معلومة

هل يمكن جعل عينة البروتين خالية من 2٪ Triton X-100؟

هل يمكن جعل عينة البروتين خالية من 2٪ Triton X-100؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يحتاج البروتين الذي أقوم بتنقيته إلى محلول شطف بنسبة 2٪ Triton X-100. لقد قمت بصياغة المخزن المؤقت للشطف دون مراعاة CMC. هدفي هو جعل عينة البروتين triton الخاصة بي مجانية للتحقق من ثباتها وتحديد تركيزها. علمت مؤخرًا أنه يمكن تكسير المذيلات عند التخفيف. لذلك ، قمت بتخفيف عينة البروتين الخاصة بي أسفل CMC من triton وحاولت تركيزها باستخدام Sartorius Vivaspin 5K (راتنج PES). قمت بتحميل 500 مايكرولتر من العينة المخففة وتركت مع 100 ميكرولتر بعد التركيز باستخدام فيفاسبين. ولكن ، أعطت هذه العينة قراءة غير طبيعية لما يزيد عن 3 OD بعد الطمس ضد المخزن المؤقت الموجود فيه. أفترض أن تداخل triton يسبب هذه القراءات المتناقضة.


تصوير الدم

أندريه زيوج. Evgeni Ponimaskin ، قيد التقدم في أبحاث الدماغ ، 2014

3.5 فحوصات Zymographic

Zymography (Zymography) هي أي تقنية يمكن استخدامها لدراسة تأثيرات الإنزيمات المائية التي تعمل على أي عينة بيولوجية. وبالتالي ، اعتمادًا على الركيزة ، يمكن أن تستخدم فحوصات zymographic الجزيئات العضوية بما في ذلك الببتيدات والدهون والأحماض النووية ، من بين أمور أخرى ، الكشف عن البروتياز والليباز والنوكلييز. سيركز هذا الفصل على فحوصات zymographic المصممة لاكتشاف البروتياز. ومع ذلك ، نظرًا لأنه من المعروف أن ECM تحتوي على بروتينات عالية الجليكوزيلات ، يمكن للمرء أن يتخيل أن تقنيات zymographic للكشف عن نشاط glycosylases يمكن استخدامها أيضًا لدراسة إعادة تشكيل ECM.

من المهم الإشارة إلى أن هناك تمييزًا واضحًا بين فحوصات zymographic وطرق تصور انقسام ECM الموصوفة سابقًا ، والتي يجب وضعها في الاعتبار باستمرار. لا يتصور Zymography بشكل عام انقسام ECM في حد ذاته ، ولكنه يقدم تقريرًا عن نشاط البروتياز المحدد الذي يعمل على ECM. من هذا النشاط ، يمكن الاستدلال على إعادة تصميم ECM ، ولكن لا يمكن تصورها بشكل مباشر.

مراجعة حديثة بواسطة Vandooren et al. (2013) يميز ثلاثة أنواع من zymography: في هلام zymography و ISZ و في الجسم الحي تصوير الدم (IVZ). ومع ذلك ، لا يمكن تصنيف العديد من المستشعرات الحيوية المشفرة وراثيًا القائمة على البروتينات الفلورية بشكل كافٍ في أي من أنواع zymography التي حددها Vandoreen et al. في هلام zymography خارج نطاق هذا الفصل. يمكن استخدام ISZ لتصور نشاط التحلل على سطح أقسام الأنسجة الحادة أو الثابتة بلطف. يعتمد IVZ على ما يسمى بالمنارات المحللة للبروتين (PBs) مع خصوصية متنوعة للبروتياز التي يتم حقنها في الحيوانات الحية (وبالتالي يجب أن تكون غير سامة) ويتم تصورها باستخدام نوع من في الجسم الحي نظام مجهري.

يستخدم الشكل الأكثر شيوعًا من ISZ جيلاتين DQ وبالتالي يكتشف النشاط الجيلاتيني لـ MMP-2 و MMP-9. يجب توخي الحذر لضمان عدم تدمير النشاط التحلل للبروتين أثناء تحضير العينة ، ولكن أيضًا لا يتم تنشيط الزيموجينات بشكل مصطنع أثناء بروتوكول ISZ. عادةً ما تقصر هذه المحاذير ISZ على عينات حادة أو مجمدة وغير مثبتة ، مما حد بشدة من الدقة التي يمكن تحقيقها باستخدام ISZ. Gawlak وآخرون. (2009) ذكر أن التثبيت اللطيف بمزيج الإيثانول والميثانول ودمج الشمع اللاحق للعينة سمح بالاحتفاظ بالتفاصيل الهيكلية الدقيقة للعينة جنبًا إلى جنب مع نشاط التحلل الجيلاتيني. تم الإبلاغ عن نشاط التحلل الجيلاتيني في جسم الخلية (بما في ذلك النوى) وعمليات الخلايا العصبية والخلايا الدبقية (الخلايا الدبقية قليلة التغصن ، والخلايا النجمية ، والخلايا الدبقية الصغيرة). كان المؤلفون قادرين أيضًا على تأكيد أن بؤر نشاط التحلل الجيلاتيني تتجمع مع مجموعة فرعية من المشابك الجلوتاماتيكية المثيرة ، مما يثبت أن بروتوكول ISZ المنشور يحافظ على تفاصيل البنية التحتية لبنية الخلية.

يمكّن IVZ من توطين النشاط التحلل للبروتين في كائن حي من خلال استخدام PBs المنشط بروتينيًا. ينقسم PB إلى فئتين - واحدة تعتمد على خصائص التبريد الذاتي لبعض الفلوروفورات والأخرى تستخدم الحنق. على سبيل المثال ، Bozdagi et al. (2007) حقن DQ-الجيلاتين في قرن آمون من الفئران المخدرة باليوريثان لدراسة دور MMP-9 في فسيولوجيا الحُصين الناضجة. ومع ذلك ، عانت هذه الدراسة من تألق خلفية عالية ، ومنذ ذلك الحين ، تم تطوير العديد من PBs أكثر كفاءة مع خصوصية متفاوتة لمختلف MMPs. تم تطوير تطوير PBs الجديدة أيضًا من خلال خاصية معينة مشتركة بين عدد من MMPs (MT1-MMP و MMP-7 و MMP-9 Roopali Roy et al. ، 2011 Scherer et al. ، 2008). تحظى مجسات التألق القريب من الأشعة تحت الحمراء (NIRF) بأهمية خاصة ، لأنها تسمح بتحليل العمليات المترجمة في عمق الأنسجة (Akers et al. ، 2012 Kaijzel et al. ، 2010 Lee et al. ، 2012 Scherer et al. ، 2008 Wallis de Vries et al. ، 2009 Wang et al. ، 2009).

تستخدم PBs الأخرى التبريد القائم على FRET للحد من مضان المسبار غير المشقوق (Fudala et al. ، 2011 ، 2012 McIntyre et al. ، 2004). في الآونة الأخيرة ، تم تطوير ببتيد عالي التقارب ضد MT1-MMP والذي يمكن استخدامه في الجسم الحي تم الإبلاغ عن تصوير الورم (Zhu et al. ، 2011). يرتبط الببتيد الموصوف هنا بموقع غير محفز لـ MT1-MMP ، مما يتيح توطين غير بروتيني لـ MT1-MMP. سيليفانوفا وآخرون. (2013) ورقة تصف التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني PB لـ MMP-2 و MMP-9.


الإجراءات التجريبية

المواد

الميثيل-& # x003b2تم شراء -cyclodextran و Triton X-100 من Sigma. أوكتيل جلوكوبيرانوسيد (OG) ومضادات& # x003b1تم شراء الجسم المضاد لترانسدوسين من كالبيوتشيم. تم شراء شبكية عين الأبقار المجمدة ذات اللون الداكن من J. Lawson، Inc. (Lincoln، NE). تم شراء الكوليسترول والفوسفاتيديل كولين وفوسفاتيد إيثانولامين وفوسفاتيديل سيرين وسفينجوميلين من أفانتي بولار ليبيدز (برمنغهام ، AL). كانت الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 2B6 (ضد المحيط / rds) ، 1D5 (ضد ROM-1) ، و 4 D2 (ضد opsin) هدايا سخية من الدكتور روبرت س.مولداي (جامعة كولومبيا البريطانية ، فانكوفر ، كولومبيا البريطانية ، كندا). كانت الأجسام المضادة لـ GARP-1 و Anti-GARP-2 هدايا سخية من Dr. تم شراء الجسم المضاد المضاد للكافولين -1 من BD Biosciences.

عزل أغشية قرص ROS

تم عزل أغشية قرص ROS خالية من حويصلات غشاء البلازما ROS باستخدام الطرد المركزي المتدرج للسكروز والسكروز التفاضلي بشكل أساسي كما هو موضح بالتفصيل سابقًا (6). باختصار ، تم عزل أغشية ROS السليمة من واجهة السكروز 1.11 & # x020131.13 جم / مل وتم معالجتها بالنيورامينيداز والريسين-أغروس. تم فصل ROS المرتبط بالريسين-الاغاروز بين عشية وضحاها في الماء المثلج. نظرًا لأننا لم نتعامل مع التربسين ، فلا ينبغي أن يتعطل تفاعل peripherin / rds-GARP بسبب هذه الشروط (34). تم فصل الأقراص عن غشاء البلازما المرتبط بالريسين-أغروس على تدرجات كثافة السكروز. يتكون غشاء البلازما ROS فقط من 6 & # x020138٪ من الغشاء الكلي في ROS (المرجع 6 والمراجع فيه). في ظل ظروف العزلة الموصوفة (6)

7٪ من إجمالي الغشاء عبارة عن غشاء بلازما مرتبط بالريسين ، مما يشير إلى الحد الأدنى (& # x0003c1٪) من ارتباط غشاء البلازما بالأقراص. تم تكوير أغشية قرص ROS المعزولة عند 17500 دورة في الدقيقة لمدة 25 دقيقة وتم تعليقها في محلول MOPS (10 م م MOPS ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 60 م م كلوريد الصوديوم ، 30 م م كلوريد الصوديوم ، 5 م م م كلوريد2، 1 م ديثيوثريتول ، 5 & # x003bc م أبروتينين ، و 1 & # x003bc m leupeptin) ويستخدم على الفور.

عزل أطواف غشاء مقاومة Triton X-100

تم تحضير أطواف غشاء مقاومة Triton X-100 من أغشية قرصية معزولة بشكل أساسي كما وصفها Seno. وآخرون. (32). تم تعليق أغشية القرص في المخزن المؤقت لـ MOPS إلى تركيز بروتين نهائي قدره 8 & # x0201310 مجم / مل. تمت إضافة Triton X-100 (2٪ ، وزن / حجم) إلى هذا التعليق إلى تركيز نهائي قدره 1٪ (وزن / حجم) ، وتم تجانس المعلقات بثلاث ممرات لمدقة زجاجية من خلال مطحنة نسيج Tenboeck الزجاجية. تم تحضير المتجانسات في الضوء أو الظلام. تم خلط المتجانسة مع 1.23 مل من 2.4 م سكروز للحصول على تركيز نهائي للسكروز يبلغ 0.9 متر وتم نقله إلى أنبوب الطرد المركزي SW 41. تمت تراكب العينة بمحلول السكروز في محلول MOPS عند تقليل تركيزات السكروز بمقدار 0.8 و 0.7 و 0.6 و 0.5 متر وطردها عند 46000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ساعة عند 4 & # x000b0 درجة مئوية. تم جمع الكسور وتحليلها من أجل الكوليسترول والفوسفات والبروتين. في تجارب التحكم ، تمت معالجة حجم متساوٍ من أغشية القرص مع محتوى متطابق من الفوسفات والبروتين بنسبة 2 ٪ OG كما هو موضح سابقًا (35).

في بعض التجارب ، تم استنفاد الكوليسترول في أغشية قرص ROS المعزولة عن طريق المعالجة بالميثيل-& # x003b2-Cyclodextran لمدة 30 دقيقة عند 37 & # x000b0C (36). بعد الميثيل-& # x003b2- معالجة السيكلودكستران ، تم استعادة أغشية القرص بالطرد المركزي وتعليقها في محلول MOPS قبل الذوبان باستخدام Triton X-100. في إحدى الدراسات ، عولجت الطوافات المعزولة منخفضة الكثافة الطافية بميثيل-& # x003b2-Cyclodextran كما هو موضح أعلاه. بعد معالجة السيكلودكستران ، تم طرد الطوافات عند 50000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة ، وتم تعليق الحبيبات لفحوصات الكوليسترول والفوسفات والبروتينات وتحليل البقعة الغربية.

الترسيب المناعي وتحليل البقعة الغربية

أجريت دراسات الترسيب المناعي على النحو الموصوف (37). تم استرداد الكسور المعزولة من تدرجات كثافة السكروز ، و 10 & # x003bcتمت إضافة l من الجسم المضاد الأولي (الأجسام المضادة أحادية النسيلة البقري / rds (mAb) 2B6 أو مضاد ROM-1 mAb 1D5) إلى كل من العينات واحتضانها طوال الليل مع الدوران عند 4 & # x000b0 درجة مئوية. بعد الترسيب المناعي بـ 150 & # x003bcلتر من البروتين A-Sepharose ، تم غسل المجمعات خمس مرات باستخدام عازلة Nonidet P-40 وتم تعليقها في محلول عينة SDS-PAGE 2 & # x000d7 يحتوي على & # x003b2- مركابتوإيثانول. بعد التسخين عند 85 & # x000b0C لمدة 10 دقائق ، تم طرد العينات عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، وتم فصل المجمعات المناعية بواسطة SDS-PAGE ونقلها إلى النيتروسليلوز لتحليل اللطخة الغربية (17) أو ملطخة بالفضة (38) . تم تصور العصابات المناعية باستخدام نظام الكشف عن ECL (Amersham Biosciences). تم حساب الكتل الجزيئية للأنواع المناعية باستخدام صF قياسات علامات الكتلة الجزيئية.

تحليل التركيب الدهني

تم تحديد الكوليسترول كما هو موصوف (39). تم قياس الفوسفات كما هو موصوف (40) وتعديله (41). تم استخلاص الدهون من الأجزاء منخفضة الكثافة الطافية كما هو موصوف (42). قبل استخلاص الدهون من أجزاء الأغشية المذابة ، تم غسيلها لمدة 48 ساعة مقابل تغييرين بمقدار 10 م م HEPES و 0.5 م كلوريد الصوديوم لتقليل تركيز المنظف. في كلتا الحالتين ، تم استخلاص 90 & # x000b1 1.2٪ من إجمالي الفسفوليبيد ، مما يشير إلى أن وجود أي بقايا Triton X-100 في الأجزاء المذابة لم يتداخل مع استخلاص الدهون. تم تبخير مستخلصات الكلوروفورم تحت تأثير N.2 وأعيد تعليقه في CHCl3/ MeOH (2: 1). تم حل الدهون عن طريق TLC متسلسل أحادي البعد على Chromatograms هلام السيليكا H المطورة في الكلوروفورم / الميثانول / حمض الأسيتيك / الماء (25: 15: 4: 2). تم تطوير الألواح بنفس نظام المذيبات ثلاث مرات متتالية كما هو موصوف (43). تم تحديد البقع من خلال المقارنة مع هجرة المعايير المعروفة (فوسفاتيديل كولين ، فوسفاتيديل إيثانولامين ، فسفاتيديل سيرين ، سفينجوميلين ، وكوليسترول) بعد تلطيخ محدد باستخدام دراغندورف ، نينهيدرين ، وحمض الكبريتيك. تم كشط البقع ، وتم تحديد الفوسفات الكلي كما هو موضح أعلاه.


مناقشة

عندما يكون تركيز TX100 أقل من نطاق CMC (أي 0.17 مم وأقل) ، قد يعمل الفاعل بالسطح كعامل نفاذي اعتمادًا على جرعة ومدة التعرض للخلايا. يعد هذا نطاقًا جيدًا لترنسفكأيشن للخلية مع عامل إضافي ، ولكن التعرض المطول للخلايا حتى في هذه التركيزات المنخفضة يمكن أن يؤدي إلى بعض موت الخلية. عند استخدام تركيزات TX100 في نطاق CMC ، & gt 0.18 ملي مولار ، يتفكك غشاء الخلية مما يتسبب في انهيار بنية الخلية بأكملها وموت الخلية في غضون بضع دقائق.

يسمح SECM للمرء بمتابعة سلسلة من التغييرات التي تمر بها الخلية من حيث حجمها وشكلها ونفاذية الغشاء. عند 0.17 ملي مولار أو أقل ، يوفر تركيز TX100 وقتًا كافيًا لدراسة سلوك الخلية ويسمح بتفسير البيانات. عند إضافة 0.17 ملي مولار من محلول TX100 إلى الخلية ، يصبح الغشاء أولًا منفذاً بما يكفي للسماح للجزيئات المحبة للماء ، مثل فيروسيانيد ، بالتخلل في غشاء الخلية ، بينما يظل ارتفاع الخلية غير متأثر. حتى عند تعرضها لفترة طويلة (20 دقيقة) ، تتعافى الخلايا من تلف الغشاء بعد إزالة الفاعل بالسطح. من حين لآخر ، تخضع الخلية لانخفاض في الارتفاع أثناء تعافيها من فترات زيادة النفاذية. عند إضافة 0.20 ملي مولار TX100 ، يصبح غشاء الخلية "مفرطًا في درجة الحرارة" خلال دقيقة واحدة ، عند حدوث ضرر لا رجعة فيه من الفاعل بالسطح. في نهاية المطاف تفقد الخلية سلامتها وتنهار ، وهو ما يمكن ملاحظته بواسطة SECM كتيار أعلى في الفحص بالأكسجين أو منحنى اقتراب يشبه إلى حد كبير النهج المتبع فوق الطبق. قد يكون سبب انحلال الطبقة الدهنية الثنائية هو اضطراب تفاعل الدهن-الدهن بسبب التفاعلات المعززة للمزيل الدهني والمنظف. يؤدي إدخال جزيئات المنظف الفردية أو الركام الصغير بتركيزات أقل من CMC مباشرة إلى جعل الغشاء أكثر نفاذاً لمجموعة متنوعة من الجزيئات التي لا يمكن أن تدخل داخل الخلية مما يسمح بترنسفكأيشن. ومع ذلك ، في تركيزات المنظف حيث تتشكل المذيلات (عند أو أعلى من نطاق CMC) ، يحدث انهيار سريع للغشاء (11 ، 28-31).


