معلومة

صلاحية قياسات التنفس في الميتوكوندريا المعزولة

صلاحية قياسات التنفس في الميتوكوندريا المعزولة


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد قرأت مؤخرًا ورقتين عن التمارين الرياضية والميتوكوندريا ، حيث يتم تقييم معدلات التنفس في الحالة 4 والحالة 3 وإنتاج ROS في المختبر بعد إجراء التمرين (على سبيل المثال ، يتم عزل ميتوكوندريا قلب الفئران).


سؤال:

بالنظر إلى أن الأمر يستغرق ساعة واحدة لإزالة الميتوكوندريا من الحيوان وعزلها ، تتم إضافة هذه الركيزة الإضافية (المشبعة) قبل قياس معايير التنفس ، وأن الوسط مشبع بتركيز الأكسجين المحيط (أعلى بكثير من الجسم الحي) ، هل هذا النوع من التجارب صالح لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي في الحيوانات النشطة؟ آراء و / أو مؤشرات إلى الموارد التي توضح مدى فائدة هذه القياسات.


تقييم التنفس مع القطب الكهربي من نوع كلارك في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا الحيوانية المنفذة للنفاذ.

في العديد من الدراسات ، يعد تقييم وظيفة الميتوكوندريا أمرًا بالغ الأهمية لفهم كيف تغير ظروف المرض أو الكائنات الحية الدقيقة وظيفة الميتوكوندريا. واحدة من النقاط النهائية الكلاسيكية التي يمكن تقييمها هي استهلاك الأكسجين ، والذي يمكن إجراؤه في ظل ظروف خاضعة للرقابة ومصطنعة. الأكسجين هو المستقبل النهائي في سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، أي في إنزيم يسمى السيتوكروم أوكسيديز ، والذي ينتج الماء في العملية ويضخ البروتونات من المصفوفة إلى الفضاء بين الغشاء. تتوفر العديد من التقنيات لقياس استهلاك الأكسجين ، بما في ذلك التصوير المقطعي باستخدام أقطاب الأكسجين أو مجسات الفلورسنت / الإنارة. سيتناول الفصل الحالي تحديد استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا عن طريق القطب الكهربي من نوع كلارك ، والذي استخدم على نطاق واسع في الأدبيات ولا يزال أسلوبًا موثوقًا به. نحن نركز وصفنا التقني في قياس استهلاك الأكسجين بواسطة كسور الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المنفصلة.

الكلمات الدالة: نسبة ADP / O التنفس الخلوي قطب كلارك من نوع ميتوكوندريا سلسلة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا معدل استهلاك الأكسجين الخلايا المنفصلة نسبة التحكم في الجهاز التنفسي Respirosome.


الملخص

ربما يكون تقييم نشاط الميتوكوندريا القلبية هو أفضل طريقة لتقدير الضرر الخلوي المبكر في علم الأمراض المزمن. يسمح التشخيص المبكر بالتدخل العلاجي السريع وبالتالي زيادة معدل بقاء المريض في عدد من الأمراض. ومع ذلك ، فإن البيانات المتعلقة بالميتوكوندريا القلبية البشرية نادرة في الأدبيات الدولية. هنا ، نصف طريقة لاستخراج ودراسة الميتوكوندريا الوظيفية من قسامات الأذين الأيمن الصغيرة الحجم (400 مجم كحد أدنى) التي تم الحصول عليها أثناء الدورة الدموية خارج الجسم وعادة ما تعتبر نفايات جراحية. تمت تنقية الميتوكوندريا من خلال عدة عمليات ميكانيكية (قطع دقيق لعضلة القلب ، وطحن الأنسجة ، وتجانس الفخار Elvehjem) ، وعمل الإنزيم التحلل للبروتين (subtilisin) والطرد المركزي التفاضلي. في الأمراض المزمنة ، بما في ذلك السمنة ، يمكن أن تحدث اضطرابات مبكرة في وظيفة الميتوكوندريا. آثار السمنة على معدل استهلاك الأوكسجين في الميتوكوندريا و H2ا2 وهكذا تم تحديد الإطلاق بثلاث ركائز مختلفة (الجلوتامات / مالات ، سكسينات / روتينون ، بالميتويل كارنيتين / مالات). كانت الميتوكوندريا الأذينية البشرية ذات جودة عالية من وجهة نظر وظيفية ، مقارنة مع عضيات بطين الجرذ ، لكن إنتاجية استخراج الميتوكوندريا البشرية كانت أقل مرتين من تلك الخاصة بالميتوكوندريا الجرذان. أظهرت الاختبارات أن التنفس المحفز بالجلوتامات / المالات المرتبط بـ ADP قد زاد بشدة في الأشخاص الذين يعانون من السمنة المفرطة ، على الرغم من أن أكسدة الركيزتين الأخريين لم تتأثر. كان إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بواسطة الميتوكوندريا المعزولة منخفضًا مقارنةً بإنتاج الأشخاص النحيفين. تؤكد هذه النتائج تلك الموجودة في إحدى دراساتنا السابقة في بطينات الفئران التي تغذت على نظام غذائي غني بالدهون. في الختام ، الطريقة الموصوفة بسيطة وموثوقة وحساسة. يسمح لوصف تأثير السمنة على وظيفة الميتوكوندريا الأذينية أثناء استخدام عينة صغيرة فقط من المريض (ن = 5 في كل من المجموعات الخالية من الدهون والسمنة).


نتائج ومناقشة

حدد البروتوكول الموصوف هنا بنجاح معدل تنفس الميتوكوندريا لأنسجة الخياشيم المنفصلة من الأسماك (الجدول 1 ، الشكل 2A). أظهر ملف التنفس الذي تم الحصول عليه باستخدام هذه التقنية زيادات في O2 معدل الاستهلاك في كل خطوة عندما تمت إضافة ركائز البيروفات والمالات والغلوتامات والسكسينات بالتتابع لتحفيز مكونات سلسلة نقل الإلكترون ، واستجابت بطريقة متوقعة لمثبطات مجمع الميتوكوندريا المعروفة oligomycin و antimycin A (الشكل 2 أ). إضافة السيتوكروم ج أدى إلى زيادة نسبة مئوية صغيرة فقط في معدل التنفس (الجدول 1) ، مما يؤكد أن المستحضرات كانت عالية الجودة. بالمقارنة مع الأنسجة الخيشومية شبه المعزولة والمتجانسة Dounce (Braz-Mota et al. ، 2018) ، يُظهر تحضيرنا قيم RCR أكبر (7.4 مقابل 2.6-5.5) ، مما يؤكد أيضًا الجودة العالية لمستحضرات الميتوكوندريا باستخدام هذه التقنية ( الجدول 1). من المثير للاهتمام ملاحظة أن قيم التنفس لدينا أقل من تلك التي أبلغ عنها Braz-Mota et al. (2018) ، على الرغم من أن هذا متوقع وقد تم عرضه في الدراسات التي تقارن الاستعدادات المختلفة للميتوكوندريا في الأصناف الأخرى (Saks et al. ، 1998 Picard et al. ، 2011 Mahalingam et al. ، 2017). تم تطبيع معدلات تنفس الميتوكوندريا بشكل كلاسيكي باستخدام علامات حجم الميتوكوندريا ، بما في ذلك نشاط CS و COX (Barrientos ، 2002 Larsen et al. ، 2012 Dawson et al. ، 2018) ، وأظهرت معدلات التنفس في الميتوكوندريا علاقة خطية ممتازة (ص=0.011, ص 2 = 0.689 الشكل 2 ب) مع نشاط CS ، مما يشير إلى أن قياساتنا كانت نتيجة لاستهلاك الأكسجين القائم على الميتوكوندريا. يتماشى هذا مع التجارب السابقة التي أظهرت ارتباطًا قويًا بين محتوى الميتوكوندريا ونشاط CS (Larsen et al. ، 2012). بينما Larsen et al. (2012) وجد أيضًا علاقة خطية بين محتوى الميتوكوندريا ونشاط كوكس ، كانت هذه العلاقة غير مهمة بشكل هامشي في دراستنا (ص=0.079, ص 2 = 0.426 الشكل 2 ج) ، لكن حجم عينة صغير (ن= 8) يعني أن القوة الإحصائية كانت منخفضة. نظرًا لسهولة القياس الأكبر والعلاقة الأقوى مع معدل التنفس ، نقترح أن CS هي طريقة أكثر ملاءمة ويمكن الوصول إليها لتطبيع معدلات تنفس الميتوكوندريا الخيشومية.

