacuum ultracentrifuge Plasma membrane, microsomal fraction, large polyribosomes Cytosol, ribosomal subunits, small polyribosomes, enzyme complexes
Supernatant of previous row 50,000 x g - 100,000 x g 120 min Vacuum ultracentrifuge Ribosomal subunits, small poly ribosomes, some soluble enzyme complexes Cytosol

The lysed sample is now ready for centrifugation in an ultracentrifuge. An ultracentrifuge consists of a refrigerated, low-pressure chamber containing a rotor which is driven by an electrical motor capable of high speed rotation. Samples are placed in tubes within or attached to the rotor. Rotational speed may reach up to 100,000 rpm for floor model, 150,000 rpm for bench-top model (Beckman Optima Max-XP or Sorvall MTX150), creating centrifugal speed forces of 800,000g to 1,000,000g. This force causes sedimentation of macromolecules, and can even cause non-uniform distributions of small molecules. [8]

Since different fragments of a cell have different sizes and densities, each fragment will settle into a pellet with different minimum centrifugal forces. Thus, separation of the sample into different layers can be done by first centrifuging the original lysate under weak forces, removing the pellet, then exposing the subsequent supernatants to sequentially greater centrifugal fields. Each time a portion of different density is sedimented to the bottom of the container and extracted, and repeated application produces a rank of layers which includes different parts of the original sample. Additional steps can be taken to further refine each of the obtained pellets.

Sedimentation depends on mass, shape, and partial specific volume of a macromolecule, as well as solvent density, rotor size and rate of rotation. The sedimentation velocity can be monitored during the experiment to calculate molecular weight. Values of sedimentation coefficient (S) can be calculated. Large values of S (faster sedimentation rate) correspond to larger molecular weight. Dense particle sediments more rapidly. Elongated proteins have larger frictional coefficients, and sediment more slowly to ensure accuracy. [9]


اللوني تقارب

Affinity chromatography is a very powerful and selective technique that exploits the binding affinities of sample molecules (typically proteins) for molecules covalently linked to the support beads. In contrast to ion-exchange chromatography, where all molecules of a given charge would bind to the column, affinity chromatography exploits the specific binding of a protein or proteins to a ligand that is immobilized on the beads in the column.

For example, if one wanted to separate all of the proteins in a cell lysate that bind to ATP from proteins that do not bind ATP, one could use a column that has ATP attached to the support beads and pass the sample through the column. All proteins that bind ATP will &ldquostick&rdquo to the column, whereas those that do not bind ATP will pass quickly through it. The bound proteins may then be released from the column by adding a solution of ATP that will displace the bound proteins by competing, for the proteins, with the ATP attached to the column matrix.

Histidine tagging

Histidine tagging (His-tagging) is a special kind of affinity chromatography and is a powerful tool for isolating a recombinant protein from a cell lysate. His-tagging relies on altering the DNA coding region for a protein to add a series of at least six histidine residues to the amino or carboxyl terminal of the encoded protein. This &ldquoHis-Tag&rdquo is useful in purifying the tagged protein because histidine side chains can bind to nickel or cobalt ions. Separation of His-tagged proteins from a cell lysate is relatively easy (Figure (PageIndex<8>)).Passing the crude cell lysate through a column with nickel or cobalt attached to beads allows the His-tagged proteins to &ldquostick,&rdquo while the remaining cell proteins all pass quickly through. The His-tagged proteins are then eluted by addition of imidazole to the column. Imidazole, which resembles the side chain of histidine, competes with the His-tagged proteins and displaces them from the column. Although non-tagged proteins in the lysate may also contain histidine as part of their sequence, they will not bind to the column as strongly as the His-tagged protein and will, thus, be displaced at lower imidazole concentrations than needed to elute the His-tagged protein. Surprisingly, many His-tagged proteins appear to function normally despite the added histidines, but if needed, the histidine tags may be cleaved from the purified protein by treatment with a protease that excises the added histidines, allowing the recovery of the desired protein with its native sequence.


Figure (PageIndex<8>): Affinity chromatographic purification of a protein by histidine tagging.Image by Aleia Kim

High performance liquid chromatography (HPLC) is a powerful tool for separating a variety of molecules based on their differential polarities (Figure (PageIndex<9>)). A more efficient form of column chromatography, it employs columns with tightly packed supports and very tiny beads such that flow of solvents/buffers through the columns requires high pressures. The supports used may be polar (normal phase separation) or non-polar (reverse phase separation). In normal phase separations, non-polar molecules elute first followed by the more polar compounds. This order is switched in reverse phase chromatography. Of the two, reverse phase is much more commonly employed due to more reproducible chromatographic profiles (separations) that it typically produces.


Figure (PageIndex<9>): HPLC: Pumps on left/Column in center/Detector on the right. ويكيبيديا


شاهد الفيديو: رحلة داخل الخلية (شهر فبراير 2023).