تاريخ الإندوتوكسين

تعود الدراسات حول حدوث الحمى بعد إعطاء بعض الحلول عن طريق الوريد إلى ما قبل القرن التاسع عشر. في عام 1894 ، أظهر ساناريلي أن الثقافات السائلة لـ عصية إيبرث، خالٍ من الكائنات الدقيقة ، يمكن أن ينتج تسممًا مصحوبًا بالحمى عند حقنه في الحيوانات ، وأحيانًا مميتة (15). بحلول نهاية القرن التاسع عشر ، تم استخدام التسمية وحمى الحقن بشكل عام للتعبير عن تفاعلات الحمى التي لوحظت بعد إعطاء العديد من الحلول في الوريد. أدى استخدام الأدوية عن طريق الحقن الوريدي في القرن العشرين إلى زيادة عدد هذه الحوادث ، مما دفع العديد من الباحثين إلى تطوير سلسلة من الأعمال التقييمية حول هذا الموضوع.

في عام 1912 ، أنشأ Hort and Penfold الاسم & ldquopyrogenic & rdquo لتعيين & ldquowaters & rdquo التي ، عند حقنها ، تسبب & ldquo ارتفاع الحرارة & rdquo. تم استعادة هذا التعيين مرة أخرى ، في عام 1923 ، من قبل فلورانس سيبرت ، الذي أطلق على المواد البيروجينية & ldquohyperthermizing & rdquo ، والتي تحتوي إما على بكتيريا ميتة و ndash سليمة أو مفككة ، مسببة للأمراض أم لا & ndash أو في كثير من الأحيان منتجات التمثيل الغذائي البكتيرية ، مثل البروتين منزوع الصبغة ، السموم الداخلية أو السموم الخارجية (16 ، 17).

أصبح مصطلح بيروجين شائعًا بعد الاستخدام المتكرر من قبل Seibert ، ولهذا السبب غالبًا ما يُنسب إنشاءه إليه (17). واصل Seibert وزملاؤه البحث الذي بدأه Hort و Penfold ، وعزل كائن حي دقيق سالب الجرام من الماء المقطر ، والذي كان قادرًا على إنتاج البيروجينات (15). حدد المؤلفون هذا الكائن الدقيق باسم البكتيريا الحمضية، مدركين أنها لم تكن بكتيريا جديدة لأن عدة أنواع من الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن تنتج البيروجينات (16).

حدث الدافع الرئيسي لزيادة المعرفة حول البيروجينات بين عامي 1925 و 1945. على وجه الخصوص ، يستحق Co-Tui ، بمساعدة Schrift ، ائتمانات خاصة لإثبات أن البكتيريا سالبة الجرام هي أخطر منتجي البيروجينات. (18). هذا لا يعني أن البكتيريا موجبة الجرام لا يمكنها توليد مثل هذه الجزيئات ، ولكنها تفعل ذلك في مستوى أقل. في الواقع ، البكتيريا موجبة الجرام ، عند تدميرها بالحرارة ، لا تنتج أي بيروجين تقريبًا ، لأنه في مثل هذه البكتيريا تتشكل السموم الخارجية ذات الأصل البروتيني بشكل عام ، وبالتالي يتم إبطال مفعولها بالحرارة بسهولة. من ناحية أخرى ، عادةً ما تولد البكتيريا سالبة الجرام سمومًا داخلية تتكون أساسًا من عديدات السكاريد الدهنية ، وبالتالي فهي أكثر مقاومة للحرارة من الأنواع الأولى.

وفقًا لـ Westphal (1945) ، فإن البيروجينات ، التي يجب أن تخشى حقًا في المستحضرات الصيدلانية ، تتوافق مع السموم الداخلية للبكتيريا سالبة الجرام ، وتوجد مجمعات عديدات السكاريد الدهنية في الطبقة الخارجية لجدار الخلية البكتيرية (19). في الأساس ، تنشأ البيروجينات في الكائنات الحية الدقيقة من المعوية يُعتقد أنه الملوث الرئيسي لمحلول قابل للحقن محضر بدون عمليات التطهير والتعقيم المناسبة. بعد حوالي عقدين من الزمان ، تم تطوير دراسة تعاونية من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة و 14 صناعة صيدلانية لإنشاء نظام حيواني سيكون مناسبًا لتقييم & ldquopyrogenicity & rdquo الحلول. بلغت هذه الدراسة ذروتها في تطوير أول اختبار بيروجين رسمي في الأرانب ، والذي تم تضمينه في USP XII ، في عام 1942. وبالتوازي مع ذلك ، بذلت جهود أخرى لتنقية وتوصيف السموم الداخلية ، وتم الحصول على عوامل بيروجينية معزولة من قبل العديد من الباحثين (17). ، 19)

كان Shear and Turner (1943) أول الباحثين الذين استخدموا مصطلح عديدات السكاريد الدهنية لتسمية مستخلص الذيفان الداخلي ، وهو مصطلح يصف طبيعة الذيفان الداخلي ، وقد تبناه المجتمع العلمي (20). في عام 1954 ، شرح ويستفال والمتعاونون معه بالتفصيل استخدام أنظمة الفينول المائي لإنتاج عديدات السكاريد الدهنية المنقى (LPS) ، الخالية من البروتينات ، من عدة المعوية. (15 ، 21 ، 22). وبالتالي ، تم إحراز تقدم كبير في السنوات الأخيرة في فهم التنظيم الجزيئي والآليات الكامنة وراء الأنشطة الضارة والمفيدة للسموم الداخلية (8 ، 23).

مادة الإندوتوكسين: الخصائص الكيميائية والفيزيائية

السموم الداخلية ، وتسمى أيضًا عديدات السكاريد الدهنية (LPS) ، هي مكون رئيسي للغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام (الشكل 1). وهي تتكون من جزء عديد السكاريد المحبة للماء ، والتي ترتبط تساهميًا بشق دهني كاره للماء (ليبيد أ) (الشكل 2) (3 ، 6 ، 24). يتكون LPS من معظم الأنواع من ثلاث مناطق متميزة: منطقة مستضد O ، و oligosaccharide الأساسية و Lipid A (LipA) (الشكل 2).

شكل 1: النموذج الجزيئي للأغشية الداخلية والخارجية لـ بكتريا قولونية K-12 وفقًا لـ Raetz et al. ، 1991 (24). الشكل الهندسي: تمثل الأشكال البيضاوية والمستطيلات بقايا السكر كما هو موضح ، بينما تمثل الدوائر مجموعات رأس قطبية من دهون مختلفة. الاختصار: PPEtn (إيثانولامين بيروفوسفات) LPS (عديد السكاريد الدهني) Kdo (2-keto-3-deoxyoctonic acid).

الشكل 2: التركيب الكيميائي للذيفان الداخلي من بكتريا قولونية O111: B4 وفقًا لـ Ohno and Morrison 1989 (25).(Hep) L-glycerol-D-manno-heptose (Gal) galactose (Glc) glucose (KDO) 2-keto-3-deoxyoctonic acid (NGa) N-acetyl-galactosamine (NGc) N-acetyl-glucosamine.

الدهن أ هو الجزء الأكثر حفظًا من الذيفان الداخلي (8 ، 26) وهو مسؤول عن معظم الأنشطة البيولوجية للسموم الداخلية ، أي سميته. يتكون الذيفان الداخلي من بقايا D-glucosamine المرتبطة بـ b-1،6 ، المرتبطة تساهميًا ببدائل 3-hidroxy-acyl مع 12-16 ذرة كربون عبر روابط الأميد والإستر. يمكن زيادة أسترة هذه الأحماض الدهنية المشبعة. يتبنى هذا الجزء الكاره للماء من الذيفان الداخلي ترتيبًا سداسيًا مرتبًا ، مما ينتج عنه بنية أكثر صلابة مقارنة ببقية الجزيء (8 ، 9). السلالات التي تفتقر إلى الدهون أو الذيفان الداخلي غير معروفة. يحتوي سكاريد قليل النواة على بنية محفوظة مع حمض ديوكسي-د-مانو-2-أوكتولوسونيك داخلي 3 & # 8209 (KDO) - منطقة هيبتوز ومنطقة سداسية خارجية. في بكتريا قولونية الأنواع ، خمسة أنواع أساسية مختلفة معروفة ، و السالمونيلا تشترك الأنواع في بنية أساسية واحدة فقط. المنطقة الأساسية القريبة من الدهون A والدهون A نفسها مفسفرة جزئيًا (pK1 = 1.3 ، pK2 = 8.2 من مجموعات الفوسفات في الدهون A) ، وبالتالي تظهر جزيئات الذيفان الداخلي شحنة سالبة صافية في محاليل البروتين الشائعة (8 ، 27). يتكون مستضد O بشكل عام من سلسلة من السكريات القليلة المتماثلة (مع ثلاثة إلى ثمانية سكريات أحادية لكل منها) ، والتي تعتبر سلالة محددة ومحددة للهوية المصلية للبكتيريا المعنية (8).

تختلف الكتلة المولية لمونومر الذيفان الداخلي من 10 إلى 20 كيلو دالتون ، نظرًا لتباين سلسلة السكاريد القليل حتى يمكن العثور على الكتل القصوى البالغة 2.5 (O- مستضد ناقص) و 70 (مستضد O طويل جدًا) كيلو دالتون. من المعروف أن الذيفانات الداخلية تشكل مجاميع فوق جزيئية مختلفة في المحاليل المائية بسبب هياكلها الأمفيباثية. تنتج هذه المجاميع عن التفاعلات غير القطبية بين سلاسل الدهون وكذلك الجسور المتولدة بين مجموعات الفوسفات بواسطة الكاتيونات ثنائية التكافؤ (1). تمت دراسة الهياكل الكلية من خلال العديد من التقنيات مثل المجهر الإلكتروني ، حيود الأشعة السينية ، التحليل الطيفي FT-IR ، والرنين المغناطيسي النووي. أظهرت نتائج هذه الدراسات أنه في المحاليل المائية ، يمكن للسموم الداخلية أن تتجمع ذاتيًا في مجموعة متنوعة من الأشكال ، مثل الترتيبات المقلوبة الصفيحية والمكعبة والسداسية ، بأقطار تصل إلى 0.1 مم و 1000 كيلو دالتون ، وثبات عالٍ اعتمادًا على المحلول. الخصائص (الأس الهيدروجيني ، الأيونات ، السطحي ، إلخ) (28 ، 29). يُقترح أن البروتينات قد تغير أيضًا التوازن عن طريق إطلاق مونومرات الذيفان الداخلي من الركام (6 ، 8). وفقًا للديناميكيات الجزيئية ، فإن الهيكل ثلاثي الأبعاد للذيفان الداخلي ، وخاصة مستضد السطح الطويل ، يكون أكثر مرونة من التركيب الكروي للبروتينات (8).

يتم التخلص من السموم الداخلية بكميات كبيرة عند موت الخلايا وكذلك أثناء النمو والانقسام. إنها شديدة الاستقرار للحرارة ولا يتم إتلافها في ظل ظروف التعقيم العادية. يمكن تثبيط الذيفان الداخلي عند تعرضه في درجة حرارة 250 درجة مئوية لأكثر من 30 دقيقة أو 180 درجة مئوية لأكثر من 3 ساعات (28 ، 30). يمكن أيضًا استخدام الأحماض أو القلويات بقوة 0.1 متر على الأقل لتدمير الذيفان الداخلي في مقياس المختبر (17).

آلية عمل إندوتوكسين

يسبب الذيفان الداخلي مجموعة واسعة من التأثيرات الفيزيولوجية المرضية ، مثل صدمة الذيفان الداخلي ، وإصابة الأنسجة ، والموت (3). لا تعمل السموم الداخلية مباشرة ضد الخلايا أو الأعضاء ولكن من خلال تنشيط جهاز المناعة ، وخاصة الخلايا الوحيدة والبلاعم ، وبالتالي تعزيز الاستجابات المناعية. تطلق هذه الخلايا وسطاء ، مثل عامل نخر الورم والعديد من الإنترلوكينات والبروستاجلاندين وعامل تحفيز المستعمرات وعامل تنشيط الصفائح الدموية والجذور الحرة (31 ، 32). الوسطاء لديهم نشاط بيولوجي قوي وهم مسؤولون عن الآثار الجانبية عند التعرض للسموم الداخلية. وتشمل هذه التغييرات في بنية ووظيفة الأعضاء والخلايا ، والتغيرات في وظائف التمثيل الغذائي ، وزيادة درجة حرارة الجسم ، وتفعيل سلسلة التخثر ، وتعديل ديناميكا الدم ، وتحريض الصدمة. تم إجراء العديد من المحاولات لمنع أو علاج الآثار الضارة للسموم الداخلية على الخلايا المناعية ، مثل استخدام الأجسام المضادة للسموم الداخلية ، والتركيبات الجزئية للذيفان الداخلي لمنع مضادات مستقبلات الذيفان الداخلي. ومع ذلك ، فإن تفاعل السموم الداخلية مع الخلايا المناعية لا يتم بوساطة مستقبلات محددة فقط. قد يحدث فتيلة الخلية أيضًا عن طريق الإقحام غير النوعي لجزيئات الذيفان الداخلي في أغشية الخلايا المستهدفة (33).

أخيرًا ، تجدر الإشارة إلى أن السموم الداخلية قد يكون لها أيضًا تأثيرات مفيدة. لقد تم استخدامها في العلاج بالحمى الاصطناعية ، لتدمير الأورام وتحسين الدفاع المناعي بشكل غير محدد. وصف بينيت ذات مرة عدم اليقين بشأن دوره في صحة الإنسان. من ناحية أخرى ، يجب تجنب أي تعرض غير ضروري للسموم الداخلية بشكل صارم لمنع حدوث مضاعفات. هذا ينطبق بشكل خاص على الأدوية التي يتم إعطاؤها عن طريق الوريد.

تقنيات تحديد الإندوتوكسين

التقنيات المستخدمة بشكل شائع المعتمدة من قِبل إدارة الأغذية والعقاقير (FDA) للكشف عن الذيفان الداخلي هي اختبار بيروجين الأرانب ومقايسة Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (35 ، 36). تم تطوير اختبار بيروجين الأرانب في عشرينيات القرن الماضي ، ويتضمن قياس ارتفاع درجة حرارة الأرانب بعد الحقن الوريدي لمحلول الاختبار. نظرًا لتكلفته العالية ووقت إنجازه الطويل ، فقد تضاءل استخدام اختبار بيروجين الأرانب ، ويتم الآن تطبيقه فقط مع اختبار LAL لتحليل المركبات البيولوجية في مرحلة التطوير السابقة للأجهزة الوريدية. اليوم أكثر أنظمة الكشف عن السموم الداخلية شيوعًا تعتمد على LAL ، المشتق من دم سلطعون حدوة الحصان ، ليمولوس بوليفيموس، والجلطات عند التعرض للسموم الداخلية. إن أبسط شكل من أشكال مقايسة LAL هو مقايسة جل الجلطة LAL. عندما يتم الجمع بين اختبار LAL مع تخفيف العينة المحتوية على الذيفان الداخلي ، سيتم تكوين هلام بشكل متناسب مع حساسية الذيفان الداخلي للمقايسة المعطاة. يتم تقريب تركيز الذيفان الداخلي من خلال الاستمرار في استخدام مقايسة أقل حساسية حتى يتم الحصول على تفاعل سلبي (لا توجد جلطة يمكن ملاحظتها). يمكن أن يتطلب هذا الإجراء عدة ساعات (5 ، 36). تم تعريف تركيز 0.5 EU / mL على أنه الحد الفاصل بين العينات البيروجينية وغير المولدة للحمى (17 ، 36).

بالإضافة إلى تقنية الجلطة الهلامية ، طور المصنعون أيضًا طريقتين أخريين: تقنية مقياس التعكر LAL وتقنية LAL التوليفية. تعتمد هذه التقنيات الأحدث على الحركية ، مما يعني أنها يمكن أن توفر تركيز الذيفان الداخلي عن طريق استخراج الاستجابات في الوقت الفعلي لمقايسة LAL. يحتوي مقايسة LAL المتعثرة على ما يكفي من تجلط الدم لتكوين العكارة عند انشقاقه بواسطة إنزيم التخثر ، ولكن ليس بما يكفي لتشكيل جلطة (37). مقايسة العكر LAL ، عند مقارنتها بمقايسة جل الجلطة LAL ، تعطي قياسًا كميًا أكثر للذيفان الداخلي على مدى من التركيزات (0.01 EU / mL إلى 100.0 EU / mL.). يعتمد هذا الاختبار على زيادة التعكر بسبب تخثر البروتين المرتبط بتركيز الذيفان الداخلي في العينة. يتم قياس الكثافة الضوئية لمختلف تخفيفات عينة الاختبار وربطها بتركيز الذيفان الداخلي بمساعدة منحنى قياسي تم الحصول عليه من عينات ذات كميات معروفة من الذيفان الداخلي (38). يختلف مقايسة الركيزة الكروموجينية الحركية عن تفاعلات الجلطة الهلامية والتفاعلات العكسية لأن مادة التخثر يتم استبدالها جزئيًا أو كليًا بركيزة صبغية (39). عندما تتحلل بالماء بواسطة إنزيم ما قبل التخثر ، تطلق الركيزة الصبغية مادة صفراء اللون تُعرف باسم ص-نيتروانيلين. يرتبط الوقت اللازم للحصول على المادة الصفراء بتركيز السموم الداخلية (40). ومع ذلك ، فإن اختبارات قياس التعكر الحركي والكروموجينيك ، على الرغم من أنها أكثر دقة وأسرع من الجلطة الهلامية ، لا يمكن استخدامها للسوائل ذات التعكر المتأصل مثل الدم والسوائل ذات اللون الأصفر ، على سبيل المثال البول ، وقد يتأثر أدائها بأي ترسيب من المحلول (37). لذلك ، تمت دراسة طرق مختلفة للكشف عن الذيفان الداخلي في عينات مختلفة (37 ، 41).