معلمات الميتوكوندريا من القياسات المكررة للخياشيم النفاذة في التراوت البني


الملخص

قد تقوم الثدييات السباتية بقمع معدل الأيض الأساسي أثناء السبات بنسبة تصل إلى 95٪ لتقليل إنفاق الطاقة خلال فصل الشتاء ، لكن الآليات الأساسية لا تزال غير مفهومة جيدًا. هنا نظهر أن كبريتيد الهيدروجين (H2S) ، وهو جزيء إشارات منتشر في كل مكان ، وهو مثبط قوي لتنفس الميتوكوندريا الكبدية المعزولة من السناجب الأرضية المبطنة بـ13 طوربيد ، ولكن له تأثير ضعيف على الميتوكوندريا المعزولة خلال الصيف وإيقاظ السبات ، حيث يكون معدل الأيض طبيعيًا. بما يتفق مع هؤلاء في المختبر الآثار ، نجد اختلافات موسمية قوية من في الجسم الحي مستويات H.2S في البلازما ويزيد من H2مستويات S في كبد السناجب أثناء السبات مقارنة بالمستويات أثناء الإثارة والصيف. ال في الجسم الحي تغييرات الكبد H.2تتوافق مستويات S مع النشاط المنخفض للميتوكوندريا H2S إنزيم مؤكسد كبريتيد: كينون أوكسيريدوكتاز (SQR) أثناء السبات. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أنه أثناء السبات ، H2يتراكم S في الكبد بسبب انخفاض نشاط SQR ويساهم في تثبيط تنفس الميتوكوندريا ، بينما أثناء الاستيقاظ والصيف تنعكس هذه التأثيرات ، H2يتحلل S عن طريق SQR النشط وزيادة معدلات تنفس الميتوكوندريا. تقدم هذه الدراسة رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء سبات الثدييات ، مشيرة إلى SQR باعتباره إنزيمًا رئيسيًا يشارك في التحكم في وظيفة الميتوكوندريا.


4. مناقشة

يعد الاختيار المناسب للبقع لاستخدامها في لوحات قياس التدفق الخلوي التي تقيس وظيفة الميتوكوندريا أمرًا حاسمًا في جهود الجميع لتوفير بيانات هادفة وثاقبة. تؤكد بياناتنا أن MTG و NAO تتم ترجمتهما إلى الميتوكوندريا بشكل مستقل عن & # x00394 & # x003a8م. ومع ذلك ، لا توفر MTG قياسات دقيقة لكتلة الميتوكوندريا تحت جميع الظروف. في دراساتنا الخلوية بأكملها ، لاحظنا وجود علاقة مع MTG MFI وعلاماتنا للإجهاد التأكسدي الخلوي والميتوكوندريا. من المحتمل أن يعمل MTG كركيزة لتقليل بروتينات الميتوكوندريا المؤكسدة ، مثل بيروكسيريدوكسين أو ثيوردوكسين أو جلوتاريدوكسين ، ويمكن أن تكون الزيادة في مضان MTG التي نكتشفها ناتجة عن إحدى آليتين: (1) أكسدة السيستين في الميتوكوندريا البروتينات أو (2) ROS الناتجة عن سلسلة نقل الإلكترون (ETC). يمكن أن تكون هذه الآليات تفسيرات محتملة لسبب قيام الآخرين بالإبلاغ عن زيادة إشارة MTG بعد تغيير وظيفة الميتوكوندريا ، بغض النظر عما إذا كان المركب قد عزز أو تبدد & # x00394 & # x003a8م [5]. العديد من هذه العلاجات تغير أيضًا بيئة الأكسدة والاختزال وقد تؤثر على تألق MTG. أظهرت بياناتنا أن العلاج الوحيد الذي لم ينتج عنه تغيير كبير في كتلة الميتوكوندريا بواسطة MTG كان العامل المختزل NAC. تسبب علاج NAC في حدوث تغييرات طفيفة في مستويات ROS و RNS في الميتوكوندريا بعد ساعتين (الشكل 1 أ). أظهر تلطيخ الميتوكوندريا في الخلايا الكاملة بـ NAO ، الذي يرتبط بالكارديوليبين ، انخفاضًا في التألق في العينات المعالجة بـ NO. بينما لم يلاحظ أي أهمية من خلال تحليل الارتباط الخاص بنا ، أظهر كل من DAF-FM و DHR (علامات لـ NO و RNS) اتجاهًا سلبيًا. ربما يكون هذا بسبب أكسدة كارديوليبين بواسطة البيروكسينيتريت [8] مما أدى إلى تقليل مواقع الارتباط لـ NAO.

عندما قمنا بعزل الميتوكوندريا بعد العلاج ، لم نلاحظ أي تغيير في كتلة الميتوكوندريا بواسطة FSC ، على الرغم من التغيرات الكبيرة في الكتلة من تلطيخ MTG للخلايا الكاملة. يمكن أن يكون نقص التغيير في الكتلة بواسطة FSC ولكن زيادة تلطيخ MTG نتيجة للتكوين الحيوي المعزز للميتوكوندريا إلى جانب انشطار الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن عدم وجود تغيير قابل للقياس في مستويات بروتين الميتوكوندريا عن طريق النشاف الغربي يشير إلى أن هذا ليس هو الحال. عندما نقارن أيضًا قياسات كتلة الميتوكوندريا الخاصة بنا في الخلايا الكاملة بنتائج لطخة غربية ، نلاحظ أن قياسات كتلة NAO تشبه إلى حد كبير التغييرات التي لوحظت في مستويات البروتين بواسطة النشاف الغربي ، مما يوفر دليلًا على أن NAO هو علامة كتلة أكثر دقة من MTG.