تفاعلات إندوتوكسين مع البروتينات

يُظهر عدد من الجزيئات الحيوية تفاعلات مع السموم الداخلية ، مثل البروتين المرتبط بعديد السكاريد الدهني (LBP) ، أو بروتين زيادة النفاذية / مبيد الجراثيم (BPI) ، أو مكون الأميلويد P ، أو البروتين الموجب (42 ، 43) ، أو الإنزيم المستخدم في مقايسة السموم الداخلية البيولوجية (anti-LPS) عامل من ليمولوس محللة الخلايا الأميبية (LAL) (44). تشارك هذه البروتينات بشكل مباشر في تفاعل العديد من الأنواع المختلفة عند إعطاء الذيفان الداخلي (45 ، 46). يمكن افتراض التعرف الجزيئي على أنه تفاعلات مع الأجسام المضادة للسموم الداخلية ومستقبلات الذيفان الداخلي البروتيني (مثل CD14 ، CD16 ، CD18) (47). تتفاعل بروتينات أخرى مع السموم الداخلية حتى أنه ليس لها روابط قوية بآلية بيولوجية ، مثل الليزوزيم (25) واللاكتوفيرين (48) ، وهي بروتينات أساسية (ص.أنا& gt7) ، يمكن افتراض أن التفاعلات الكهروستاتيكية هي القوة الدافعة الرئيسية. بغض النظر عن الآلية التي تثبت أنها الأكثر أهمية ، تؤدي هذه التفاعلات إلى إخفاء جزيئات الذيفان الداخلي ، وبالتالي لا تتم إزالة هذه الجزيئات في إجراءات الإزالة. تم وصف مثال نموذجي بواسطة Karplus et al. (49).

ومع ذلك ، يجب أن توجد آليات أخرى كتفاعلات مع الهيموجلوبين المحايد (50) وحتى البروتينات الحمضية (صأنا& lt7) تحدث أيضًا بقوة أيونية منخفضة. لا يزال النقاش مثيرًا للجدل حول كيفية حدوث هذه التفاعلات. بشكل عام ، يمكن تصور التفاعلات الكارهة للماء مع البروتينات. ومع ذلك ، لا يوجد دليل قوي على أنه يقود آلية التفاعل. من الأرجح أن التنافس بين المجموعات الكربوكسيلية المرتبطة بالبروتين ومجموعات حمض الفوسفوريك المرتبطة بالسموم الداخلية لـ Ca2 + قد تؤدي إلى جسور الكالسيوم المستقرة ديناميكيًا بين البروتينات والسموم الداخلية (8).
حقيقة أن LPS تشكل مجاميع micellar التي تعتبر الأشكال النشطة بيولوجيًا لـ LPS (51) يمكن أن تشير إلى أن البروتينات المتعددة تتفاعل مع جزيئات LPS. ما وآخرون. اقترح (2006) (52) شكل تجميع بديل ، حيث يكون التجميع الذاتي لجزيئات الدهون ، وهو بروتين يعمل كمؤيد للتخثر (53-55) ، في هياكل كروية نتيجة لتفاعلات قليلة القسيمات. قد يوفر هذا منتجات تخثر تشبه القفص ، حيث تشكل الشق الدهني طبقة واقية تفصل السم عن التفاعل مع البيئة المحيطة.

بسبب تفاعلات البروتين والسموم الداخلية ، تتطلب إزالة السموم الداخلية من محاليل البروتين تقنيات قادرة على توليد تفاعلات قوية مع السموم الداخلية ، مثل كروماتوغرافيا التقارب. بدلاً من ذلك ، قد يؤدي التفكك المحدد لمجمعات البروتين والندشندوتوكسين إلى تحسين توافر جزيئات الذيفان الداخلي للإزالة. نظرًا للتنوع الكبير في المنتجات ، لا يمكن تطوير طريقة عامة واحدة لإزالة السموم الداخلية من جميع المنتجات.

تقنيات إزالة مادة إندوتوكسين

لقد جذب السؤال حول كيفية إجراء إزالة السموم الداخلية بطريقة اقتصادية انتباه العديد من الباحثين وقد & ndash على الرغم من عدم نشره & ndash سبب إعادة ترتيب العملية في كثير من الحالات. ومع ذلك ، لم يتم حل هذه المشكلة بعد بشكل مرض. مناقشة الجوانب ذات الصلة لإزالة السموم الداخلية من المستحضرات البيولوجية ومراجعة نقدية للنهج الحالية إلزامية من أجل تطوير طرق أكثر دقة في المستقبل.

في صناعة المستحضرات الصيدلانية ، من المعروف أن العديد من الطرق البديلة تنتج منتجات ذات مستويات منخفضة من السموم الداخلية. ومع ذلك ، فإن تنوعها يشير إلى معضلة في إزالة السموم الداخلية. تم تطوير العديد من الإجراءات الخاصة بالبروتينات الدوائية ، مع الاستفادة من خصائص عملية الإنتاج ، والمصممة لتناسب متطلبات المنتج المحددة. لذلك ، يعالج كل إجراء المشكلة بطريقة مختلفة تمامًا ، ولا يتبين أن أيًا منها قابل للتطبيق على نطاق واسع. كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني ، على سبيل المثال ، يحتمل أن تكون مفيدة لإزالة التلوث من البروتينات موجبة الشحنة ، مثل urokinase (56). ومع ذلك ، فإن إزالة التلوث من البروتينات سالبة الشحنة سيكون مصحوبًا بخسارة كبيرة في المنتج بسبب الامتصاص (27 ، 57). للبروتينات الصغيرة ، مثل الميوجلوبين (مص

18000 Da) ، يمكن أن يكون الترشيح الفائق مفيدًا لإزالة تجمعات الذيفان الداخلي الكبيرة. مع البروتينات الكبيرة ، مثل الغلوبولين المناعي (مص

150000 دا) لن يكون الترشيح الفائق فعالاً. بالإضافة إلى ذلك ، قد يفشل الترشيح الفائق إذا تسببت التفاعلات بين السموم الداخلية والبروتينات في تغلغل مونومرات الذيفان الداخلي مع البروتينات المنتقاة عبر الغشاء.

يمكن اعتبار السموم الداخلية ثابتة في درجة الحرارة ودرجة الحموضة ، مما يجعل إزالتها واحدة من أصعب المهام في العمليات النهائية أثناء تنقية البروتين (58 ، 59). تصبح إزالة السموم الداخلية أكثر صعوبة عندما ترتبط بالجزيئات الحيوية القابلة للتغير ، مثل البروتينات (60). عادة ما يتم استخدام عدد من الأساليب لتقليل تلوث السموم الداخلية لمستحضرات البروتين ، بما في ذلك كروماتوجرافيا التبادل الأيوني (61 ، 62) ، والممتزات المتقاربة ، مثل L- هيستيدين ، بولي- L- ليسين ، بولي (& جاما- ميثيل L- جلوتامات ) ، والبوليميكسين ب (57 ، 63 ، 64) ، كروماتوجرافيا الترشيح الهلامي ، الترشيح الفائق ، الطرد المركزي المتدرج للسكروز (65) ، والفصل الطوري Triton X-114 (66 ، 67). نجاح هذه التقنيات في فصل LPS من البروتينات يعتمد بشدة على خصائص البروتين الهدف (9).

هناك عاملان مهمان يؤثران على نجاح أي نهج هما ألفة الذيفان الداخلي ومستضد البروتين للدعم اللوني أو الوسائط المستخدمة وتقارب الذيفان الداخلي لمستضد البروتين. العامل الثالث هو كيف يمكن تعديل ألفة السموم الداخلية للبروتين من خلال عوامل مثل درجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، والمنظفات (المواد الخافضة للتوتر السطحي) ، والمذيبات ، ومزيلات الصبغة (4).

عادةً ما تكون الإجراءات المستخدمة لإزالة السموم الداخلية غير مرضية فيما يتعلق بالانتقائية وقدرة الامتصاص واستعادة البروتين. في الإزالة الانتقائية للسموم الداخلية من المحاليل الخالية من البروتين ، من السهل إزالة السموم الداخلية عن طريق الترشيح الفائق للاستفادة من الأحجام المختلفة للذيفان الداخلي والماء ، أو عن طريق الامتزاز غير الانتقائي باستخدام مادة ماصة كارهة للماء (68) أو مبادل الأنيون ( 69). للإزالة الانتقائية للسموم الداخلية من محاليل البروتين ، من الضروري معرفة شكل السموم الداخلية في محاليل البروتين.

افترض Hirayama و Sakata (2002) (6) أن تكتلات الذيفان الداخلي تشكل تجمعات جزيئية فائقة مع مجموعات الفوسفات كمجموعة رئيسية وتظهر شحنة صافية سالبة بسبب مجموعات الفوسفات التي تنشأ من الدهون A (6). تشير هذه الخصائص إلى أن التفاعل الأيوني يلعب دورًا مهمًا في الارتباط بين مجموعات الممتزات الموجبة والفوسفات للسموم الداخلية. عند استخدام الممتزات الكارهة للماء في محاليل البروتين ، يُقترح أن هناك أيضًا ارتباط كاره للماء بين المواد الممتزة والمجموعات المحبة للدهون من السموم الداخلية. تعتمد عمليات الارتباط هذه على خصائص البروتينات (الشحنة الصافية ، الكراهية للماء) وظروف المحلول (الأس الهيدروجيني ، القوة الأيونية).

بعض التقنيات شائعة الاستخدام لإزالة ملوثات السموم الداخلية هي الترشيح الفائق (70) وكروماتوجرافيا التبادل الأيوني (71). يعتبر الترشيح الفائق ، على الرغم من فعاليته في إزالة السموم الداخلية من الماء ، طريقة غير فعالة في وجود البروتينات ، والتي يمكن أن تتلف بفعل القوى الفيزيائية (72). مبادلات الأنيون ، التي تستفيد من صافي الشحنة السلبية للسموم الداخلية ، تم استخدامها على نطاق واسع لامتصاص السموم الداخلية. ومع ذلك ، عندما تحتاج البروتينات سالبة الشحنة إلى إزالة التلوث ، فإنها قد تمتص بشكل مشترك على المصفوفة وتسبب خسارة كبيرة في المواد البيولوجية. أيضا ، البروتينات الصافية موجبة الشحنة تشكل معقدات مع السموم الداخلية ، مما يتسبب في سحب البروتينات للسموم الداخلية على طول العمود وبالتالي تقليل كفاءة إزالة السموم الداخلية (57).

تم إثبات أن Alkanediols عوامل فعالة لفصل LPS عن مجمعات البروتين LPS أثناء الفصل اللوني مع الدعامات الأيونية. فعاليتها في تقليل معقد البروتين باستخدام LPS تعتمد على (I) حجم الكانيديول ، (II) الشكل الأيزومري للكانديول ، (III) طول غسول الكانيديول ، (IV) تركيز الكانيديول ، و (V) نوع الدعم الأيوني المستخدم ، الكاتيوني أو الأنيوني. Alkanediol غير قابل للاشتعال وبالتالي فهو بدائل أكثر أمانًا عند مقارنته بالكحول (الإيثانول أو الأيزوبروبانول) الذي تم استخدامه أيضًا لإزالة LPS من مجمعات البروتين LPS (9). تعتبر إزالة LPS أكثر كفاءة في المبادلات الموجبة مقارنة بالمبادلات الأنيونية.

من أجل إزالة السموم الداخلية من مستحضرات البروتين المؤتلف ، يمكن تمرير محلول البروتين من خلال عمود يحتوي على مادة البوليميكسين ب المعطلة في Sepharose 4B ، على أمل أن يرتبط الذيفان الداخلي الملوث بالهلام. وبالمثل ، فإن الهيستدين المعطل في Sepharose 4B لديه أيضًا القدرة على التقاط الذيفان الداخلي من محاليل البروتين (63). يعتبر اللوني تقارب Polymyxin B فعالاً في تقليل الذيفان الداخلي في المحاليل (73). Polymyxin B ، مضاد حيوي ببتيد ، له ألفة ارتباط عالية جدًا بالدهون مجموعة من معظم السموم الداخلية (74). Karplus et al. أبلغ (1987) (49) عن طريقة محسنة للكروماتوجرافيا المتقاربة للبوليميكسين B والتي يمكن فيها امتصاص الذيفان الداخلي بشكل فعال بعد تفكك السموم الداخلية من البروتينات بواسطة منظف غير أيوني ، أوكتيل وبيتا د-جلوكوبيرانوسيد.

الطرق المذكورة أعلاه فعالة بشكل معقول لإزالة السموم الداخلية من محاليل البروتين مع استرداد البروتين المرتفع نسبيًا. ومع ذلك ، لا يمكن تنظيف مراحل التقارب هذه بظروف إزالة الهيدروجين القياسية لهيدروكسيد الصوديوم القوي في الإيثانول (75). كشف Anspach and Hillbeck (1995) (57) أن هذه الدعامات تعاني من انخفاض كبير في الكفاءة في وجود البروتينات. وبالتالي ، فهي لا تنطبق بشكل عام على المشكلة المذكورة أعلاه (57).

تم استخدام الكروماتوغرافيا الغشائية بنجاح لعمليات الفصل التحضيرية في الغالب لفصل البروتين (76-83). ومع ذلك ، لم يتم اعتماد هذه التقنية عالميًا لأن كروماتوغرافيا الغشاء محدودة بقدرة الربط ، والتي تكون صغيرة عند مقارنتها بقدرة الأعمدة القائمة على الخرز ، على الرغم من أن مزايا التدفق العالي التي توفرها الممتزات الغشائية ستؤدي إلى إنتاجية أعلى ( 78). على الرغم من أن الكروماتوغرافيا القائمة على حبة لا تزال سائدة وفعالة لعمليات شطف المنتج ، إلا أن لها العديد من العيوب المتأصلة في تطبيقات إزالة الشوائب أو التلميع. علاوة على ذلك ، فإن سعة الربط الممتصة للأعمدة المستندة إلى حبة المستخدمة في هذا التطبيق عادة ما تكون 3-4 أوامر من حيث الحجم أكبر من المطلوب لأن الأعمدة عادة ما تكون بحجم لتحقيق معدل التدفق المطلوب بدلاً من السعة. نظرًا لأن الأنظمة القائمة على الغشاء تتمتع بميزة معدل تدفق مميزة وقدرة كافية لربط مستويات التتبع من الشوائب والملوثات ، فإن الممتزات الغشائية مناسبة بشكل مثالي لهذا التطبيق.تم العمل مؤخرًا باستخدام كروماتوجرافيا الغشاء لإزالة الحمض النووي وبروتين الخلية المضيفة (HCP) والذيفان الداخلي بنجاح معقول (8 ، 84-86).

أفاد Jann et al. ، (1975) (87) أنه يمكن استخدام الرحلان الكهربائي للهلام بلاطة بولي أكريلاميد في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE) لفصل LPS البكتيرية. أظهر المؤلفون أنه يمكن تخصيص الهياكل الجزيئية LPS لنطاقات LPS المنفصلة عن طريق ربط نمط النطاقات الكهربية ، كما تم اكتشافه مع صبغة حمض شيف الدورية ، مع الملف اللوني الناتج عن تغلغل الهلام في شقوق الكربوهيدرات المميزة كيميائيًا المنبعثة من LPS. في حين أن LPS الذي تم الحصول عليه من بكتيريا متحولة خشنة (R) ، والتي تحتوي على سلسلة قصيرة قليلة السكريات ، أظهر فقط نطاقًا سريع الحركة ، فإن LPS من سلالات ملساء من النوع البري (S) ، والتي كان لها نواة قليلة السكاريد تم استبدالها بأحجام مختلفة من ا-سلسلة عديد السكاريد محددة ، أظهرت نطاقات مهاجرة سريعة وبطيئة. من ناحية أخرى ، فإن LPS من بكتيريا من نوع semirough (SR) تحتوي على قليل السكاريد الأساسي ويتم اقتطاعها اتم اكتشاف -chain كنطاق سريع الحركة يهاجر أبطأ إلى حد ما من نطاقات LPS من النوع R. على الرغم من هذا التقدم الكبير في فصل وتحليل LPS السليم ، فإن الحساسية المحدودة للكشف التي أدت إلى تصور عدد قليل من نطاقات LPS الواسعة والمنتشرة أعاقت الكشف عن مزيد من التعقيدات الجزيئية لـ LPS (88). يمكن تشتيت LPS من السلالات الملساء والخشنة بواسطة المواد الخافضة للتوتر السطحي مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (89 ، 90) ، تريتون X-100 (91) ، وديوكسيكولات الصوديوم (92-94). عند إزالة الفاعل بالسطح الزائد عن طريق غسيل الكلى ، يتم تكوين مجموعة متجانسة أكثر من الجسيمات بمتوسط ​​وزن جزيئي يتراوح من حوالي 5x105 إلى 1x106 Da. تشير مثل هذه الملاحظات إلى أن التفاعلات الكارهة للماء بين الوحدات الفرعية لـ LPS هي محددات مهمة لحجم الجسيمات (92).

تم استخدام العديد من الطرق لفصل الفئات الفرعية المختلفة من LPS عن السلالات الفردية ، مع احتمال أن يكون الأكثر نجاحًا هو ترشيح جل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) (87-95) وترشيح الهلام (96). ومع ذلك ، يتم إعاقة هذه الأساليب بسبب ميل LPS للتجميع وبسبب صعوبة اكتشاف وتحديد كل فئة فرعية مميزة (97). تم استخدام Agarose-gel الكهربائي لأغراض مختلفة ، مثل فصل السكريات المستخرجة من الأنسجة والأعضاء والسوائل البيولوجية من اللافقاريات والفقاريات (97-100). علاوة على ذلك ، يتيح تحليل نطاق قياس الكثافة للمرء الحصول على تقييم كمي لأنواع عديد السكاريد المفردة في الخلائط (97).

على الرغم من أن بروتوكولات التنقية الشائعة قد تقلل محتوى الذيفان الداخلي إلى ما دون مستوى العتبة ، لا يمكن إعطاء ضمان مطلق. قد يحدث تلوث عرضي لمجموعة من المنتجات النهائية وفشل في مراقبة الجودة. يجب التخلص من هذا المنتج ، ولا يتم استبعاد إعادة المعالجة على وجه التحديد ولكنه بديل مكلف.

نظام ميسيلار ثنائي الطور

في السنوات الأخيرة ، تزايد الاهتمام باستخدام أنظمة micellar المائية ثنائية الطور لتنقية أو تركيز الجزيئات البيولوجية ، مثل البروتينات والفيروسات (101-103). في هذه الأنظمة ، ينفصل محلول الفاعل بالسطح المائي ، في ظل ظروف المحلول المناسبة ، تلقائيًا إلى مرحلتين سائلتين سائلتين مائيتين في الغالب ، ولكنهما غير قابلين للامتزاج ، تحتوي إحداهما على تركيز أكبر من المذيلات عن الأخرى (101). يشكل الاختلاف بين البيئات الفيزيائية والكيميائية في الطور الغني بالميلي والطور الفقير أساسًا للفصل الفعال ويجعل أنظمة الميسيلار المائية ذات المرحلتين طريقة مناسبة ومفيدة لفصل وتنقية وتركيز المواد الحيوية (101).

في أبسط إدراك لها ، تستغل هذه الأنظمة تفاعلات الحجم المستبعدة بين مذيلات الفاعل بالسطح غير الأيونية والجزيئات الحيوية. على وجه التحديد ، في نظام فصل الطور ، تكون إحدى مراحل التعايش غنية بالمذيلات بينما يكون الترتيب ضعيفًا في المذيلات (الشكل 3) (104 ، 105). ونتيجة لذلك ، فإن التفاعلات الأقوى ذات الحجم المستبعد بين مذيلات الفاعل بالسطح غير الأيونية والجزيئات الحيوية في المرحلة الغنية بالميليز تدفع الجزيئات الحيوية بشكل تفضيلي إلى مرحلة فقيرة الميلي بناءً على أحجامها (106).

على وجه الخصوص لإزالة السموم الداخلية ، فوق التركيز الحرج للمذيلة (CMC) للمواد الخافضة للتوتر السطحي ، يتم استيعاب الذيفانات الداخلية في بنية micellar من خلال التفاعلات غير القطبية لسلاسل ألكيل للدهون A ومجموعات ذيل الفاعل بالسطح وبالتالي يتم فصلها عن طور الماء (micelle- مرحلة فقيرة). تُظهر المواد الخافضة للتوتر السطحي من سلسلة Triton فجوة اختلاط في المحاليل المائية. فوق درجة الحرارة الحرجة ، ما يسمى بنقطة السحابة ، تتجمع الميسيلات في قطيرات ذات محتوى مائي منخفض للغاية ، وبذلك تشكل مرحلة جديدة. تظل السموم الداخلية في الطور الغني بالمادة الخافضة للتوتر السطحي. من خلال الطرد المركزي أو زيادة درجة الحرارة ، يتم فصل المرحلتين مع كون المرحلة الغنية بالفاعل السطحي هي المرحلة السفلية (66 ، 105 ، 107). إذا لزم الأمر ، تتكرر هذه العملية حتى يصبح تركيز الذيفان الداخلي المتبقي أقل من الحد الأدنى. النقطة السحابية لـ Triton X-114 هي 22 درجة مئوية ، وهو أمر مفيد عند تنقية البروتينات.

الشكل 3: رسم توضيحي تخطيطي لفصل طور محلول ميسيلار Triton X-114 ، عند زيادة درجة الحرارة. تحتوي كل مرحلة من مراحل التعايش الناتجة على مذيلات أسطوانية ولكن بتركيزات مختلفة من micellar. لاحظ أيضًا أنه ، في المتوسط ​​، تكون المذيلات الأسطوانية في الطور الغني بالميلي (القاع) أكبر من تلك الموجودة في الطور الفقير (العلوي).

باستخدام Triton X-114 ، Adam et al. أظهر (1995) (108) انخفاضًا في الذيفان الداخلي بمقدار 100 ضعف في خطوتين مع محتوى نهائي للذيفان الداخلي قدره 30 EU mg-1 وخسارة بنسبة 50٪ في النشاط الحيوي لعديد السكاريد الخارجي. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Cotten et al تقليل حوالي 100 ضعف من الذيفان الداخلي. (1994) (109) ، من تحضير DNA البلازميد بمحتوى نهائي للذيفان الداخلي يبلغ 0.1 EU في 6 & mug DNA.

تم وصف مقارنة بين امتزاز التقارب واستخراج Triton X-114 على مرحلتين لإزالة التلوث من البروتينات المؤتلفة التروبونين القلبي الأول والميوغلوبين والكرياتين كيناز الإنزيمات التي وصفها Liu et al. (1997) (67). وخلصوا إلى أن فصل الطور كان الطريقة الأكثر فعالية ، حيث قلل محتوى الذيفان الداخلي بنسبة 98-99٪ مع الكميات المتبقية من 2.5-25 EU mg-1 ، اعتمادًا على البروتين. ومع ذلك ، كوتون وآخرون. (1994) (109) لوحظ كفاءة إزالة أفضل قليلاً باستخدام مادة ماصة بوليميكسين ب.

أبلغت Aida and Pabst (1990) (66) عن طريقة لتقليل الذيفان الداخلي في محاليل البروتين باستخدام Triton X-114 ، حيث يساعد الفاعل بالسطح في تفكيك السموم الداخلية من البروتين ، مع توفير إمكانية فصل المرحلة الملائمة لإزالة الذيفان الداخلي المنفصل . وفقًا لهؤلاء المؤلفين أنفسهم ، كان فصل الطور باستخدام Triton X-114 فعالًا في تقليل الذيفان الداخلي من محاليل ثلاثة بروتينات مختلفة (السيتوكروم جوالألبومين والكتلاز). أدت الدورة الأولى لفصل الطور إلى تقليل التلوث بالسموم الداخلية بمقدار 1000 ضعف. أدت الدورات الإضافية لفصل الطور إلى الإزالة الكاملة للسموم الداخلية. تم العثور على الذيفان الداخلي في مرحلة المنظف ، واحتوت المرحلة المائية العلوية على الجزيء الحيوي المطلوب. بالإضافة إلى تطهير الذيفان الداخلي من تحضير البروتين مثل المنتجات المؤتلفة أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، يجب أن يكون الفصل المرحلي باستخدام Triton X-114 مفيدًا لإزالة الدهون من الألبومين أو البروتينات الدهنية. بالنظر إلى أن كمية معينة من الفاعل بالسطح تبقى دائمًا في محلول البروتين ، والذي يجب إزالته عن طريق عمليات الامتزاز الإضافية أو عمليات الترشيح الهلامية ، تؤدي هذه العملية إلى فقد المنتج بنسبة 10-20٪ (66). تم اقتراح أن المنظف يفصل جزيء الذيفان الداخلي عن البروتين ويفصل الجزيء المنفصل عن طريق فصل الطور باستخدام الخصائص الفيزيائية لـ Triton X-114 (66). ليو وآخرون. (1997) (67) أوضح أن فصل الطور Triton X-114 تم تطبيقه بعد ذلك على مستحضرات البروتين المؤتلف الأخرى. من خلال إجراء ثلاث دورات من فصل الطور Triton X-114 ، فإن مستويات الذيفان الداخلي في جميع البروتينات المؤتلفة المشتقة من بكتريا قولونية بنسبة تصل إلى 99٪ من المبلغ الأصلي. علاوة على ذلك ، ظل النشاط المناعي والسلامة البدنية والنشاط البيولوجي للبروتين دون تغيير بعد عملية فصل الطور. يمكن تكرار فصل الطور عدة مرات حتى يصل الذيفان الداخلي في المرحلة المائية إلى مستوى مرضٍ. بالإضافة إلى بساطته ، فإن هذا الإجراء فعال من حيث التكلفة ، خاصة على نطاق واسع.

فيسك وآخرون. (2001) (4) فحص عددًا من الأساليب لتقليل مستوى الذيفان الداخلي ، مثل استخدام المواد الخافضة للتوتر السطحي zwitterionic Zwittergent 3-12 (Z3-12) و Zwittergent 3-14 (Z3 & # 820914) لتفكك الذيفان الداخلي من بروتين UspA2 المنقى والفصل اللاحق للذيفان الداخلي عن UspA2 باستخدام التبادل الأيوني أو اللوني بالترشيح الهلامي. بروتين UspA2 هو لقاح مرشح محتمل للوقاية من التهاب الأذن الوسطى والأمراض الأخرى التي يسببها الموراكسيلا النزلية (110). كانت الطريقة التي أثبتت نجاحها في تفكك السموم الداخلية من UspA2 هي استبدال Triton X-100 بخافض للتوتر السطحي zwitterionic. عدم قدرة Triton X-100 على فصل مركب الذيفان الداخلي-UspA2 ، على الرغم من نجاح كل من Z3-12 و Z3-14 قد يكمن في خصائص شحن المواد الخافضة للتوتر السطحي. Triton X-100 عبارة عن مادة خافضة للتوتر السطحي غير أيونية لا تحتوي على شقوق مشحونة بينما تحتوي Zwittergents على مجموعات رأس zwitterionic مع شقوق سالبة وإيجابية. معظم المواد الخافضة للتوتر السطحي zwitterionic محايدة بشكل فعال ، ومع ذلك ، في بعض الحالات يوجد استقطاب قوي (111). قد تساعد خصائص الشحن لـ Z3 & # 820912 و Z3-14 وتفاعل الفاعل بالسطح مع إما الذيفان الداخلي و / أو البروتين في تفكك الذيفان الداخلي عن البروتين (في هذه الحالة UspA2). قد تلعب الاختلافات الهيكلية بين المواد الخافضة للتوتر السطحي أيضًا دورًا في التفكك الفعال للذيفان الداخلي والبروتين. مهما كانت الآلية ، فقد ثبت أن استخدام خافض التوتر السطحي Zwittergent مناسب تمامًا لإزالة LPS من UspA2 دون الإخلال بالخصائص المناعية للبروتين. قبل تقليل السموم الداخلية ، احتوت مستحضرات UspA2 على ما يصل إلى 158 EU / Kg. ومع ذلك ، بعد اللوني في وجود Z3-12 Fiske وآخرون. (2001) (4) حقق مستويات تقارب 0.0072 EU / Kg. تم تنفيذ عملية إزالة الذيفان الداخلي بنجاح بعد GMP ، لإنتاج لقاح الوحدة الفرعية UspA2 للتجارب السريرية.

يبدو أن مستويات الذيفان الداخلي أعلى بكثير في البروتينات المؤتلفة المشتقة من الأجزاء القابلة للذوبان أو السيتوبلازمية مقارنة بالبروتينات المشتقة من الأجسام غير القابلة للذوبان أو المتضمنة. هذا يتوافق مع الاعتقاد بأن عديدات السكاريد الدهنية الموجودة في جدار الخلية يتم إذابتها أثناء إجراء تحلل الخلية. أظهر Schnaitman (112) أن علاج بكتريا قولونية مع مزيج من Triton X-114 ، EDTA ، والليزوزيم أدى إلى إذابة جميع عديدات السكاريد الدهنية من جدار الخلية.

Reichelt et al. قام (2006) (59) باختبار ما إذا كان يمكن تحقيق إزالة السموم الداخلية أثناء تنقية الكروماتوغرافيا باستخدام Triton X-114 في خطوات الغسيل. نجح تطبيق 0.1٪ Triton X-114 في خطوات الغسيل في تقليل السموم الداخلية أثناء تنقية بروتين الانصهار الهيستيدين و GST (الراتنج GST sepharose) ، في حين أن خطوات الغسيل التي تفتقر إلى الفاعل بالسطح كانت غير فعالة في القضاء على السموم الداخلية. على عكس المواد المنقاة التي تستخدم البروتوكول القياسي الذي يحتوي على 2500 إلى 34000 ملغم -1 من الاتحاد الأوروبي ، احتوت البروتينات المؤتلفة المنقى والمعالجة بـ Triton X-114 على تركيزات منخفضة تصل إلى 0.2 إلى 4 EU mg-1 (أقل من 1٪ من محتوى السموم الداخلي الأولي ). يمكن أن تصل السموم الداخلية المتبقية في أجسام الشمول المذابة إلى مستويات 8 × 106 EU mL-1 على الرغم من حقيقة أن مستويات الذيفان الداخلي أعلى في البروتينات المؤتلفة المعزولة من الكسور القابلة للذوبان (113).

لقد ثبت أن السموم الداخلية تشكل معقدات تحتوي على بروتينات ذات نقاط متساوية كهربائية مختلفة (8) حيث يُعتقد أن التفاعلات الكهروستاتيكية هي القوى الدافعة الرئيسية. نتيجة لذلك ، يجب أن تكون إزالة السموم الداخلية من البروتينات الأساسية أكثر صعوبة من إزالة البروتينات الحمضية (114). Reichelt et al. (2006) درس (59) ما إذا كان استخدام Triton X-114 في خطوات الغسيل يمكن أن يقضي على السموم الداخلية من البروتينات التي تحتوي على pأنا أعلى من 8.5. ووجدوا أن الغسل باستخدام Triton X-114 إلى جانب كروماتوجرافيا التقارب يزيل بشكل فعال السموم الداخلية من البروتينات سالبة الشحنة (SyCRP و NdhR). كان الحد الأدنى من تركيز الذيفان الداخلي المحقق أقل من 0.2 EU mg-1 استعادة البروتين وكان المحصول قريبًا من 100 ٪ (59).

فصل الطور الناتج عن درجة الحرارة باستخدام Triton X-114 هو تقنية حديثة وقوية تفصل بكفاءة بروتينات الغشاء الكارهة للماء والماء في درجة حرارة الغرفة ، دون تمسخ (107 ، 115). تم تطبيق هذه الطريقة أيضًا بنجاح لإزالة السموم الداخلية من البروتينات والإنزيمات ، مع الاحتفاظ بوظائفها الطبيعية (66). بسبب الطابع البرمائي ، تمت إزالة LPS أيضًا بشكل كبير من كليبسيلا sp I-714 EPS (عديد السكاريد خارج الخلية يُطلق عليه عديدات السكاريد الخارجية) بعد خطوتين استخلاص في 2 ٪ Triton X-114 ، مع انخفاض مزدوج فقط في النشاط الحيوي (108). وفقًا لنفس المؤلفين ، فإن تقنية التقسيم Triton X-114 سريعة وفعالة وغير قابلة للتحلل وتسمح بمستوى عالٍ من إزالة السموم من كليبسيلا ص. I-714 EPS. فصل الذيفان الداخلي والسكريات الخارجية من كليبسيلا ص. يصعب تحقيق I-714 بتقنيات أخرى غير الاستخراج على مرحلتين. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضًا استخدام هذه الطريقة بنجاح لتنقية مادة EPS ملوثة بالسموم الداخلية سالبة الشحنة من الزائفة الباذنجانية (108).

المنظفات ، على الرغم من أنها كانت فعالة جدًا أيضًا في تقليل مستويات LPS ، فهي باهظة الثمن نسبيًا ، وتضيف تكلفة كبيرة لعملية التصنيع ، وقد تؤثر على النشاط الحيوي للبروتين محل الاهتمام. المواد الكيميائية البديلة مرغوبة والتي يمكن استخدامها بأمان وفعالية من حيث التكلفة بدلاً من الكحول أو المنظفات كعوامل غسيل لفصل LPS عن البروتينات أثناء عمليات وحدة الكروماتوغرافيا. من الناحية المثالية ، ستكون هذه المواد الكيميائية غير مكلفة نسبيًا ، ومحددة جيدًا كيميائيًا ، وتمثل الحد الأدنى من مشكلات السلامة ، ولها تأثير ضئيل على النشاط الحيوي للبروتين المعني عند تنفيذها في عملية (9).

توقعات - وجهات نظر

مع الأخذ في الاعتبار خصائص أنظمة micellar المائية ثنائية الطور لإزالة الجزيئات الحيوية ، حققت هذه المجموعة البحثية بعض النتائج الواعدة ، باستخدام Triton X-114 لإزالة السموم الداخلية الموجودة في المزرعة المخمرة لـ بكتريا قولونية الخلايا أثناء إنتاج البروتين. وفقًا للأدبيات ([7] ، [58] ، [65] ، [107]) ، كان فصل الطور باستخدام Triton X-114 فعالًا في تقليل السموم الداخلية من المحاليل التي تحتوي على جزيئات حيوية ، ومع ذلك فإن الظروف المثلى لا تزال غير مؤكدة وتتطلب مزيدًا من البحث .