بينما أظهر تحليل الخلايا الكاملة تغيرات جذرية في مضان MTG ، كان للميتوكوندريا المعزولة تغييرات أكبر في إشارة NAO. يشير هذا إلى أن NAO ، على الرغم من نفاذية الخلية ، لا يتفاعل بنفس الطريقة في الخلايا الكاملة كما هو الحال في الميتوكوندريا المعزولة ، أو أن كارديوليبين قد يصبح أكثر تعرضًا نتيجة لبروتوكول العزل الخاص بنا. يجب أن تؤخذ هذه التناقضات في الاعتبار عند اختيار صبغة كتلة الميتوكوندريا للدراسات.

حدد تحليل التدفق الخلوي الخاص بنا للميتوكوندريا المعزولة مجموعتين فرعيتين كانتا ملطختين بشدة بكل من MTG و NAO ولكن كان لديها إشارة TMRM قليلة. كانت هاتان المجموعتان متسقتان في موقعهما داخل المؤامرات المبعثرة للأمام مقابل الجانب بين كل مجموعة معالجة (الشكل 2). قد تكون هاتان المجموعتان من الميتوكوندريا من مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا داخل PBL المعزولة. مع أنواع الخلايا المختلفة التي لها متطلبات حمل عمل مختلفة ، سيكون هيكل الميتوكوندريا في كل مجموعة فرعية مختلفًا وقد يفسر سبب رؤيتنا لهذه المجموعات المتميزة. قد يساعد استخدام مجموعات الخلايا المعزولة من PBL في توضيح مصدر هذه المجموعات السكانية.

تم قياس انخفاض كبير في مستويات البروتين NDUFS3 بواسطة لطخة غربية بعد 15 دقيقة من العلاج باستخدام 3 ملي مولار من NAC. لم يكن هذا الانخفاض موجودًا في عيناتنا المعالجة لمدة ساعتين. مع عدم وجود اختلاف في مستوى بروتين غشاء الميتوكوندريا الخارجي VDAC ، أو بروتين غشاء الميتوكوندريا الداخلي ANT بعد العلاج بـ NAC ، نقترح أنه قد يكون هناك تفاعل محدد بين NAC والمركب I. نظرًا لأننا وصفنا سابقًا التنفس المعقد الأول تم تثبيطه بشكل مباشر بواسطة NAC [9] ، يمكن أن يكون هذا الانخفاض نتيجة لتثبيط NAC للمركب I. وإحدى الآليات المحتملة التي قد تحدث من خلالها هي قدرة NAC على تعطيل روابط ثاني كبريتيد [10] ، مما يؤدي إلى فقدان بعض البروتين المعقد الأول. هناك حاجة إلى مزيد من العمل لاستكشاف هذه الفرضية.

في هذه الدراسة ، قدمنا ​​دليلًا على أن MTG لا تقيس بدقة كتلة الميتوكوندريا تحت جميع الظروف وأن هذا لا يرجع إلى التغييرات في & # x00394 & # x003a8م، بل هو نتيجة تغير الإجهاد التأكسدي والنتروس. بينما قد يكون كل من MTG و NAO علامات جيدة لكتلة الميتوكوندريا في ظل الظروف الفسيولوجية ، فإننا نعتقد أنه من الأهمية بمكان فهم حالة ROS و RNS للميتوكوندريا قبل استخدام أي من هذه الأصباغ لتحديد كتلة الميتوكوندريا عن طريق قياس التدفق الخلوي.


نتائج

التحقق من صحة إجراء الفحص الطيفي

لا يوجد بروتين حديدي يمكن اكتشافه يتشكل في وجود ديسموتاز الفائق والكتلاز. أعطت تجارب التحكم نتائج متطابقة سواء تم تحريك محتويات الكوفيت بالكامل أم لا مع عدم استخدام الطور الغازي في هذه التجارب الضابطة. وفقًا لذلك ، لم يتم تحريك محتويات كفيت Thunberg في التجارب المذكورة هنا. تبادل المواد بين الطور الغازي والمحلول المائي في الجزء السفلي من الكوفيت ، حيث يمر شعاع الضوء ، يكون بطيئًا للغاية. تشير تجارب التحكم إلى أنه قد يتم إهمالها في هذه التجارب الموجزة. تستقر الميتوكوندريا ببطء ، بحيث يكون الرقم الذي يدخل ويخرج من مسار الضوء هو نفسه ، ولا تتغير كثافة الميتوكوندريا في مسار الضوء أثناء هذه التجارب القصيرة نسبيًا.

تختلف شروط المقايسة الطيفية لاستهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا اختلافًا جذريًا عن تلك الخاصة بمقايسة الاستقطاب المألوف. كثافة الميتوكوندريا هي ما يقرب من 100 ضعف تركيز ADP أكبر يتراوح من 4 إلى 50 ضعفًا خلال مسار تحديد ضغط الأكسجين أقل بشكل ملحوظ من تلك المستخدمة في اختبار الاستقطاب. تم تصميم تجربة ، معروضة في الشكل 1 ، لإظهار أن معلمات وظيفة الميتوكوندريا لم تتغير كثيرًا. تشير الفواصل الحادة في معدل امتصاص الأكسجين ، حيث يُحسب استنفاد ADP ، إلى اقتران وثيق بين امتصاص الأكسجين واستخدام ADP. الأنشطة المحددة الأولية هي 200 مول O2 (مول السيتوكروم أأ3) –1 دقيقة -1. نسب P / O هي: 2.3 و 2.4 و 2.4 بتركيزات أولية من ADP تبلغ 500 و 1000 و 2000 ميكرولتر لتر -1 ، على التوالي ، مع مؤشرات التحكم في التنفس 3.1-3.4. هذه قابلة للمقارنة مع تلك الموجودة في اختبار الاستقطاب: نسبة P / O 2.4 ، مع RCI & gt6 (ن= 24). يوضح هذا أن امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا ، الذي تم قياسه في هذا الاختبار ، مقترن بإحكام باستخدام ADP ويتقدم بمعدلات تتناسب مع امتصاص الأكسجين في الحالة الثالثة المقاس من الناحية القطبية.

يتم تحديد استهلاك الأكسجين الذي تم الإبلاغ عنه بواسطة إزالة الأكسجين من الميوجلوبين الذي تم رصده عند 625 نانومتر في معلقات الميتوكوندريا التي تحتوي على الميوغلوبين وكميات محدودة من ADP. تم استنفاد ADP عند الأسهم. ميوغلوبين ، 500 ميكرولتر لتر -1. أ ، 500 ميكرولتر لتر -1 ADP B ، 1000 ميكرولتر لتر -1 ADP C ، 2000 ميكرولتر لتر -1 ADP. المعدلات الأولية هي 200 مول O2 (مول السيتوكروم أأ3) –1 دقيقة -1. نسب P / O هي: 2.3 و 2.4 و 2.4 على التوالي ، مع مؤشرات التحكم في الجهاز التنفسي من 3.1-3.4. كانت نسبة P / O لهذا التحضير للميتوكوندريا ، التي تم تحديدها من خلال الاستقطاب ، 2.4 باستخدام RCI & gt6. يوضح هذا أن امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا مرتبط بإحكام بالفسفرة عندما تستهلك الميتوكوندريا الأكسجين المرتبط بالميوجلوبين. وحدات الامتصاص.