إعتراف

المؤلفون ممتنون للدعم المالي من CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient & iacutefico e Tecnol & oacutegico و FAPESP & ndash Funda & ccedil & atildeo de Apoio a Pesquisa do Estado de S & atildeo Paulo.


Andrizhiyevskaya E ، Chojnicka A ، Bautista J ، Diner B ، van Grondelle R ، Dekker J (2005) أصل الفلورة F685 و F695 في نظام الصور الثاني. دقة التمثيل الضوئي 84 (1-3): 173-180. دوى: http://dx.doi.org/10.1007/s11120-005-0478-7

Arnon DI (1949) إنزيمات النحاس في البلاستيدات الخضراء المعزولة. بوليفينولوكسيداز في بيتا فولغاريس. النبات Physiol 24 (1): 1-15. دوى: http://dx.doi.org/10.1104/pp.24.1.1

Burke JJ ، Ditto CL ، Arntzen CJ (1978) مشاركة مجمع حصاد الضوء في تنظيم الكاتيون لتوزيع طاقة الإثارة في البلاستيدات الخضراء. محفوظات الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية 187 (1): 252-263. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/0003-9861 (78) 90031-0

Chitnis VP، Chitnis PR (1993) الوحدة الفرعية PsaL مطلوبة لتشكيل أدوات تقليم النظام الضوئي الأول في البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC 6803. رسائل FEBS 336 (2): 330-334. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/0014-5793 (93) 80831-E

Collini E ، Wong CY ، Wilk KE ، Curmi PMG ، Brumer P ، Scholes GD (2010) تم ربط حصاد الضوء السلكي بشكل متماسك في الطحالب البحرية الضوئية في درجة الحرارة المحيطة. طبيعة 463 (7281): 644-647. دوى: http: //dx.doi.org/10.1038/nature08811

Fromme P، Witt HT (1998) عزل وتبلور محسّن للنظام الضوئي الأول للتحليل الهيكلي. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - الطاقة الحيوية 1365 (1-2): 175-184. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/S0005-2728 (98) 00059-0

Giardi MT ، Pace E (2005) بروتينات التمثيل الضوئي للتطبيقات التكنولوجية. الاتجاهات في التكنولوجيا الحيوية 23 (5): 257-263. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2005.03.003

Grätzel M (2001) الخلايا الكهروضوئية. طبيعة 414 (6861): 338-344. دوى: http://dx.doi.org/10.1038/35104607

Gunther D ، LeBlanc G ، Prasai D ، Zhang JR ، Cliffel DE ، Bolotin KI ، Jennings GK (2013) نظام الصور الأول على الجرافين باعتباره قطبًا كهربائيًا عالي الشفافية وفعالًا للصور. لانجموير 29 (13): 4177-4180. دوى: http://dx.doi.org/10.1021/la305020c

Hui Y ، Jie W ، Carpentier R (2000) تدهور نظام الصور الأول المركب أثناء التثبيط الضوئي. الكيمياء الضوئية والبيولوجيا الضوئية 72 (4): 508-512. دوى: http://dx.doi.org/10.1562/0031-8655 (2000) 0720508DOTPIC2.0.CO2

Jordan P، Fromme P، Witt HT، Klukas O، Saenger W، Krauß N (2001) هيكل ثلاثي الأبعاد لنظام ضوئي بكتيري أزرق بدقة 2.5. طبيعة 411 (6840): 909-917. دوى: http: //dx.doi.org/doi: 10.1038 / 35082000

Karapetyan NV، Dorra D، Schweitzer G، Bezsmertnaya IN، Holzwarth AR (1997) Spectroscopy of the Longwave Chlorophylls in Trimeric and Monomeric Photos System I Core Complex from Cyanobacterium Spirulina platensis. الكيمياء الحيوية 36 (45): 13830-13837. دوى: http://dx.doi.org/10.1021/bi970386z

Kargul J ، Janna Olmos JD ، Krupnik T (2012) هيكل ووظيفة النظام الضوئي الأول وتطبيقاته في أنظمة المحاكاة الحيوية من الطاقة الشمسية إلى الوقود. مجلة فسيولوجيا النبات 169 (16): 1639-1653. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/j.jplph.2012.05.018

Krassen H، Schwarze A، Friedrich Br، Ataka K، Lenz O، Heberle J (2009) إنتاج الهيدروجين الضوئي بواسطة مركب هجين من نظام التصوير الأول و [NiFe] -هيدروجينيز. ACS نانو 3 (12): 4055-4061. دوى: http://dx.doi.org/10.1021/nn900748j

Kruip J، Karapetyan NV، Terekhova IV، Rögner M (1999) In Vitro Oligomerization of a Membrane Protein Complex: إعادة تشكيل قائم على الليبوزوم لنظام ضوئي ثلاثي من مونومرات معزولة. مجلة الكيمياء البيولوجية 274 (26): 18181-18188. دوى: http://dx.doi.org/10.1074/jbc.274.26.18181

Kühlbrandt W ، Thaler T ، Wehrli E (1983) هيكل بلورات الغشاء لمركب بروتين الكلوروفيل أ / ب الحاصد للضوء. مجلة بيولوجيا الخلية 96 (5): 1414-1424. دوى: http://jcb.rupress.org/content/96/5/1414.full.pdf

Lichtenthaler HK، Buschmann C (2001) الكلوروفيل والكاروتينات: القياس والتوصيف بواسطة التحليل الطيفي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية. في: البروتوكولات الحالية في الكيمياء التحليلية للأغذية. John Wiley & amp Sons، Inc. دوى: http://dx.doi.org/10.1002/0471142913.faf0403s01

Liu Z، Yan H، Wang K، Kuang T، Zhang J، Gui L، An X، Chang W (2004) هيكل بلوري لمجمع السبانخ الرئيسي لحصاد الضوء بدقة 2.72. طبيعة 428 (6980): 287-292. دوى: http: //dx.doi.org/10.1038/nature02373

Liu S ، Qiu Y ، Yu D (2010) تأثير المواد الخافضة للتوتر السطحي الببتيد البرمائي على مجمع حصاد الضوء II. فوتوسينثيتيكا 48 (4): 610-616. دوى: http://dx.doi.org/10.1007/s11099-010-0078-4

ماتسوموتو ك ، فون إم ، بروس بي دي ، كوتسوبولوس إس ، زانغ إس (2009) المصمم الببتيد الخافض للتوتر السطحي يعمل على تثبيت نظام التمثيل الضوئي الوظيفي- I مجمع الغشاء في محلول مائي لوقت طويل. مجلة الكيمياء الفيزيائية ب 113 (1): 75-83. دوى: http://dx.doi.org/10.1021/jp8021425

Matsumoto K، Zhang S، Koutsopoulos S (2010) نشاط نقل الإلكترون المحسن لنظام الصور الأول بواسطة Polycations في محلول مائي. الجزيئات الحيوية 11 (11): 3152-3157. دوى: http://dx.doi.org/10.1021/bm100950g

Mershin A، Matsumoto K، Kaiser L، Yu D، Vaughn M، Nazeeruddin MK، Bruce BD، Graetzel M، Zhang S (2012) نظام ضوئي مُجمَّع ذاتيًا- I biophotovoltaics على TiO ذات البنية النانوية2 و ZnO. ممثل العلوم 2. دوى: http: //dx.doi.org/10.1038/srep00234

ناكامورا أ ، أكاي إم ، يوشيدا إي ، تاكي تي ، واتانابي تي (2003) تحديد HPLC للطور المعكوس لكلوروفيل أ و فيلوكينون في النظام الضوئي الأول لكائنات التمثيل الضوئي الأكسجين. المجلة الأوروبية للكيمياء الحيوية 270 (11): 2446-2458. دوى: http://dx.doi.org/10.1046/j.1432-1033.2003.03616.x

Nelson N، Ben-Shem A (2004) الهندسة المعمارية المعقدة لعملية التمثيل الضوئي للأكسجين. نات ريف مول سيل بيول 5 (12): 971-982. دوى: http: //dx.doi.org/doi: 10.1038 / nrm1525

Privé GG (2007) منظفات لتثبيت وتبلور بروتينات الغشاء. الطرق 41 (4): 388-397. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2007.01.007

Reithmeier RAF (2007) البيولوجيا الهيكلية لبروتينات الغشاء. الطرق 41 (4): 353-354. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2007.02.016

Schlodder E و Çetin M و Byrdin M و Terekhova IV و Karapetyan NV (2005) P700 + - و 3 إخماد مستحث بواسطة P700 للفلورة عند 760 نانومتر في مجمعات نظام ضوئي ثلاثي الأبعاد من البكتيريا الزرقاء Arthrospira platensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - الطاقة الحيوية 1706 (1-2): 53-67. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbabio.2004.08.009

Shubin VV، Bezsmertnaya IN، Karapetyan NV (1992) العزلة من أغشية سبيرولينا لمجمعين من النوع الأول لنظام ضوئي ، أحدهما يحتوي على الكلوروفيل المسؤول عن نطاق مضان 77 K عند 760 نانومتر. رسائل FEBS 309 (3): 340-342. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/0014-5793 (92) 80803-O

Shubin VV ، Tsuprun VL ، Bezsmertnaya IN ، Karapetyan NV (1993) توجد الأشكال الثلاثية لمركب مركز تفاعل النظام الضوئي الأول مسبقًا في أغشية البكتيريا الزرقاء سبيرولينا بلاتنسيس. رسائل FEBS 334 (1): 79-82. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/0014-5793 (93) 81685-S

Standfuss J ، Terwisscha van Scheltinga AC ، Lamborghini M ، Kühlbrandt W (2005) آليات الحماية من الضوء والتبريد غير الضوئي الكيميائي في مجمع حصاد ضوء البازلاء بدقة 2.5. EMBO J 24 (5): 919-928. دوى: http://dx.doi.org/10.1038/sj.emboj.7600585

Terasaki N، Yamamoto N، Hattori M، Tanigaki N، Hiraga T، Ito K، Konno M، Iwai M، Inoue Y، Uno S، Nakazato K (2009) مستشعر ضوئي قائم على FET باستخدام مكون حيوي من نظام الصور الأول للاستخدام في التصوير الأجهزة. لانجموير 25 (19): 11969-11974. دوى: http://dx.doi.org/10.1021/la901091e

Yang Z ، Su X ، Wu F ، Gong Y ، Kuang T (2005) تأثير phosphatidylglycerol على التنظيم الجزيئي للنظام الضوئي I. الكيمياء الحيوية الفيزيائية 115 (1): 19-27. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/j.bpc.2005.01.004

Yu D ، Huang F ، Xu H (2012) تحديد التركيزات الحرجة بواسطة مطياف التألق المتزامن. الطرق التحليلية 4 (1): 47-49. دوى: http://dx.doi.org/10.1039/C1AY05495C

Yu D ، Zhu G ، Liu S ، Ge B ، Huang F (2013) نشاط التيار الضوئي لمركب حصاد الضوء II المعزول من السبانخ وأصباغه في TiO الحساسة للصبغ2 الخلايا الشمسية. المجلة الدولية لطاقة الهيدروجين 38 (36): 16740-16748. دوى: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijhydene.2013.02.114


هل يمكن جعل عينة البروتين خالية من 2٪ Triton X-100؟ - مادة الاحياء

مراجعة مقايسات كمية البروتين ومسح حول فحوصات البروتين بناءً على المنشورات الرسمية.

يعد القياس الدقيق للبروتين أمرًا ضروريًا لدراسات البروتين في العديد من موضوعات البحث. تم تطوير مجموعة واسعة من الطرق المختلفة لتقدير كل من الخلائط المعقدة من البروتينات وكذلك نوع واحد من البروتين. تشتمل طرق تقدير كمية البروتين الكلي على الطرق التقليدية مثل قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر ، وحمض بيسينشونينيك (BCA) ومقايسات برادفورد ، بالإضافة إلى طرق بديلة مثل فحوصات Lowry أو الاختبارات الجديدة التي طورها الموردون التجاريون ، والتي غالبًا ما توفر تصميمًا جيدًا ، طقم مناسب لكل نوع من الفحص. تشمل طرق تقدير كمية البروتين الفردية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وتحليل اللطخة الغربية ، ومؤخراً ، قياس الطيف الكتلي ، من بين أمور أخرى. يعد القياس الدقيق للبروتين أمرًا ضروريًا لجميع التجارب المتعلقة بدراسات البروتينات في العديد من موضوعات البحث. مختلفة تم تطوير مجموعة واسعة من الطرق المختلفة لتقدير كل من خليط البروتينات المعقدة في اختبار معين لمحتوى البروتين الكلي وكذلك لنوع واحد من البروتين. تشتمل طرق تقدير كمية البروتين الكلي على الطرق التقليدية مثل قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر ، وحمض بيسينشونينيك (BCA) ومقايسات برادفورد ، بالإضافة إلى طرق بديلة مثل Lowry أو المقايسات الجديدة التي طورها الموردون التجاريون. عادة الموردين التجاريين الذين يقدمون في كثير من الأحيان مجموعة ملائمة جيدة التصميم لكل نوع من أنواع المقايسات. تشمل طرق تقدير كمية البروتين الفردية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وتحليل اللطخة الغربية ، ومؤخراً ، قياس الطيف الكتلي ، من بين أمور أخرى. في بعض الحالات ، قد تتطلب لوائح أو قوانين المجموعة التجارية طرقًا محددة لتقدير كمية البروتين. على سبيل المثال ، توصي الرابطة الدولية لصناعة المصل (www.serumindustry.org) ، وهي مجموعة تجارية لموفري المصل ، بطريقة Biuret لتحديد محتويات البروتين في منتجات المصل.

نناقش هنا بعض الطرق الشائعة المستخدمة لتحديد تركيز البروتين في المحلول ، مع إبراز المرافق والقيود. من المهم أن نلاحظ أن أيا من فحوصات البروتين هذه لا تكون خاصة بالبروتينات ، مما يعني أن المكونات غير البروتينية قد تتداخل ، أو دقيقة بشكل موحد ومتوافقة مع جميع البروتينات. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتداخل تعديلات البروتين مع تقدير تركيز البروتين لبعض المقايسات عند مقارنتها بالبروتين غير المعدل [3 ، 4]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض المقايسات ، على سبيل المثال مقايسة 3- (4-carboxybenzoyl) quinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) تكون فعالة أيضًا عند استخدامها لقياس الببتيدات أو البروتينات المثبتة على السطح أو المغلفة [5].

يلخص الجدول 1 المقايسات الكمية الكلية للبروتين المشترك. الأقل شيوعًا ، مثل Pierce 660 من Thermo (كتالوج رقم 22660) [6] ، وكمية بروتين NanoOrange [7] ، ومقياس التألق Qubit [8] ، ومجموعة اختبار تخليق البروتين المستندة إلى O-proparyl-Puromycin للبروتينات الناشئة [9] ، لا تناقش. من المهم تقييم توافق كل اختبار مع أنواع العينات ، ونطاق الفحص ، وحجم العينة ، وتوافر مقياس طيف ضوئي مناسب ، بالإضافة إلى الوقت والتكلفة.

فحص استيعاب آلية حد الكشف مزايا سلبيات
امتصاص الأشعة فوق البنفسجية280 نانومترامتصاص التيروزين والتربتوفان0.1-100 ميكروغرام / ملحجم عينة صغير وسريع ومنخفض التكلفةغير متوافق مع المنظفات وعوامل تغيير التشبع ، تقلبات عالية
حمض بيسينشونينيك562 نانومتراختزال النحاس (Cu 2+ إلى Cu 1+) ، تفاعل BCA مع Cu 1+ 20-2000 ميكروغرام / ملمتوافق مع المنظفات وعوامل التحريف ، تقلب منخفضتوافق منخفض أو معدوم مع عوامل الاختزال
برادفورد أو كوماسي أزرق لامع470 نانومترتشكيل معقد بين صبغة كوماسي الزرقاء الرائعة والبروتينات20-2000 ميكروغرام / ملمتوافق مع عوامل الاختزال ، وسريعغير متوافق مع المنظفات
لوري750 نانومتراختزال النحاس بالبروتينات ، تقليل Folin-Ciocalteu بواسطة مركب البروتين النحاسي10-1000 ميكروغرام / ملحساسية عالية ودقةغير متوافق مع المنظفات وعوامل الاختزال ، إجراء طويل

تعطي الأحماض الأمينية العطرية التيروزين والتريبتوفان البروتينات الخاصة بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV) عند 280 نانومتر ، والتي تستخدم بشكل روتيني لتقدير تركيز البروتين. تساهم روابط فينيل ألانين وثاني كبريتيد أيضًا في الامتصاص عند 280 نانومتر ، وإن كان ذلك بشكل طفيف. هذه الطريقة بسيطة ، ويمكن إجراؤها باستخدام حجم عينة صغير للغاية ، يصل إلى 0.5 ميكرولتر ، نظرًا لأن أجهزة قياس الطيف الضوئي الجديدة تستخدم نظامًا للاحتفاظ بالعينة أثناء القياس. ومع ذلك ، يجب ألا تحتوي عينة البروتين على أي مكونات غير بروتينية ذات امتصاص كبير عند 280 نانومتر ، مثل ملوثات الأحماض النووية [10]. بالنسبة لعينات البروتين النقي ، يجب معرفة تسلسل الحمض الأميني الدقيق للبروتين الذي تم تحليله ويجب حساب معامل الامتصاص الخاص بالبروتين المعين قبل تحديد تركيز المحلول [11 ، 12]. هذه الطريقة هي الأسرع ، ولكنها عرضة للخطأ ولا تتوافق مع مجموعة واسعة من طرق استخراج البروتين التي تستخدم في كثير من الأحيان المنظفات وعوامل تغيير الصفات.

تم اختراع مقايسة حمض البيسينشونينيك (BCA) في عام 1985 بواسطة Paul K. Smith في شركة Pierce Chemical Company ، الموزع الرئيسي لهذا الاختبار [13]. تعتمد كل من مقايسات BCA و Lowry على تحويل Cu 2+ إلى Cu 1+ تحت الظروف القلوية. هذا التحويل يسمى تفاعل بيوريت (الشكل 1) ويتأثر بالعديد من بقايا الأحماض الأمينية (السيستين ، السيستين ، التيروزين ، والتربتوفان) والعمود الفقري الببتيد.

BCA هو كاشف كروموجيني محدد لـ Cu 1+ وفي الخطوة الثانية من التفاعل يتفاعل جزيءان من BCA مع أيون Cu 1+ واحد. كمية Cu 2+ المخفضة هي دالة لتركيز البروتين التي يمكن تحديدها بطريقة طيفية عن طريق تغيير لون محلول العينة من اللون الأزرق إلى اللون الأرجواني ، والذي يمتص الضوء عند 562 نانومتر. الامتصاص يتناسب طرديًا مع كمية البروتين الموجودة في المحلول ويمكن تقديره من خلال المقارنة بمعيار بروتين معروف ، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) [10 ، 14 ، 15]. نظرًا لأن مساحة سطح الجسم والبروتين / الببتيد المقاس قد يكون لهما تطور مختلف في اللون ، يجب تعديل كمية البروتين / الببتيد. على سبيل المثال ، قام Nortley R وآخرون بمضاعفة التركيز المقاس لببتيدات أميلويد بيتا مع مجموعة اختبار بروتين بيرس BCA و BSA كمعيار بعامل 1.51 [16].

يعتبر اختبار BCA متسامحًا بشكل عام مع المنظفات الأيونية وغير الأيونية مثل NP-40 و Triton X-100 وعوامل تغيير التشبع مثل اليوريا وكلوريد الجوانيدينيوم التي تميل إلى التداخل مع فحوصات البروتين اللونية الأخرى مثل Lowry (الجدول 2) [15]. ومع ذلك ، فإن بعض الكواشف ، مثل حمض إيثيلين أمينيتراسيتيك (EDTA) [17] ، الذي يقلل من السكريات [18 ، 19] والدهون [20] ، يمكن أن يتداخل مع اختبار BCA. يمكن تخفيف آثار مثل هذه التداخلات من خلال استراتيجيات مثل تقليل المواد المتداخلة من خلال غسيل الكلى أو ترشيح الهلام أو إذا كان تركيز البروتين مرتفعًا بدرجة كافية ، عن طريق تخفيف العينة. اقترح Reichelt et al تعديلات بسيطة على الطريقة التي يمكن أن تؤدي إلى تحسينات واضحة في دقة القياس ، خاصة بالنسبة للبروتين غير المنقى في الحلول المعقدة مثل وسائط المزرعة [21]. يستخدمون عامل التصحيح المعطى عن طريق قياس ارتفاع بروتين BSA الداخلي المضاف إلى كل عينة. بناءً على دراساتهم ، يمكن تحسين دقة القياس الكمي لبروتين BCA خمسة أضعاف ، مما يجعل دقة القياس الكمي لـ BCA قابلة للمقارنة مع الأساليب الأكثر تكلفة [21].

هناك عامل آخر يتعارض مع دقة مقايسة BCA وهو وجود بقايا معدلة كيميائيًا في البروتين. قام كل من برادي وماكنوتان بتقييم تأثير ميثيل ليسيل على مقايسات برادفورد و BCA ووجدوا أنه بالنسبة لمقايسة BCA ، تم المبالغة في تقدير تركيزات البروتين في عينات البروتين الميثلي [4].

NP-40السكروز
امولجينجليكاين ، درجة الحموضة 2.8
حبيسالجلوكوز
DTTEDTA
تريتون اكس 100كلوريد الصوديوم
اليورياهيدروكسيد الصوديوم
غوانيدين حمض الهيدروكلوريككبريتات الامونيوم
أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 5.5SDS

تمتلك Thermo Fisher Pierce إصدارًا جديدًا من اختبار البروتين BCA ، يُدعى مجموعة فحص البروتين بيرس ™ BCA - متوافق مع عامل التخفيض ، والذي يتسامح مع ثنائي ثيوثريتول (DTT) و 2 مركابتوإيثانول (BME) و TCEP وعوامل اختزال ثاني كبريتيد أخرى [22].

يتميز اختبار BCA بالعديد من المزايا. مقارنة بالطرق الأخرى ، يعتبر اختبار BCA من أكثر الطرق حساسية (يمكنه اكتشاف البروتينات بتركيزات منخفضة تصل إلى 5 ميكروغرام / مل). لديها تقلبات أقل من غيرها (على سبيل المثال ، اختبار برادفورد) ، ويمكن استخدامها لقياس نطاق واسع من تركيز البروتين. علاوة على ذلك ، يمكن زيادة حساسيته عن طريق إجراء الفحص في وجود مستشعرات النانو البلازمية كما هو الحال في اختبار SPR-BCA (رنين Plasmon السطحي - BCA) الذي اقترحه Liu et al [23]. مع هذا الاختبار ، كان حد الكشف 3.4 نانوغرام / مل وكان نطاق العمل العام 0.5 إلى 1000 ميكروغرام / مل ، وبالتالي خفض تركيزات البروتين التي يمكن قياسها باستخدام اختبار BCA التقليدي.

يعتبر اختبار برادفورد ، الذي وصفه في الأصل الدكتور ماريون برادفورد في عام 1976 ، طريقة شائعة لتحديد تركيز البروتين. يعتمد على تكوين مركب بين صبغة كوماسي الزرقاء الرائعة G-250 والبروتينات في المحلول. توجد الصبغة الحرة في أربعة أشكال أيونية مختلفة. يرتبط الشكل الأزرق الأنيوني بالبروتينات وله امتصاص عند 595 نانومتر (الشكل 2). يتم تحديد تركيز البروتين بكمية الصبغة في الشكل الأيوني الأزرق المقاسة بامتصاص المحلول عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي [24]. ترتبط الصبغة في الغالب بمخلفات الأرجينين ، التربتوفان ، التيروزين ، الهيستيدين ، والفينيل ألانين [10].

يستخدم معظم الباحثين BSA كمعيار للبروتين لأنه غير مكلف ومتاح بسهولة ولكنه ليس مناسبًا دائمًا. في الواقع ، أحد عيوب استخدام مساحة سطح الجسم هو أنه يظهر استجابة صبغة قوية وقد يؤدي إلى التقليل من تقدير تركيزات البروتين في العينات. هذه ليست مشكلة إذا كانت هناك حاجة فقط لتركيزات نسبية من العينات. ومع ذلك ، إذا كان من الضروري إجراء قياس دقيق لتركيز البروتين ، فإن الغلوبولين المناعي G (IgG) ، أو الليزوزيم ، أو معايير البروتين الأخرى غالبًا ما تكون خيارات أفضل ، اعتمادًا على عينة البروتين [24].

من بين مزايا اختبار برادفورد التوافق مع عوامل الاختزال المستخدمة لتثبيت البروتينات في المحلول ، والتي لا تتوافق مع مقايسة Lowry وإلى حد ما غير متوافقة مع اختبار BCA. أيضًا ، نظرًا لأن الصبغة لا ترتبط بالببتيدات مع انخفاض ميغاواط ، يمكنك قياس تركيزات البروتينات عالية الوزن الجزيئي (MW) في وجود الببتيدات الملوثة [10 ، 24].

يتمثل القيد الرئيسي لمقايسة برادفورد في عدم توافقه مع معظم المنظفات ، والتي تُستخدم بشكل روتيني لإذابة بروتينات الغشاء. (من المثير للاهتمام ، مع ذلك ، أن المستويات المنخفضة جدًا من المنظفات غير الأيونية ، مثل Triton X-100 ، قد تحسن الحساسية والتنوع في اختبار برادفورد [25]). يمكن إزالة المنظفات عن طريق الترشيح الهلامي أو غسيل الكلى ، أو من خلال الترسيب بفوسفات الكالسيوم [24] أو الأسيتون. يمكن أن تؤدي هذه الطرق إلى تخفيف العينة أو فقد العينة ، مع استرداد 70٪ أو أقل من كمية البروتين الأولية. وصف Cheng et al ترسيب البروتين والطريقة القائمة على مقايسة برادفورد التي تسمح بتقدير كمية البروتين بسرعة ، حتى عندما يحتوي محلول البروتين على مواد متداخلة [26]. تحقق هذه الطريقة معدلًا محسنًا لاستعادة البروتين بعد مرور ساعة واحدة فقط على الترسيب بالأسيتون بعد إضافة السكروز ، وهو مكون لا يتداخل مع اختبار برادفورد.

اختبار Lowry ، الذي اقترحه Oliver H. Lowry في عام 1951 ، يعتمد على تفاعلين كيميائيين (الشكل 3). التفاعل الأول هو اختزال أيونات النحاس في ظل الظروف القلوية ، والتي تشكل معقدًا مع روابط الببتيد (تفاعل Biuret الذي تمت مناقشته أعلاه). والثاني هو اختزال كاشف Folin-Ciocalteu بواسطة مركب رابطة النحاس الببتيد ، والذي يتسبب لاحقًا في تغيير لون المحلول إلى اللون الأزرق مع امتصاص في نطاق 650 إلى 750 نانومتر يمكن اكتشافه باستخدام مقياس طيف ضوئي [10]. يمكن تقدير كمية البروتين في العينة باستخدام منحنى قياسي لمحلول بروتين معياري محدد مثل مساحة سطح الجسم.

تتمثل مزايا هذا الاختبار في حساسيته ، والأهم من ذلك ، دقته. ومع ذلك ، فإنه يتطلب وقتًا أطول من المقايسات الأخرى والعديد من المركبات المستخدمة بشكل شائع في المحاليل المنظمة لإعداد البروتين (مثل المنظفات والكربوهيدرات والجليسرول والتريسين و EDTA و Tris) تتداخل مع مقايسة Lowry وتشكيل الرواسب (الجدول 3) [10] . ومع ذلك ، يمكن تقليل تأثير هذه المواد عن طريق تخفيف العينة ، ولكن فقط إذا كان تركيز البروتين مرتفعًا بشكل كافٍ [27]. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه يمكن تقليل وقت إجراء هذا الاختبار من خلال رفع درجات الحرارة أو استخدام فرن الميكروويف [27].

منظفاتمركب ثنائي كبريتيد
الكربوهيدراتالفينول
الجلسرينحمض اليوريك
تريسينجوانين
EDTAزانثين
تريسالكالسيوم المغنيسيوم
مركبات البوتاسيوممركبات سلفهيدريل

3- (4-carboxybenzoyl) quinoline-2-carboxaldehyde (CBQCA) هو كاشف فلوروجيني حساس يستخدم للكشف عن الأمينات في البروتينات. نظرًا لأنه لا يمكنه اكتشاف سوى الأمينات التي يمكن الوصول إليها في البروتين الذي تم فحصه ، فإن هذه الطريقة لها نفس قيود طرق القياس الطيفي التي تعتمد نتائجها على عدد بعض الأحماض الأمينية في البروتين. ومع ذلك ، فإن CBQCA حساس للغاية ويمكنه اكتشاف 10 نانوغرام إلى 150 ميكروغرام من البروتين في حجم 100 ميكرولتر. على الجانب الإيجابي أيضًا ، يعمل كاشف CBQCA جيدًا في وجود المواد ، مثل الدهون ، المعروف بتدخله في العديد من طرق تحديد البروتين الأخرى [28] ، أو عند استخدامه لتحديد كمية الببتيدات أو البروتينات المثبتة على السطح أو المغلفة [5] .

تتمثل الخطوة الحاسمة في العديد من التجارب المعملية الطبية الحيوية في تحديد كمية بروتين معين في المحلول. تم استخدام العديد من التقنيات لتحقيق ذلك. الطرق الشائعة لطرق القياس الكمي هي ELISA ، وتحليل اللطخة الغربية ، وقياس الطيف الكتلي. تمت مناقشة ELISA و Western blot في تطبيقات الأجسام المضادة ، وتناقش مواصفات الكتلة هنا باختصار ، وتمت مناقشتها في مقالة مراجعة Labome التحليل البيولوجي الكمي للبروتينات بواسطة قياس الطيف الكتلي.

يعد قياس طيف كتلة البروتين طريقة جديدة نسبيًا ومتطورة لتقدير كمية البروتين. إلى جانب توصيف البروتين ، هناك خطوة مهمة في التحليل البروتيني وهي إمكانية تحديد بروتين معين. تم إدخال العديد من التقنيات وتنفيذها لتقدير كمية البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي.عندما يكون وضع العلامات على البروتين ممكنًا ، يتم تمييز عينة بروتين أو ببتيد بنظير أثقل مستقر (على سبيل المثال ، 13 درجة مئوية أو 15 نيوتن) بينما يتم تمييز عينة ثانية (معيار داخلي) بنظير أخف (على سبيل المثال ، 12 درجة مئوية أو 14 نيوتن) . يتم خلط العينات والاختلافات في الكتلة بسبب الملصقات تجعل من الممكن تحليل نسبة شدة الذروة للعينتين بواسطة محلل الكتلة ، والذي يتوافق مع نسبة الوفرة النسبية. تسمح الطرق البديلة بتقدير كمية البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي دون تسمية العينات [29].

المثير بشكل خاص هو القدرة على استخدام مقياس الطيف الكتلي كنهج عالمي لأداء كل من المقايسات الكمية والنوعية في قياس واحد. على سبيل المثال ، تم مؤخرًا نشر العديد من الأساليب القائمة على MS والتي تم تطويرها لتقدير بروتينات معينة في العينات البيولوجية. وتشمل هذه طريقة لتقدير عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 في مصل الدم [30] ، وطريقة لتقدير كمية الألبومين في البول [31] ، والأوبيكوينون في المصل / البلازما [32]. يمكن أيضًا العثور على طرق لتقدير البروتينات المستهدفة الأقل تحديدًا في الأدبيات الحديثة [33-35]. تم نشر إرشادات لقياسات مطياف الكتلة المستهدفة للببتيدات والبروتينات [36] لمحاولة ضمان طرق دقيقة وقابلة للمقارنة في هذا النهج سريع التطور. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة أدوات مكلفة لا تستطيع العديد من المعامل تحملها وهذا يحد من فائدة هذا النهج [14 ، 37].

من أجل القياس الكمي الطيفي للكتلة للبروتينات ، يمكن ربط معايير الببتيد الداخلية للعديد من البروتينات لتمكين التحليل المتعدد للبروتينات (بروتين QCAT) [38]. تم تطوير امتداد لهذه الطريقة حيث تضمنت هذه الببتيدات المتسلسلة حواتم مستضدية لأجسام مضادة متعددة. يمكن لبروتينات المعايرة المتسلسلة المسماة DOSCATs (conCATamers ذات المعيار المزدوج) أن تفي باحتياجات كل من مقياس الطيف الكتلي والبقعة الغربية [39].

يمكن مراقبة تعبير البروتين في الخلايا الحية عن طريق الربط الجيني لبروتين مهم ببروتين مراسل أو حلقمة ، مثل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). إن ربط البروتين الذي يهم المراسل مع عنصر هيدرولاز معين يعمل باتحاد الدول المستقلة يسمى "مراسل كمية البروتين" (PQR) [1] يسمح بنسخ البروتين والمراسل معًا ولكن يتم ترجمته كبروتينات وظيفية منفصلة. هذا يمكن أن يضمن التعبير المتكافئ لكل من البروتين والمراسل وبالتالي ، يمكن استنتاج كمية البروتين من كثافة الفلورسنت (الشكل 4).

أدت قيود طرق القياس الكمي التي نوقشت أعلاه إلى تطوير استراتيجيات جديدة لتحديد تركيزات البروتين في حلول بسيطة ومعقدة. واحدة من أكثرها شيوعًا تستفيد من الخصائص البصرية للجسيمات النانوية [40]. باختصار ، فإن الطول الموجي الذي تمتص فيه جسيمات نانوية معينة تحولات الضوء بسبب ارتباط الجزيئات الأخرى أو التجمع [41]. نظرًا لأن نطاق امتصاص الضوء يقع في الطيف المرئي ، يُنظر إلى هذا التحول على أنه تغيير في اللون. تم استخدام الجسيمات النانوية حتى الآن بالاقتران مع الجزيئات الرابطة للبروتين ، على سبيل المثال ، الأجسام المضادة أو الببتيدات أو الأبتاميرات. اقترح روجوفسكي وزملاؤه نوعًا جديدًا من مستشعرات الجسيمات النانوية لاكتشاف وتقدير كمية البروتينات ، والتي أطلقوا عليها اسم "الأنف الكيميائي" [42]. يتكون جهاز الاستشعار الخاص بهم من مزيج من جزيئات الذهب النانوية بأشكال مختلفة تعرض التجميع التفاضلي عند التفاعل مع بروتينات مختلفة (الشكل 5). بناءً على أطياف امتصاص الضوء ، تسمح الجزيئات باكتشاف وتقدير البروتينات المنقاة في المحاليل المائية أو البروتينات غير المنقاة في المحاليل المعقدة.