يتم تحديد استهلاك الأكسجين الذي تم الإبلاغ عنه بواسطة إزالة الأكسجين من الميوجلوبين الذي تم رصده عند 625 نانومتر في معلقات الميتوكوندريا التي تحتوي على الميوغلوبين وكميات محدودة من ADP. تم استنفاد ADP عند الأسهم. ميوغلوبين ، 500 ميكرولتر لتر -1. أ ، 500 ميكرولتر لتر -1 ADP B ، 1000 ميكرولتر لتر -1 ADP C ، 2000 ميكرولتر لتر -1 ADP. المعدلات الأولية هي 200 مول O2 (مول السيتوكروم أأ3) –1 دقيقة -1. نسب P / O هي: 2.3 و 2.4 و 2.4 على التوالي ، مع مؤشرات التحكم في الجهاز التنفسي من 3.1-3.4. كانت نسبة P / O لهذا التحضير للميتوكوندريا ، التي تم تحديدها من خلال الاستقطاب ، 2.4 باستخدام RCI & gt6. يوضح هذا أن امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا مرتبط بإحكام بالفسفرة عندما تستهلك الميتوكوندريا الأكسجين المرتبط بالميوجلوبين. وحدات الامتصاص.

لا يتفاعل الميوغلوبين مع سطح الميتوكوندريا

يتم تغيير معدل امتصاص الأكسجين المقاس استقطابياً عن طريق تعليق ميتوكوندريا قلب الحمام قليلاً فقط بإضافة 500 ميكرولتر لتر -1 أوكسيوجلوبين ، وهو تركيز أكبر من ذلك في بطين الحمام ، ما يقرب من 200 ميكرولتر كجم -1 نسيج كتلة رطب (شودر و Wittenberg، 1979) ، الشكل 2. وبالمثل ، لم تتأثر نسبة P / O بوجود 500 ميكرولتر من الميوغلوبين. كما نوقش أدناه ، دعم كل من الهيموجلوبينات الستة المختلفة جذريًا المستخدمة في هذه التجارب امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا إلى نفس المدى تقريبًا ، الجدول 1 والجدول 2.

ألفة الأكسجين وثوابت التوازن لبروتين الهيم الأحادي المستخدم

. ص1/2 . . ثابت الجمع (مول لتر -1 ث -1 × 10 -6). ثابت التفكك (ق -1).
بروتين هيم. (كيلو باسكال). (مم زئبق). . .
Busycon ميغابايت أ 0.11 0.81 48 71
حصان ميغابايت ب 0.056 0.43 14 11
Lucina Hb I c 0.044 0.34 100 61
Lucina Hb II ج 0.021 0.16 0.39 0.11
فول الصويا رطل ج1 د 0.003 0.021 124 4.9
Gasterophilus Hb e 0.009 0.067 10 1.2
. ص1/2 . . ثابت الجمع (مول لتر -1 ث -1 × 10 -6). ثابت التفكك (ق -1).
بروتين هيم. (كيلو باسكال). (مم زئبق). . .
Busycon ميغابايت أ 0.11 0.81 48 71
حصان ميغابايت ب 0.056 0.43 14 11
Lucina Hb I c 0.044 0.34 100 61
Lucina Hb II ج 0.021 0.16 0.39 0.11
فول الصويا رطل ج1 د 0.003 0.021 124 4.9
Gasterophilus Hb e 0.009 0.067 10 1.2

الهيموغلوبين ، الهيموغلوبين ، الميوغلوبين Lb ، الليغيموغلوبين. الثوابت الحركية من: a Busycon Mb (Schreiber and Parkhurst، 1984) b Horse Mb (Schenkman et al.، 1997) c Lucina Hb I and Hb II (Kraus and Wittenberg، 1990) d Leghemoglobin ج(مارتن وآخرون ، 1990) e Gasterophilus Hb (Phelps et al. ، 1972).

ضغط الأكسجين والتشبع الجزئي لبروتينات الهيم عند امتصاص الأكسجين نصف الأقصى للحالة الثالثة من الميتوكوندريا القلبية المعزولة

. التشبع الجزئي. ضغط الأكسجين. .
بروتين هيم. (%) . (كيلو باسكال). (مم زئبق).
بوسيكون ميغابايت 3.9 0.0047 0.035
حصان ميغابايت 4.7 0.0094 0.071
لوسينا هب أنا 9.1 0.0024 0.018
لوسينا هب الثاني 24 0.0067 0.050
فول الصويا رطل ج41 0.0067 0.050
Gasterophilus Hb 31 0.0015 0.011
يقصد 0.0052 0.040
. التشبع الجزئي. ضغط الأكسجين. .
بروتين هيم. (%) . (كيلو باسكال). (مم زئبق).
بوسيكون ميغابايت 3.9 0.0047 0.035
حصان ميغابايت 4.7 0.0094 0.071
لوسينا هب أنا 9.1 0.0024 0.018
لوسينا هب الثاني 24 0.0067 0.050
فول الصويا رطل ج41 0.0067 0.050
جاستروفيلوس هب 31 0.0015 0.011
يقصد 0.0052 0.040

الهيموغلوبين ، الهيموغلوبين ، الميوغلوبين Lb ، الليغيموغلوبين.

تقدم عملية إزالة الأكسجين من الهيموجلوبين أثناء التجربة

تستكشف هذه التجارب ضغوط الأكسجين المنخفضة مقارنة بضغط الأكسجين الساركوبلازمي ، حيث يكون امتصاص الأكسجين مقيدًا بتوافر الأكسجين في غياب الهيموغلوبين أو الميوغلوبين. تقدم التجارب التي يتم فيها إزالة الأكسجين من الميوغلوبين (P.50= 0.09 كيلو باسكال ∼0.7 مم زئبق) أو ليغيموغلوبين ج50= 0.009 kPa 0.07 mmHg) تشير إلى أن امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا معروض في الشكل 3. والإحداثيات تشير إلى أكسجة الهيموجلوبين. في البداية ، يوجد الأكسجين بكميات زائدة صغيرة ، حيث يتأكسج الهيموجلوبين بشكل كبير أو كامل ، وتنحني الآثار إلى أسفل مع تنفس الميتوكوندريا على احتياطيات كل من الأكسجين المذاب والمرتبط بالهيموغلوبين. بعد ذلك ، يصبح مخزن الأكسجين المذاب صغيرًا بالنسبة إلى مخزن الأكسجين المرتبط بالهيموغلوبين ، ويؤدي التوازن بين أوكسي هيموغلوبين والأكسجين الحر إلى تقليل معدل تغير ضغط الأكسجين ، وتقترب الآثار من الخطية. يبلغ معدل إزالة الأكسجين من الهيموغلوبين الآن عن معدل شبه مستقر لاستهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا المدعوم بالهيموغلوبين. يتم الإبلاغ عن ضغط الأكسجين عند معدل نصف الحد الأقصى لامتصاص الأكسجين من خلال النقاط التي يكون فيها معدل تغير إزالة الأكسجين من الهيموغلوبين نصف ذلك خلال الجزء شبه الخطي السابق من منحنى التقدم ، المشار إليه بواسطة الأسهم في الشكل 3.. يختلف منحني التقدم. يحدث التنفس نصف الأقصى في وجود ليغيموغلوبين عالي التقارب عندما يكون البروتين 57٪ ، مع أكسجين أنه في وجود أقل تقارب الميوغلوبين يحدث عندما يكون البروتين 94٪ غير مؤكسج. وفقًا لذلك ، فإن وظيفة الميتوكوندريا مستقلة عن طبيعة الهيموجلوبين الداعم وتشبعه الجزئي بالأكسجين.

تم الإبلاغ عن ضغط الأكسجين في تعليق الميتوكوندريا من خلال الاستقطاب كدالة للوقت (1 تور = 0.133 كيلو باسكال). تتم إضافة ADP (500 نانومول) في الأسهم. أ ، الميوغلوبين الغائب B ، 500 ميكرولتر لتر -1 أوكسي ميوجلوبين. متوسط ​​امتصاص الأكسجين في وجود ADP مناسب هو 193 و 157 مول O2 (مول السيتوكروم أأ3) -1 دقيقة -1 في غياب ووجود الميوجلوبين ، على التوالي. نسب P / O هي 2.21 و 2.20. يتجاوز تركيز الميوجلوبين المستخدم هنا متوسط ​​الحجم المتوسط ​​التركيز في قلب الحمام ، 209 ميكرولتر لتر -1 (شودر وآخرون ، 1979). تظهر هذه النتائج أن الميوجلوبين في المحلول لا يؤثر على معايير الجهاز التنفسي للميتوكوندريا المعزولة.

تم الإبلاغ عن ضغط الأكسجين في تعليق الميتوكوندريا من خلال الاستقطاب كدالة للوقت (1 تور = 0.133 كيلو باسكال). تتم إضافة ADP (500 نانومول) في الأسهم. أ ، الميوغلوبين الغائب ب ، 500 ميكرولتر لتر -1 أوكسي ميوجلوبين. متوسط ​​امتصاص الأكسجين في وجود ADP مناسب هو 193 و 157 مول O2 (مول السيتوكروم أأ3) -1 دقيقة -1 في غياب ووجود الميوجلوبين ، على التوالي. نسب P / O هي 2.21 و 2.20. يتجاوز تركيز الميوجلوبين المستخدم هنا متوسط ​​الحجم المتوسط ​​التركيز في قلب الحمام ، 209 ميكرولتر لتر -1 (شودر وآخرون ، 1979). تظهر هذه النتائج أن الميوجلوبين في المحلول لا يؤثر على معايير الجهاز التنفسي للميتوكوندريا المعزولة.

ضغط الأكسجين بمعدل نصف الحد الأقصى لامتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا

يتم عرض ضغوط الأكسجين التي تم الحصول عليها عند امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا بنصف الحد الأقصى ، مدعومًا بستة هيموغلوبينات ذات ثوابت حركية وتوازن مختلفة جدًا في تفاعلاتها مع الأكسجين (الجدول 1) ، في الجدول 2. ومن الواضح أن نفس ضغط الأكسجين تقريبًا (النطاق) 0.0015–0.0095 كيلوباسكال 0.011–0.071 ملم زئبق. متوسط صا2= 0.005 كيلوباسكال 0.040 مم زئبق) عند توصيل الأكسجين نصف الأقصى لكل من الهيموجلوبين. لا يوجد ارتباط لمعدل نصف الحد الأقصى مع تقارب البروتينات بالأكسجين ولا مع ثوابت التوليف أو معدل التفكك. القيم الواردة في الجدول 2 قابلة للمقارنة تقريبًا مع صا2 للتنفس نصف الأقصى للميتوكوندريا المعزولة من مجموعة متنوعة من المصادر ، ما يسمى كم للأكسجين (راجعه ويلسون وآخرون ، 1988). حتى أعلى قيمة (≈0.01 kPa ∼0.10 mmHg) ، التي تمت مواجهتها في الميتوكوندريا حيث تضاعف نشاط معين تقريبًا ، تقع ضمن غلاف القيم المبلغ عنها لـ كم.

امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا كدالة لتركيز الهيموجلوبين

يتعزز امتصاص الميتوكوندريا للأكسجين في وجود الميوجلوبين. قمنا بفحص العلاقة بين تركيز الميوجلوبين وهذا التعزيز. يزيد معدل امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا ، المقاس بميل الجزء شبه الخطي من منحنى التقدم (الشكل 3) ، بشكل رتيب مع تركيز الهيموجلوبين للوصول إلى هضبة يكون فيها امتصاص الأكسجين مستقلاً عن تركيز الهيموجلوبين (الشكل 4). الوظائف المعروضة في الشكل 4 هي نفسها بالنسبة إلى ليغيموغلوبين ، ميوغلوبين وبوسيكون ميوغلوبين (البيانات غير معروضة) ، وهي بروتينات تختلف بمقدار 10 أضعاف في حركية وتوازن تفاعلاتها مع الأكسجين (الجدول 1). يعتبر امتصاص الأكسجين أيضًا مستقلاً عن درجة تشبع الأكسجين بالهيموجلوبين ضمن النطاق الخطي للتجارب الواردة في الشكل 3. تؤكد هذه النتائج الاستنتاج القائل بأن امتصاص الأكسجين المعتمد على الهيموجلوبين لا ينطوي على تفاعل الهيموجلوبين مع سطح الميتوكوندريا. لا تختلف المعدلات القصوى لامتصاص الأكسجين الناتج عن الهيموغلوبين اختلافًا كبيرًا عن معدلات امتصاص الأكسجين في الحالة الثالثة التي تم تحديدها من خلال الاستقطاب في غياب الهيموغلوبين. نستنتج أن أوكسي هيموغلوبينات المضافة لا تغير النشاط الخاص بالميتوكوندريا. وبدلاً من ذلك ، فإنها تخفف القيود المفروضة على امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا والتي تفرضها محدودية توافر الأكسجين المذاب في درجات حرارة منخفضة. صا2.

إزالة الأكسجين من الميوغلوبين والليغيموغلوبين كوظائف زمنية في معلقات الميتوكوندريا المحتوية على الهيموغلوبين. في البداية يتم أكسجة الهيموجلوبين بالكامل. إزالة الأكسجين معطلة. (أ) ميوغلوبين ، 50 ميكرولتر لتر -1 ميتوكوندريا (مثل السيتوكروم أأ3) 170 nmol l –1 ، مسار ضوء 10 ملم. (أ ، داخلي) ميوغلوبين 500 ميكرولتر لتر -1 ميتوكوندريا (مثل السيتوكروم أأ3) 700 nmol l –1 ، مسار الضوء 2 مم. (ب) ليغيموغلوبين ج، 50 ميكرولتر لتر -1 ميتوكوندريا (مثل السيتوكروم أأ3) 65 nmol l –1 ، مسار ضوء 10 ملم. يتم رسم الخطوط المكسورة في مماس للأجزاء الخطية تقريبًا من المنحنيات. تشير الأسهم إلى النقاط التي تكون فيها معدلات امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا نصف ذلك خلال الجزء شبه الخطي من منحنيات التقدم. إن امتصاص الأكسجين في الحالة شبه المستقرة المحسوبة من منحدرات الخطوط المكسورة هو 204 و 358 مول O2 (مول السيتوكروم أأ3) -1 دقيقة -1 للميوجلوبين والليغيموجلوبين ، على التوالي. وجد أن ضغط الأكسجين عند امتصاص الأكسجين بنصف الحد الأقصى هو نفسه بالنسبة لبروتينين تختلف الصلات بينهما بمقدار 10 أضعاف (انظر الجدول 2). هذا يدل على أن صا2 بالنسبة لامتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا نصف الحد الأقصى لا علاقة له بتقارب الأكسجين للبروتين الدموي الذي يزود الأكسجين. وحدات الامتصاص.