طور كونج وزملاؤه طريقة باستخدام جزيئات طويلة من الحمض النووي ومسام زجاجية صلبة النانو لقياس تركيز البروتينات في المحلول في النطاق النانوي [2]. في هذه الطريقة ، تنتقل الجزيئات الحاملة للحمض النووي ، القادرة على ربط البروتينات في مواقع محددة ، عبر المسام النانوية بمساعدة تيار كهربائي. عند النقل ، يتسبب الحمض النووي في إشارة السقوط الحالية. يتم تسجيل قطرة إضافية عند ربط البروتين بالحمض النووي. كلما زاد تركيز البروتين ، زاد "تحميل" الناقل. كما يزداد تواتر قمم الانخفاض الحالية الثانوية مع زيادة تركيز البروتين (الشكل 6).

قام Labome بمسح المنشورات التي تمت مراجعتها بشكل عشوائي والتي تمت مراجعتها من قبل الأقران والتي تشير إلى فحوصات البروتين الإجمالية. تم تحديد معامل Thermo Fisher Pierce و Bio-Rad كموردين رئيسيين لمجموعات فحص البروتين الكلية (الجدول 4). الطرق الأكثر استخدامًا هي BCA و Bradford.

فحصالموردرقممرجع عينة
BCA / على أساس النحاس
ثيرمو فيشر13023275 [43], 23225 [44]
ميليبور سيغما8
بيوتايم2
GE Healthcare1كمية 2-D [45]
برادفورد
بيو راد57 [46, 47], 5000006 [48]
ثيرمو فيشر بيرس11 [49], 23200 [50]
ميليبور سيغما1
اكسبديون1 [44]
كارل روث1روتي نانوكوانت [51]
Lowry / تعديل DC الفحص
بيو راد17 [52]
ميليبور سيغما1
كشف الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر
الحرارية العلمية (Nanodrop)3

تم تقديم جميع فحوصات بروتين BCA المذكورة في المجموعة التي شملتها الدراسة تقريبًا بواسطة بيرس ، حيث اخترع أحد العلماء المقايسة منذ عدة سنوات. اشترت Thermo Fisher شركة Pierce منذ عدة سنوات. تم استخدام مقايسات Thermo Fisher Pierce BCA لدراسة ، على سبيل المثال ، فصل طور البروتيازومات [53] ، ونمو السالمونيلا [54] ، وتعبير Cox-2 و mPGES-1 في الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع عظم الفأر [55] ، وتأثير أوليغومرات أميلويد بيتا على الحوائط والشعيرات الدموية [16] ، التنكس العصبي α-synuclein المرضي في مرض باركنسون [56] وغيره [57 ، 58]. تم استخدام مجموعات فحص البروتين Micro BCA الخاصة بها لقياس تاو المتحولة المؤتلفة المنقى [59].

كما تم الاستشهاد بكاشف MilliporeSigma BCA ومجموعة فحص بروتين Bio-Rad BCA.

تعد Thermo Fisher Pierce أيضًا أحد الموردين الرئيسيين لمجموعات اختبار Bradford. قام Kapogiannis D وآخرون بقياس محتويات البروتين في عينات الجسيمات الخارجية وعينات البلازما قبل لطخة غربية باستخدام اختبار برادفورد من Thermo Fisher (كتالوج: 23200) [50]. تم استخدام كواشف اختبار البروتين Bio-Rad Bradford لقياس محتوى البروتين في مستخلصات الهيستون الخام (كتالوج: 5000006) [60] ، محللات خلايا سرطان الثدي [47] ، ومحللات خلايا A549 [48].

كما قدم موردون آخرون مجموعات اختبار برادفورد ، على سبيل المثال ، كارل روث [51] وإكسبيدون [61].

تم استخدام مقايسة بيرس لوري (رقم الكتالوج 23240) في [62] وتم استخدام اختبار Lowry في مختبرات Bio-Rad في [63] و [64] لتقدير كمية البروتين. فحص البروتين Bio-Rad DC هو نسخة معدلة من مقايسة Lowry. إنه فحص بروتين شائع ، بسبب توافقه مع المنظفات. تم استخدام هذا الاختبار لتحديد تركيز البروتين لدراسة بنية ووظيفة بروتين غشاء tetraspanin البشري CD81 [65] تأثير استئصال عضلات الهيكل العظمي من جاما (العصارة الخلوية) -اكتين على النمط الظاهري MDX [62] ، من بين أمور أخرى [66] ، 67].

أفضل معيار لتقدير كمية البروتين هو نفس البروتين الذي يتم فحصه. ومع ذلك ، هذا عادة ما يكون غير ممكن. BSA (الزلال المصل البقري) هو معيار البروتين الأكثر استخدامًا. لها حدود. إنه أكثر حساسية في اختبار برادفورد من البروتينات الأخرى ، وبالتالي من المحتمل أن يتم التقليل من تركيز عينة البروتين [68]. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تحضير / الحصول على BSA ، كبروتين مصل ، بنقاوة عالية جدًا ، لأنه يرتبط بالعديد من العوامل الأخرى. تم استخدام بروتينات أخرى ، مثل الغلوبولين المناعي G ، والليزوزيم كمعايير بروتين أيضًا. يمكن أن يختلف الخيار الأفضل في تجربة معينة اعتمادًا على كل من البروتينات التي تهمك وطريقة القياس التي تختارها.

لا. من المهم جدًا أن تقع نقاط بيانات العينة ضمن نطاق المنحنى القياسي لأن المنحنى قد يختلف بشكل غير متوقع عند التركيزات الأعلى أو الأقل. يجب تعديل تخفيف عيناتك و / أو معاييرك للحفاظ على عيناتك ضمن المنحنى القياسي.


3 نتائج

3.1 PD0325901 يعزز توليد خلايا MBP + من OPC المشتق من NPC في المختبر

لتحديد الجزيئات الصغيرة الشبيهة بالعقاقير التي يمكن أن تحفز تمايز OPC ، قمنا بتطوير اختبار تصوير عالي المحتوى يعتمد على تعبير MBP (Guo et al. ، 2018). باختصار ، تم إنفاق الشخصيات غير القابلة للعب القشرية من أجنة الفأر E14.5 في المختبر كغلاف عصبي. تم بعد ذلك تمييز NPCs إلى OPCs مع مورفولوجيا ثنائية القطب أو ثلاثية القطب نموذجية. ثم تم تمييز OPCs إلى MBP + OLs الناضجة عن طريق الزراعة في وسط OL لمدة 4 أيام. تمت إضافة مركبات مختلفة عند 20 ميكرومتر أثناء تمايز OPC إلى OL (اليوم 0 ، الشكل 1 أ) ، واستخدمت النسبة المئوية لخلايا MBP + في اليوم 4 كقراءات. تم فحص سبعة آلاف وثلاثمائة وسبعة وأربعين مركبًا من مكتبة المركبات الوطنية الصينية وتم العثور على عدد من المركبات ، بما في ذلك فيتامين C ، لتعزيز توليد خلايا MBP + (Guo et al. ، 2018).

من بين هذه المركبات ، تم العثور على مثبط MEK ، PD0325901 ، لزيادة النسبة المئوية لخلايا MBP + اعتمادًا على الجرعة (EC50 ∼ 100 نانومتر) (الشكل 1 ب). قررنا إجراء مزيد من التحقيق في هذا المركب لأنه مركب متاح عن طريق الفم يعبر بسهولة الحاجز الدموي الدماغي (Lopez-Juarez et al. ، 2017). تمت دراسة التأثير المعتمد على الوقت لـ PD0325901 أيضًا عن طريق إضافة 10 ميكرومتر من المركب في وسط OL لفترات مختلفة (الشكل 1 ج). تشير النتائج إلى أن الإضافة المبكرة لـ PD0325901 كانت مهمة. أدى العلاج بـ PD0325901 ليوم واحد فقط في مرحلة البداية إلى زيادة كبيرة في خلايا MBP + (الشكل 1 ج). في المقابل ، كان للعلاج PD0325901 بعد اليوم الثاني تأثير محدود للغاية (الشكل 1 ج). أظهر تحليل QPCR أيضًا أن عددًا من علامات OL ، بما في ذلك MBP ، والبروتين السكري المرتبط بالمايلين (MAG) ، والبروتين السكري myelin oligodendroglial (MOG) ، 2 ′ ، 3′-cyclic nucleotide 3′-phosphodiesterase (CNPase) ، و PLP ، قد ازدادت بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة PD0325901 (الشكل 1 د). في PD0325901 (10 ميكرومتر) من OPCs المعالجة ، أصبح أكثر من 20 ٪ من الخلايا MBP + في اليوم 4 (الشكل 1 هـ ، و). كانت كفاءة الحث أعلى قليلاً من محفز OL المعروف T3 (500 نانومتر) (الشكل 1 هـ ، و). الأكثر إثارة للاهتمام ، أظهر PD0325901 و T3 تأثيرًا إضافيًا في تحفيز خلايا MBP + ، مما يشير إلى أن هذين المركبين قد يعملان من خلال آليات مختلفة (الشكل 1 هـ ، و).

عادةً ما تمتلك OLs الناضجة عمليات غشاء معقدة وتكون أكبر في الحجم من OLs غير الناضجة. قمنا بتصنيف MBP + -OLs بعناية إلى ثلاث مجموعات حسب مساحة الخلية: صغيرة (600-2000 ميكرومتر 2 ، سهم أصفر ودائرة) ، متوسطة (2000-4000 ميكرومتر 2 ، سهم أحمر ودائرة) وكبيرة (& GT4000 ميكرومتر 2 ، سهم أبيض ودائرة) حجم OLs (الشكل 1g). عزز PD0325901 توليد OLs صغيرة ومتوسطة وكبيرة الحجم إلى حد مماثل (الشكل 1 ح).

لتأكيد تأثير PD0325901 بشكل أكبر على الجيل OL ، تمت دراسة التعبير التدريجي للعلامات المتعددة التي تمثل مراحل التمايز المختلفة لـ OLs. في المرحلة المبكرة من التمايز ، تؤدي OPCs إلى ظهور ما قبل OLs التي تعبر عن O4 (Barateiro & Fernandes ، 2014 Zhang ، 2001). أدى العلاج PD0325901 إلى زيادة أعداد خلايا O4 + بشكل ملحوظ من اليوم الأول (الشكل 2 أ ، ب). يمكن اكتشاف CNPase ، الذي تم التعبير عنه في وقت متأخر قليلاً عن O4 أثناء نضج OL (Barateiro & Fernandes ، 2014 Zhang ، 2001) في وقت مبكر من اليوم الثاني في الخلايا المعالجة PD0325901 (الشكل 2 ج ، د). بينما في الخلايا المعالجة بـ DMSO ، تأخر التعبير عن CNPase ليوم واحد على الأقل ، ولا يمكن ملاحظة خلايا CNPase + ذات العمليات الغشائية الشفافة إلا بعد اليوم 4 (الشكل 2 ج ، د). ويمكن الكشف عن تعبير MBP ، وهو علامة لـ OLs الناضجة ، من اليوم الثالث في الخلايا المعالجة PD0325901 ، قبل يوم واحد من التحكم DMSO. كانت النسب المئوية لـ O4 + MBP + OLs أعلى أيضًا بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة بـ PD0325901 مقارنةً بالتحكم في DMSO في جميع النقاط الزمنية الثلاث التي تم تحليلها (الشكل 2 أ ، هـ). بدمج البيانات من الشكل 1 ج ، تشير هذه النتائج إلى أن PD0325901 يمارس تأثيره في المرحلة المبكرة من تمايز OL. يروج PD0325901 OPC إلى تحديد مصير OL ، وبمجرد إنشاء OLs غير الناضجة ، سيتم الحصول على OLs أكثر نضجًا.

3.2 تثبيط مسار ERK / MAPK يعزز جيل OL

PD0325901 هو نظير معروف من الجيل الثاني لـ CI-1040 ، وهو أول مثبط لـ MEK (أحد مثبطات MAPK كيناز) يدخل التقييم السريري (Sebolt-Leopold et al. ، 2004). لذلك ، تم أيضًا تقييم لوحة من مثبطات MEK المبلغ عنها ، بما في ذلك AZD8330 و AZD6244 و U0126 و CI-1040 (Akinleye و Furqan و Mukhi و Ravella و Liu ، 2013 Planz ، 2013) ، في مقايسة التمايز OPC إلى OL. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، ب ، يمكن لجميع المثبطات أن تحفز تمايز OPC إلى OL بطريقة تعتمد على الجرعة بكفاءات مختلفة. كان أفضل تأثير لـ AZD8330 مشابهًا لـ PD0325901 ، أصبحت 25 ٪ من الخلايا MBP + عند معالجتها بهذه المركبات. يمكن للمركبات الأخرى (AZD6244 و U0126 و CI-1040) فقط أن تحفز ظهور خلايا MBP + 10٪ -15٪ في الجرعات الأكثر فعالية (الشكل 3 أ ، ب). علاج OPCs بهذه المركبات (بالجرعة الأكثر فعالية في إحداث تمايز OPC إلى OL) لمدة 15 دقيقة تقريبًا يمنع الفسفرة في ERK1 / 2 (الشكل 3 ج). ومن المثير للاهتمام ، عندما استمر العلاج المركب لمدة 4 أيام (تم تحديث المركبات المحتوية على وسيط مرة واحدة في اليوم الثالث) ، أظهر PD0325901 و AZD8330 فقط تثبيطًا تامًا للفسفرة ERK1 / 2 ، والذي يرتبط جيدًا بمستويات عالية من MBP التي تم اكتشافها في نفس المجموعة (الشكل ثلاثي الأبعاد) ). تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط مسار MAPK / ERK يعزز توليد OL ، وقد تكون مدة تثبيط MAPK / ERK حاسمة في تعزيز عملية التمايز.

3.3 PD0325901 يعزز عملية تكوّن النخاع في الثقافة المشتركة للخلايا العصبية OPC-DRG في المختبر

تمت دراسة تأثير PD0325901 في تعزيز التمايز OPC إلى OL في OPCs الأولية. تم العثور على PD0325901 لزيادة الجرعة بشكل يعتمد على النسبة المئوية لـ MBP + -OLs المتولدة من OPCs الأولية (الشكل 4 أ ، ب). ثم أنشأنا نظام نخاع في المختبر من خلال زراعة OPCs الأولية مع عصبونات DRG (O'Meara ، Ryan ، Holly ، & Rashmi ، 2011) لتقييم تأثير PD0325901 على تكوين المايلين. تم قياس كمية المحاور النخاعية على أنها توطين مشترك لعملية MBP + OL و NFH + (وتسمى أيضًا NF-200 ، 200 كيلو دالتون العصبي) محاور (Huang et al. ، 2011). مقارنة بالتحكم في DMSO ، تسبب PD0325901 في زيادة تعتمد على التركيز في طول MBP + NHF + محور عصبي النخاعي في الثقافة المشتركة (الشكل 4 ج ، د). تشير هذه النتائج إلى أن انخفاض إشارات ERK / MAPK لا يعزز فقط إنشاء OLs الناضجة من OPCs الأولية ولكنه يعزز أيضًا تكوين المايلين في المختبر.

3.4 PD0325901 يعزز إعادة الميالين في الفئران EAE

يتميز مرض التصلب العصبي المتعدد و EAE بإزالة الميالين بوساطة المناعة الذاتية والتنكس العصبي. درسنا بعد ذلك تأثير PD0325901 في نموذج EAE الناجم عن MOG. تم إعطاء PD0325901 (5 مجم / كجم) بشكل وقائي عن طريق الحقن اليومي داخل الصفاق من اليوم الثالث بعد التمنيع ووجد أنه يقلل بشكل كبير من درجات المرض مقارنةً بالتحكم في السيارة (الشكل 5 أ). في تجربة موازية ، تم عزل الحبال الشوكية من PD0325901- أو الفئران المعالجة بالمركبة في اليوم 21 بعد التمنيع. تم تقييم OLs و OPCs في آفات الحبل الشوكي عن طريق التلوين المناعي بالأجسام المضادة التي تتعرف على علامات OLs الناضجة (MBP و GST-pi) و OPCs (NG2) (الشكل 5 ب-د). حدثت إزالة الميالين الشديدة في الحبل الشوكي لفئران EAE حيث فقدت بعض المناطق في المادة البيضاء تلطيخ MBP (الشكل 5 ب ، هـ) كما انخفض عدد خلايا GST-pi + بشكل كبير (الشكل 5 ج ، و). وفي الحبل الشوكي منزوع الميالين ، لوحظ عدد كبير من NG2 + OPCs في منطقة المادة البيضاء (الشكل 5 د ، ز). في الفئران المعالجة PD0325901 ، تم تخفيف إزالة الميالين بشكل كبير مع زيادة عدد GST-pi + OLs الناضجة ، وانخفاض عدد NG2 + OPCs (الشكل 5 ب-ز). علاوة على ذلك ، تم تحليل نسب g (قطر المحور العصبي إلى إجمالي قطر الألياف النخاعية) لمحاور الحبل الشوكي المعاد تشكيله بواسطة المجهر الإلكتروني للإرسال. تم إثبات إزالة الميالين من خلال زيادة نسبة g في الفئران EAE مقارنة بالفئران الساذجة (الشكل 5h-j). خفض العلاج PD0325901 بشكل كبير نسب g في الفئران EAE ، مما يشير إلى انتعاش أفضل (الشكل 5h-j). تشير هذه الملاحظات إلى أن تثبيط إشارات MAPK / ERK قد يعزز إعادة الميالين في الفئران EAE من خلال تعزيز التمايز OPC إلى OL.

ومع ذلك ، ما إذا كان PD0325901 يؤثر على الجزء المناعي من نموذج EAE يظل بعيد المنال. الخلايا المسببة للأمراض في EAE هي بشكل أساسي خلايا CD4 + T ، وخاصة المجموعتين الفرعيتين Th17 و Th1. أفادت دراسة سابقة أن الحصار المفروض على ERK يضعف EAE عن طريق تثبيط تحريض خلايا Th1 و Th17 (Brereton ، Sutton ، Lalor ، Lavelle ، & Mills ، 2009). أظهرت دراسات أخرى أن الحصار المفروض على ERK يعزز تمايز Th17 (Cui et al. ، 2009 Tan & Lam ، 2010) دون التأثير على المجموعة الفرعية Th1 (Cui et al. ، 2009). كما أن تثبيط ERK لا يؤثر بشكل كبير على إنتاج Th17 (Lu et al. ، 2010). كانت الاستنتاجات من الدراسات السابقة مثيرة للجدل.

لتأكيد قدرة PD0325901 بشكل أكبر في تحسين إعادة الميالين في الجسم الحي ، أجرينا نموذج إزالة الميالين المستحث بالخلايا التائية المستحثة بالكوبريزون (Doan et al. ، 2013 Matsushima & Morell ، 2001).

3.5 PD0325901 يعزز استعادة الميالين في نموذج إزالة الميالين الذي يسببه الدواء

تم تغذية الفئران بنظام غذائي يحتوي على 0.2 ٪ (وزن / وزن) كوبريزون لمدة 5 أسابيع للحث على إزالة الميالين بالكامل (الشكل 6 أ-ج). عند انسحاب cuprizone ، تمت إدارة السيارة أو PD0325901 (10 مجم / كجم) بواسطة i.p. الحقن لمدة أسبوع أو أسبوعين (الشكل 6 أ). تم التخلص من الفئران بطريقة القتل الرحيم وتم تقييم عملية تكوين الميالين في الجسم الثفني عن طريق تلطيخ Luxol السريع باللون الأزرق (Berghoff et al. ، 2017 Deshmukh et al. ، 2013). يمكن ملاحظة إعادة الميالين العفوية في المجموعة المعالجة بالمركبة ، كما أدى العلاج PD0325901 إلى تسريع عملية إعادة الميالين (الشكل 6 ب ، ج). تم تقييم تأثير PD0325901 بشكل إضافي من خلال التلوين المناعي لبروتينات المايلين MBP و MOG ، وعلامة OL الناضجة GST-pi في منطقة الجسم الثفني بعد علاج لمدة أسبوعين باستخدام PD0325901. تمشيا مع تلطيخ Luxol باللون الأزرق السريع ، زاد علاج PD0325901 بشكل كبير من تلطيخ MBP و MOG ، وعدد GST-pi + OLs (الشكل 6 د-و). علاوة على ذلك ، تم اكتشاف عدد أقل من PDGFRα + OPCs في المجموعة المعالجة PD0325901 (الشكل 6 د ، و) ، مما يشير إلى أن PD0325901 يعزز إعادة الميالين في الجسم الحي من خلال تعزيز تمايز OPC.

100 محوار نقي محسوب لكل فأر ، ثلاثة فئران لكل مجموعة. نظرًا لأن إزالة الميالين كانت شاملة ، تم إحصاء 48 فقط من المحاور النخاعية في مجموعة Cuprizone [5 أسابيع]) ، ### ص & lt .001 مقابل مجموعة cuprizone ، ***ص & lt .001 مقابل مجموعة المركبات (ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey للمقارنة المتعددة). (ك) مخطط التشتت الذي يعرض الفرد ز- قيم النسبة وتوزيع الحجم المحوري [يمكن رؤية الشكل الملون على wileyonlinelibrary.com]

تم تقييم حالة الميالين بشكل إضافي عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني. بعد 5 أسابيع من علاج cuprizone ، بقي عدد قليل جدًا من المحاور في الجسم الثفني مغمورًا بالنخاع (الشكل 6g-i). بعد أسبوعين من سحب cuprizone ، يمكن ملاحظة إعادة الميالين العفوية حيث زاد عدد المحاور النخاعية بشكل كبير (الشكل 6g-i).كان للحيوانات المعالجة بـ PD0325901 عددًا أكبر من المحاور النخاعية (الشكل 6g-i) ونسبة g أقل (الشكل 6j ، k) ، مما يشير إلى انتعاش أفضل من المجموعة الضابطة.


تحلل الخلايا والترسيب المناعي باستخدام منظف CHAPS

تمت صياغة المخزن المؤقت للترسيب المناعي CHAPS (CIB-1) للحفاظ على التفاعلات بين الجزيئات بعد استخراج البروتين عبر الغشاء والخلوي. يعد المخزن المؤقت CHAPS مثاليًا لسحب تحليل الترسيب المناعي المشترك (أي Co-IP) ، لأنه يحافظ على تكوين البروتين بالإضافة إلى تجميع معقد البروتين.

بعد تحلل الخلية وإذابة البروتين الخلوي في المخزن المؤقت لـ CHAPS ، يمكن عزل البروتينات المجمعة معًا باستخدام تقنية الترسيب المناعي. يضاف الجسم المضاد المناعي للارتباط بأحد أهداف البروتين المجمعة. يتم بعد ذلك إضافة دعامة صلبة ، مثل Protein-G Sepharose ، للربط غير التساهمي والارتباط بمركب البروتين والأجسام المضادة وتجعله غير قابل للذوبان. بعد سرعة منخفضة للطرد المركزي والترسيب والغسيل ، يتم عزل مركب البروتين والأجسام المضادة الصلبة معًا.

البروتينات التي يتم تجميعها مع البروتين الذي يستهدفه الجسم المضاد المناعي تصبح مناعية مشتركة. من خلال تطوير لطخات غربية بجسم مضاد مختلف يستهدف بروتينًا مشتركًا ، يمكن للباحث توصيف وتحديد التفاعل بين نوعين أو أكثر من أنواع البروتين. يمكن أيضًا استخدام فحوصات النشاط الكيميائي الحيوي الوظيفي لتوصيف الجزيئات الحيوية المُجمَّعة والمُترسَّب بالمناعة.

عناصر

  • جهاز الطرد المركزي الدقيق عند 4 درجات مئوية
  • طاولة هزازة
  • غرفة باردة أو علبة مبردة
  • جسم مضاد مناسب للترسيب المناعي كما هو محدد من قبل البائع. بشكل عام ، يجب أن يتعرف الجسم المضاد المسبب للمناعة على التشكل الأصلي.
  • تطبيقات اللطخة الغربية: جسم مضاد مناسب لاكتشاف اللطخة الغربية كما هو محدد من قبل البائع. يجب أن يتعرف هذا الجسم المضاد على حالة DENATURED للبروتين المستهدف.

ضوابط وعينات مقترحة للمقارنات

  • أداء بروتوكول الترسيب المناعي مع جسم مضاد غير ذي صلة للتحكم في ظهور العصابات البروتينية الزائفة.
  • حل في اللطخات الغربية محللة الخلية الأصلية غير المجزأة ، والجزء غير المنضم (على سبيل المثال ، الجزء الذي يحتوي على بروتينات غير مرتبطة بالدعم الصلب للبروتين A أو G) والمواد المثبطة للمناعة لتأكيد التجزئة والإثراء.
  • تطوير لطخة غربية تكتشف البروتين المستهدف مباشرة من قبل الجسم المضاد المناعي. يؤكد هذا الإجراء حدوث الترسيب المناعي.

ألف بروتوكول لثقافة الخلية

يوصى بتربية الخلايا حتى 80-90٪ من الالتقاء قبل إجراء تحلل الخلايا والترسيب المناعي. يجب غسل الخلايا خالية من بروتينات المصل باستخدام PBP قبل إجراء الترسيب المناعي لمنع ظهور عصابات بروتين مصل غير محددة في البقع الغربية في اتجاه مجرى النهر.

B. بروتوكول تحلل الخلية بمنظف CHAPS

نوصي باستخدام 300 ميكروليتر من محلول CHAPS لأطباق زراعة الخلايا من 1 إلى 3 10 سم من الخلايا المتحللة. مقياس وفقًا للأرقام أو الأحجام الأخرى لأطباق زراعة الخلايا وفقًا لمساحة سطح الطبق. قبل التحلل ، اجعل ثلج CHAPS Buffer باردًا وأضف مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز.

يجب غسل الخلايا خالية من بروتينات المصل باستخدام PBS قبل إجراء الترسيب المناعي لمنع ظهور عصابات بروتين مصل غير محددة في البقع الغربية المصب. إزالة المتوسطة ثقافة الخلية وغسل طبق ثقافة الخلية 10 سم بلطف مع 5 مل برنامج تلفزيوني ، ثلاث مرات. استخدم دفقًا لطيفًا من برنامج تلفزيوني لمنع الخسارة المفرطة للخلايا من اللوحة. بعد الغسل ، قم بتغطية طبق زراعة الخلايا بالغطاء وضع طبق زراعة الخلايا على سرير من الثلج

  • خلايا ليز وتنتج جزءًا طافًا بسرعة على النحو التالي: الاستغناء عن 300 وحدة ثلجية باردة من مثبطات الأنزيم البروتيني / الفوسفاتيز فوق طبقة الخلية ، وقم بتدوير اللوحة يدويًا لتغطية الخلايا بغشاء من CHAPS ، ثم قم بإخراج الخلايا فورًا باستخدام مكشطة الخلية . استخدام ماصة نقل مع فتحة واسعة لشفط الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. يمكن أيضًا نقل محلول 300 uL Chaps بالتتابع إلى ما يصل إلى ثلاث لوحات منفصلة بحجم 10 سم من الخلايا قبل وضع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.
  • ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل مع تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق: اضغط بقوة على الأنبوب عدة مرات خلال هذه الفترة التي تبلغ 10 دقائق لتسهيل انحلال غشاء الخلية. يمكنك أيضًا استخدام طاولة متأرجحة لتدوير تعليق الخلية لزيادة تسهيل انحلال غشاء الخلية. لا تقم بتدوير محلول الخلية إذا تم التخطيط للترسيب المناعي.
  • الطرد المركزي المحللة الخلية في ميكروسينتريفوجي مبردة بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة لتقسيم طاف وبيليه. اجمع الجزء الطاف ، الذي يحتوي على الغشاء المستخرج وبروتينات العصارة الخلوية ، وقم بتوزيع هذا الطاف في أنبوب آخر للطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل يتم وضعه في الجليد. يتوافق هذا الطاف المنقول مع جزء طاف غير مجزأ. وضع جانبا قسامة صغيرة لإجراء مقارنات بالمواد المناعية التي تم إنشاؤها لاحقًا في البروتوكول. يمكن تخزين المادة الطافية غير المجزأة عند -20 درجة مئوية ، أو -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

جيم بروتوكول الترسيب المناعي مع المنظفات CHAPS

  • إضافة الجسم المضاد المناعي إلى جزء طاف غير مجزأ ، باستخدام عيار الجسم المضاد الموصى به من قبل الشركة المصنعة. ضع الأنبوب مع تفاعل الترسيب المناعي على طاولة متأرجحة تحت التبريد (مثل غرفة باردة ، أو علبة مبردة) لمدة 15-30 دقيقة لخلط خليط طاف الأجسام المضادة. قد تختار في البداية تجربة فترة 15 دقيقة الأقصر للترسيب المناعي ، وهي فترة زمنية أكثر ملاءمة للحفاظ على تفاعلات تقارب منخفضة.
  • قم بالاستغناء مباشرة عن 60 ميكرولتر من حبات الترسيب المناعي (مثل خرز Sepharose-G ، أو حبات البروتين A) في كل 300 ميكرو لتر إلى 2 مل من المادة الطافية غير المجزأة مع الأجسام المضادة المناعية. ضع هذا الأنبوب على طاولة متأرجحة لمدة 30 دقيقة أخرى إلى ساعة واحدة تحت التبريد لتوليد معقد صلب غير قابل للذوبان - معقد بروتين جسم مضاد.
  • استخدم جهاز طرد مركزي صغير مبرد عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لترسيب حبات الترسيب المناعي. الناتج الطاف هو الكسر غير المنضم. جمع الكسر غير منضم دون إزعاج بيليه حبة الراسب المناعي. تخزين الجزء غير منضم عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
  • إضافة قسامة إضافية من 300 UL الجليد الباردة CHAPS مع مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز إلى حبات الترسيب المناعي. قم بتدوير الأنبوب 180 درجة يدويًا ثلاث مرات وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص من غسل طاف. كرر إجراء الغسيل هذا مرتين أخريين. بعد الغسل الأخير ، استخدم جهاز الطرد المركزي الصغير لترسيب حبات الترسيب المناعي عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول الغسيل باستخدام ماصة بلاستيكية مدببة باستور. يتم ترسيب الجزء المثقل بالمناعة ، المرتبط بالخرز ، في قاع الأنبوب.

د. بروتوكول شطف الكسر المناعي من الحبيبات والبقعة الغربية بمنظف CHAPS

  • هناك عدة طرق لاستخراج البروتينات المثبطة للمناعة من الدعامة الصلبة لإطلاق جزء قابل للذوبان من الراسب المناعي. أبسط طريقة قابلة للتطبيق على النشاف الغربي اللاحق هي تطبيق Laemmli Sample Buffer (LSB مع mercaptoethanol) مباشرة على خرز المناعة: أضف 100l LSB إلى كل 60 ميكروليتر من حبات الترسيب المناعي. دوامة LSB - محلول الراسب المناعي بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية ، ثم تسخينها عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الآن قم بترسيب الخرزات باستخدام الطرد المركزي منخفض السرعة (3000 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق. جمع المادة الطافية سيتم إطلاق البروتينات المثبطة للمناعة (جنبًا إلى جنب مع الجسم المضاد المناعي) في المادة الطافية.
  • يمكن حل المادة الطافية في اللطخات الغربية اللاحقة. بدلاً من ذلك ، إذا كان البروتين الذي تريده يتجمع بسهولة عند تسخينه على درجة حرارة عالية في LSB ، قم بالتسخين بدلاً من ذلك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. واتبع نفس الخطوات المذكورة أعلاه. حل في الممرات الهلامية المتتالية والبقع الغربية ، 1) الكسر غير المجزأ ، 2) الكسر غير المنضم و 3) الكسر المناعي. مع الترسيب المناعي الناجح ، يجب أن تلاحظ إثراء البروتين الذي تريده ، جنبًا إلى جنب مع أي بروتينات مُجمَّعة بشكل مشترك في الكسر المناعي.

هـ- بروتوكول تجانس الأنسجة قبل التحلل المناعي بمنظف CHAPS

يجب إجراء هذه العملية على الجليد.

  • يطحن ما يقرب من 90 ميكروليتر من الأنسجة. ضع الأنسجة في أنبوب دائري دقيق للطرد المركزي سعة 1.5 مل.
  • أضف كوكتيلات مثبطات الفوسفاتاز والبروتياز العام إلى 500 ميكرولتر من تحلل CHAPS المثلج ومانع الترسيب المناعي
  • إضافة 500 UL CHAPS عازلة مع مثبطات للأنسجة المسحوقة.
  • قم بتجانس الأنسجة باستخدام أداة تجانس مدقة صغيرة باستخدام 15 ضربة ، 3 ثوان / ضربة على الجليد.
  • جهاز طرد مركزي 12000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية
  • إزالة المادة طافية (بدون طبقة دهنية) ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل آخر
  • الطرد المركزي مرة أخرى عند 12000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية
  • نقل طاف لأنبوب آخر. يحتوي الجزء الطاف على البروتينات المستخرجة التي يمكن استخدامها للترسيب المناعي.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  • لم يحدث الترسيب المناعي. الحل: 1) قد تضطر إلى تحديد الجسم المضاد بشكل تجريبي للترسيب المناعي الذي يتعرف على التشكل الأصلي للحلقة اللاصقة. 2) لا يتم الاحتفاظ بمركب البروتين خارج خلية حية سليمة. قد تكون هناك حاجة لإجراءات الربط المتبادل باستخدام كواشف غشاء نفاذية وخلايا حية لالتقاط التفاعل والتجميع بين البروتينات.
  • تهاجر السلسلة الثقيلة IgG من الجسم المضاد المناعي (الذي تم الاستغناء عنه في محلول الترسيب المناعي) في المواد الهلامية في نفس موضع البروتين محل الاهتمام ، وبالتالي يخفي مظهره في لطخة غربية. الحل: لتطوير اللطخة الغربية ، استخدم جسمًا مضادًا مشتقًا من مضيف حيواني يختلف عن الجسم المضاد المناعي. في هذه الحالة ، فإن الجسم المضاد الثانوي المناسب لـ HRP لن يرتبط بشكل ملحوظ بالجسم المضاد المناعي الذي تم نقله إلى البقعة الغربية ، مما يمنع ظهور شريط لطخة غربية متراكبة.

تخزين RIPA lysis buffer

قم بتخزين محلول RIPA Lysis buffer في الثلاجة (+2 درجة مئوية - 8 درجة مئوية) لفترات قصيرة نسبيًا (بضعة أسابيع).

في بعض الأحيان ، قد تتعجل المنظفات الموجودة في المخزن المؤقت لتحلل RIPA بمرور الوقت. إذا حدث هذا ، قم بتسخين المحلول (37 درجة مئوية) واخلطه لإذابة المكونات.

لفترات تخزين أطول ، قسّم وقم بتخزين المخزن المؤقت لتحلل RIPA في الفريزر (-20 درجة مئوية). قم بإذابة أجزاء صغيرة من الثلج باستخدام حرارة لطيفة (37 درجة مئوية) واخلط المكونات مرة أخرى في المحلول. لا تعيد التجميد بعد الذوبان.


شاهد الفيديو: البروتين اصلي ولامضروب.!! (ديسمبر 2022).