إزالة الأكسجين من الميوغلوبين والليغيموغلوبين كوظائف زمنية في معلقات الميتوكوندريا المحتوية على الهيموغلوبين. في البداية يتم أكسجة الهيموجلوبين بالكامل. إزالة الأكسجين معطلة. (أ) ميوغلوبين ، 50 ميكرولتر لتر -1 ميتوكوندريا (مثل السيتوكروم أأ3) 170 nmol l –1 ، مسار ضوء 10 ملم. (أ ، داخلي) ميوغلوبين 500 ميكرولتر لتر -1 ميتوكوندريا (مثل السيتوكروم أأ3) 700 nmol l –1 ، مسار الضوء 2 مم. (ب) ليغيموغلوبين ج، 50 ميكرولتر لتر -1 ميتوكوندريا (مثل السيتوكروم أأ3) 65 nmol l –1 ، مسار ضوء 10 ملم. يتم رسم الخطوط المكسورة في مماس للأجزاء الخطية تقريبًا من المنحنيات. تشير الأسهم إلى النقاط التي تكون فيها معدلات امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا نصف ذلك خلال الجزء شبه الخطي من منحنيات التقدم. إن امتصاص الأكسجين في الحالة شبه المستقرة المحسوبة من منحدرات الخطوط المكسورة هو 204 و 358 مول O2 (مول السيتوكروم أأ3) -1 دقيقة -1 للميوجلوبين والليغيموجلوبين ، على التوالي. وجد أن ضغط الأكسجين عند امتصاص الأكسجين بنصف الحد الأقصى هو نفسه بالنسبة لبروتينين تختلف الصلات بينهما بمقدار 10 أضعاف (انظر الجدول 2). هذا يدل على أن صا2 بالنسبة لامتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا نصف الحد الأقصى لا علاقة له بتقارب الأكسجين للبروتين الدموي الذي يزود الأكسجين. وحدات الامتصاص.

آثار زيادة النشاط النوعي للميتوكوندريا

تتكيف الميتوكوندريا في القلب والعضلات الهيكلية الحمراء مع معدل الفسفرة المؤكسدة لتلبي تغيرات كبيرة جدًا ، على سبيل المثال 10 أضعاف أو أكثر ، في حالة عمل العضلات المستقرة. وفقًا لذلك ، من المهم التحقيق في استجابة توصيل الأكسجين المعتمد على الميوغلوبين للتغيير في النشاط المحدد للميتوكوندريا. مضاعفة النشاط الخاص بالميتوكوندريا تقريبًا يضاعف الحد الأقصى لمعدل امتصاص الأكسجين عند الهضبة وأكثر من ضعف ضغط الأكسجين المطلوب لتحقيق معدل نصف الحد الأقصى إلى قيمة ∼0.01 كيلو باسكال (∼0.10 مم زئبق) (الشكل 5). تركيز الميوغلوبين (حوالي 300 ميكرولتر لتر -1) المطلوب للحفاظ على معدل التنفس الكامل أكبر بخمسة أضعاف من المطلوب بمعدلات أقل ، ويمكن مقارنته بتركيز الميوغلوبين متوسط ​​الحجم في بطين الحمام ، 209 ميكرو مول كلغ - 1 كتلة رطبة (شودر وآخرون ، 1979).

امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا كوظائف لتركيز الميوجلوبين أو الليغيموغلوبين. الرموز المغلقة ، رموز فتح الميوغلوبين ، ليغيموغلوبين ج. تمثل الرموز المختلفة تجارب مختلفة. باستثناء أدنى نقطتين ، فإن معدلات امتصاص الأكسجين هي تلك التي تم الإبلاغ عنها بطريقة القياس الطيفي من خلال معدلات الحالة شبه المستقرة لنزع الأكسجين من الميوغلوبين أو الليغيموغلوبين ، كما في الشكل 3. كل نقطة هي متوسط ​​القياسات على سبعة (ميوغلوبين) أو اثنان (ليغيموغلوبين) محضرات من الميتوكوندريا المعزولة. تم تحديد أدنى نقطتين باستخدام تركيزات أثرية من الميوجلوبين أو الليغيموغلوبين كمراسل لضغط الأكسجين. يتم تطبيع امتصاص الأكسجين إلى قيمة هضبة تحددها النشاط المحدد المحدد من خلال الاستقطاب. كانت نسب معدلات امتصاص الأكسجين عند هضبة هذا الرقم إلى تلك التي تم تحديدها من الناحية القطبية 0.91 و 0.77 و 1.30 في التجارب باستخدام الميوغلوبين و 0.76 و 0.96 و 0.92 في التجارب باستخدام ليغيموغلوبين.

امتصاص الأكسجين في الميتوكوندريا كوظائف لتركيز الميوغلوبين أو الليغيموغلوبين. الرموز المغلقة ، رموز فتح الميوجلوبين ، ليغيموغلوبين ج. تمثل الرموز المختلفة تجارب مختلفة. باستثناء أدنى نقطتين ، فإن معدلات امتصاص الأكسجين هي تلك التي تم الإبلاغ عنها بطريقة القياس الطيفي من خلال معدلات الحالة شبه المستقرة لنزع الأكسجين من الميوغلوبين أو الليغيموغلوبين ، كما في الشكل 3. كل نقطة هي متوسط ​​القياسات على سبعة (ميوغلوبين) أو اثنان (ليغيموغلوبين) محضرات من الميتوكوندريا المعزولة. تم تحديد أدنى نقطتين باستخدام تركيزات أثرية من الميوجلوبين أو الليغيموغلوبين كمراسل لضغط الأكسجين. يتم تطبيع امتصاص الأكسجين إلى قيمة هضبة تحددها النشاط المحدد المحدد من خلال الاستقطاب. كانت نسب معدلات امتصاص الأكسجين عند هضبة هذا الرقم إلى تلك التي تم تحديدها من الناحية القطبية 0.91 و 0.77 و 1.30 في التجارب باستخدام الميوغلوبين و 0.76 و 0.96 و 0.92 في التجارب باستخدام ليغيموغلوبين.


نتائج

دراسة التصوير المجهري متحد البؤر للأنظمة الخلوية

توضح الأشكال 1 ، 2 ، 3 الخصائص التفصيلية للخلايا العضلية المنفصلة وألياف عضلة القلب المصابة في المحلول B مع pCa = 7.0 ، والذي يتوافق مع حالة الراحة للخلية. يوضح الشكل 1 التصوير المجهري متحد البؤر ، سواء عن طريق التألق الذاتي للبروتينات الفلافية (الشكل 1 أ) والكالسيوم داخل الميتوكوندريا (الشكل 1 ب) ، للميتوكوندريا في خلايا عضلة القلب المعزولة والمنعزلة في المحلول ب. ، وداخل الخلايا ، يتم ترتيب الميتوكوندريا بانتظام بين اللييفات العضلية. يوضح الشكل 2 أن عملية النفاذية قد اكتملت وتسمح بتلوين تألق مناعي ممتاز لشبكة الأنابيب الدقيقة في الخلايا. الشبكة سليمة ، مما يدل على أن الهيكل الخلوي للخلايا محفوظ جيدًا أثناء إجراء النفاذية. من الأساليب البديلة والأسرع والبسيطة لعزل خلايا عضلة القلب استخدام الألياف العضلية المنفعلة ("الجلد") (الشكل 3). تتطلب هذه التقنية فصلًا دقيقًا لحزم العضلات إلى ألياف ، حيث تحافظ خلايا القلب على اتصالاتها مع بعضها البعض في أقراص مقسمة (Veksler et al. ، 1987 Saks et al. ، 1998a Fig.3) ولكن قطر الألياف هو نفسه من خلايا عضلة القلب (10-20 ميكرومتر) ، ومسافات الانتشار (في المقابل ، 5-10 ميكرومتر) وحركية الانتشار للركائز و ADP هي دائمًا نفس تلك الموجودة في خلايا عضلة القلب (الجدول 1). في حين أن عزل خلايا عضلة القلب يتطلب استخدام قلوب جرذان كاملة ويستغرق وقتًا طويلاً ، فإن تقنية الألياف المنفصلة لا تحتاج إلا إلى بضعة مليغرامات من الأنسجة العضلية ، وهو أمر بالغ الأهمية ، على سبيل المثال ، في الدراسات البشرية والسريرية (Walsh et al. ، 2001 كوزنتسوف وآخرون ، 1998). ومع ذلك ، فإن الطريقتين جيدتان بنفس القدر لدراسة مجموع سكان الميتوكوندريا داخل الخلية في محيطهم الطبيعي.

قياس الظاهر K.م من أجل ADP الخارجي في مستحضرات خلية نفاذية مختلفة ، ومسافات الانتشار من الوسط إلى مركز الخلايا (Rديف)

تحضير . القطر المقاس (ميكرومتر). صديف (ميكرومتر). ظاهر كم (ADP) (ميكرولتر 1 -1). المرجعي .
عضلات القلب 10-25 5-12.5 - أوبي ، 1998
- - 329±50 * الدراسة
16 8 250±38 ساكس وآخرون ، 1991
20 10 200-250 كاي وآخرون ، 1997
عضلات القلب "الشبح" 20 10 200-250 كاي وآخرون ، 1997
ألياف القلب الجلدية - - 297±35 ساكس وآخرون ، 1993
20 10 300±23 ساكس وآخرون ، 2001
- - 300-400 Seppet et al.، 2001
- - 370±70 Boudina et al.، 2002
- - 234±24 Liobikas وآخرون ، 2001
22 11 - مينين وآخرون ، 2001
- - 334±48 * الدراسة
ألياف قلبية "شبحية" 20 10 349±24 ساكس وآخرون ، 1993
- - 349±34 * الدراسة
ألياف قلبية مغطاة بالجلد + كرياتين - - 79±8 ساكس وآخرون ، 1991
- - 85±5 كوزنتسوف وآخرون ، 1996
الفئران في قلب الميتوكوندريا في المختبر∼1 0 17.6±1 ساكس وآخرون ، 1991
تحضير . القطر المقاس (ميكرومتر). صديف (ميكرومتر). ظاهر كم (ADP) (ميكرولتر 1 -1). المرجعي .
عضلات القلب 10-25 5-12.5 - أوبي ، 1998
- - 329±50 * الدراسة
16 8 250±38 ساكس وآخرون ، 1991
20 10 200-250 كاي وآخرون ، 1997
عضلات القلب "الشبح" 20 10 200-250 كاي وآخرون ، 1997
ألياف القلب الجلدية - - 297±35 ساكس وآخرون ، 1993
20 10 300±23 ساكس وآخرون ، 2001
- - 300-400 Seppet et al.، 2001
- - 370±70 Boudina et al.، 2002
- - 234±24 Liobikas وآخرون ، 2001
22 11 - مينين وآخرون ، 2001
- - 334±48 * الدراسة
ألياف قلبية "شبحية" 20 10 349±24 ساكس وآخرون ، 1993
- - 349±34 * الدراسة
ألياف قلبية مغطاة بالجلد + كرياتين - - 79±8 ساكس وآخرون ، 1991
- - 85±5 كوزنتسوف وآخرون ، 1996
الفئران في قلب الميتوكوندريا في المختبر∼1 0 17.6±1 ساكس وآخرون ، 1991

تم القياس في هذا العمل لتحضيرات مشابهة لتلك الموضحة في الشكل 1. تم إعطاء مسافات الانتشار لتقييم معدل الحركة البراونية لـ ADP في الماء ، إذا لزم الأمر (Saks وآخرون ، 2001).

الخصائص التنفسية لأنظمة الخلايا المنفصلة

يتم تنظيم معدل الفسفرة المؤكسدة (إنتاج الميتوكوندريا ATP) بواسطة ADP بسبب ظاهرة التحكم في الجهاز التنفسي (Chance and Williams ، 1956). تتميز تقارب الفسفرة المؤكسدة لـ ADP كميًا بظاهرة كم لـ ADP. بالنسبة للميتوكوندريا المعزولة في المعلق المتجانس ، فإن قيمة هذا الثابت لـ ADP في الوسط (ADP خارجي) منخفضة جدًا ، 10-20 ميكرولتر -1 ، بسبب النفاذية العالية للغشاء الخارجي للميتوكوندريا (Klingenberg ، 1970) ومرتفعة تقارب ناقل نيوكليوتيدات الأدينين لهذه الركيزة (Vignais ، 1976). ومع ذلك ، عند دراسة الميتوكوندريا في الخلايا المنحلة فى الموقع، النتائج مختلفة جدا (ساكس وآخرون ، 1998 أ).

يلخص الجدول 1 الارتباطات المقاسة للميتوكوندريا لـ ADP الخارجية في مستحضرات مختلفة قبل (الخلايا النفاذة السليمة) وبعد (الخلايا الشبحية أو الألياف) استخراج الميوسين. على الرغم من مسافات الانتشار الصغيرة جدًا (المتوسط ​​= 10 ميكرومتر) من الوسط إلى قلب الخلايا (الأشكال 1 ، 2 ، 3) ، في جميع الحالات ، تكون التقاربات منخفضة جدًا مقارنة بالقيم العالية جدًا للظاهرة كم من أجل ADP الخارجي (300-400 ميكرولتر -1). ملاحظة مهمة موضحة في الجدول 1 هي أن تنشيط تفاعل الكرياتين كيناز الميتوكوندريا (miCK) يقلل من قيمة الظاهر. كم ل ADP خارجي. هذا بسبب الاقتران الوظيفي لتفاعل miCK مع الفسفرة المؤكسدة عبرمترجم نيوكليوتيدات الأدينين (Barbour et al.، 1984 Joubert et al.، 2002 Saks et al.، 1975، 1994، 1995 Wallimann et al.، 1992 Wyss and Kaddurah-Daouk، 2000) ، مما يؤدي إلى زيادة معدل التداول المحلي للأدينين النيوكليوتيدات في الميتوكوندريا ، وإنتاج الفوسفوكرياتين الهوائي الفعال واستقرار التمثيل الغذائي للقلب (Garlid ، 2001 Kay et al. ، 2000 Saks et al. ، 1995). هذا يؤكد دور miCK في تنظيم تنفس الميتوكوندريا في خلايا العضلات (Joubert et al. ، 2002 Kay et al. ، 2000 Saks et al. ، 2001 Walsh et al. ، 2001).

يتم توفير المزيد من الأدلة على هذا النوع من التحكم المحلي في التنفس بواسطة miCK في الشكل 4 ، والذي يوضح تسجيلات الأكسجين للتنفس الميتوكوندريا في ألياف القلب ذات الجلد عندما تم إنتاج ADP داخليًا في تفاعلات MgATPase الخلوية في وجود 2mmoll -1 MgATP. ينشط إنتاج ADP الداخلي التنفس عدة مرات. أدت الإضافة اللاحقة لنظام يتنافس مع الميتوكوندريا من أجل ADP (Gellerich and Saks ، 1982) ، المكون من بيروفات كيناز (PK) بتركيزات عالية و phosphoenolpyruvate (PEP) ، إلى خفض معدل التنفس ، ولكن ليس بأكثر من 40٪. أدت إضافة الكرياتين إلى زيادة معدل التنفس إلى قيمته القصوى التي لوحظت في الحالة 3. ويرجع ذلك مرة أخرى إلى تنشيط الإنتاج المحلي لـ ADP بواسطة miCK في الفضاء بين غشاء الميتوكوندريا ، ولا يمكن الوصول إلى ADP المنتج محليًا تمامًا لـ PK الخارجية ولكن يتم توجيهه إلى نقل النوكليوتيدات الأدينين ونقله إلى مصفوفة الميتوكوندريا (انظر أعلاه).

تسجيلات معدل التنفس في ألياف عضلة القلب المنشطة بواسطة إنتاج ADP الداخلي في تفاعلات MgATPase. تظهر الآثار معدل تغير تركيز الأكسجين في الوقت المناسب في خلية أوكسيجراف. تم قياس معدلات التنفس في وجود 5mmoll -1 glutamate بالإضافة إلى 2mmoll -1 malate ، كما هو موضح في المواد والطرق. يشار إلى إضافة 2mmoll -1 ATP ، والتركيزات النهائية المختلفة من بيروفات كيناز (PK) في وجود 2mmoll -1 phosphoenolpyruvate (PEP) في الوسط. في نهاية التجارب ، تمت إضافة 20 ملمول -1 كرياتين. تظهر الأسهم وقت الإضافة. أظهرت النتائج بعض التأثير المثبط لنظام بيروفات كيناز التنافسي (PK) -PEP لـ ADP الداخلي على معدل التنفس وتأثير الكرياتين المحفز بسبب تفاعل الكرياتين كيناز المقترن في وجود PK. فقط تثبيط طفيف للتنفس من خلال نشاط PK عالي جدًا (20i.u.ml -1) يوضح التقسيم والتوجيه المباشر لـ ADP الداخلي. تزداد تأثيرات التوجيه المباشر بعد تنشيط الكرياتين كيناز الميتوكوندريا.

تسجيلات معدل التنفس في ألياف عضلة القلب المنشطة بواسطة إنتاج ADP الداخلي في تفاعلات MgATPase. تظهر الآثار معدل تغير تركيز الأكسجين في الوقت المناسب في خلية أوكسيجراف. تم قياس معدلات التنفس في وجود 5mmoll -1 glutamate بالإضافة إلى 2mmoll -1 malate ، كما هو موضح في المواد والطرق. يشار إلى إضافة 2mmoll -1 ATP ، والتركيزات النهائية المختلفة من بيروفات كيناز (PK) في وجود 2mmoll -1 phosphoenolpyruvate (PEP) في الوسط. في نهاية التجارب ، تمت إضافة 20 ملمول -1 كرياتين. تظهر الأسهم وقت الإضافة. أظهرت النتائج بعض التأثير المثبط لنظام بيروفات كيناز التنافسي (PK) -PEP لـ ADP الداخلي على معدل التنفس وتأثير الكرياتين المحفز بسبب تفاعل الكرياتين كيناز المقترن في وجود PK. فقط تثبيط طفيف للتنفس من خلال نشاط PK عالي جدًا (20i.u.ml -1) يوضح التقسيم والتوجيه المباشر لـ ADP الداخلي. تزداد تأثيرات التوجيه المباشر بعد تنشيط الكرياتين كيناز الميتوكوندريا.

يمكن العثور على شرح هذه البيانات التجريبية والكفاءة المنخفضة لتثبيط التنفس بواسطة PK الخارجي باستخدام النموذج الرياضي لانتشار ADP ونقل الطاقة داخل الخلايا (انظر المواد والطرق). يوضح الشكل 5 نتائج حسابات معدل التنفس في حالتين مختلفتين. أولاً ، معامل الانتشار ، د، بالنسبة لـ ADP و ATP ، تم اعتبارهما مساويين لتلك الموجودة في طور الماء المجمع الخلوي ، د0= 145 ميكرومتر -2 ثانية -1 (Aliev and Saks ، 1997). في هذه الحالة ، بسبب مسافة الانتشار الصغيرة وارتفاع معدل الانتشار (قيمة عالية لـ د) ، يتم تبادل ATP و ADP بسرعة بين الفراغات الخارجية وداخل الخلايا ، ويتم استهلاك ADP الذي يتم إنتاجه داخليًا في تفاعلات MgATPase الخلوية بسرعة كبيرة بواسطة PK (الخط الصلب في الشكل 5). والنتيجة هي أن التنفس يتم كبته بالفعل في وجود PK في الأنشطة التي تقل عن 5i.u.ml -1 في الوسط (الخط الصلب في الشكل 5). تتوافق هذه البيانات مع استنتاجاتنا السابقة بأن الحركة البراونية لـ ADP في طور الماء عبر 10 ميكرومتر أسرع بكثير من دورانها الأيضي في ميتوكوندريا القلب (ساكس وآخرون ، 2001).

النمذجة الحاسوبية للبيانات الموضحة في الشكل 4 حول تقليل معدل تنفس الميتوكوندريا فى الموقع في خلايا القلب المنفصلة التي تعتمد على ADP الداخلي (في وجود 2mmoll -1 MgATP) عن طريق زيادة نشاط بيروفات كيناز (PK) لنظامين مختلفين. الخامس. ، معدل التنفس في ظل ظروف معينة V̇ معدل التنفس قبل إضافة ATPV̇ATP، معدل التنفس في وجود 2mmoll -1 ATP. الخط الصلب: تم ​​أخذ ثابت الانتشار لـ ADP كـ د0 (مميزة للحركة البراونية في مرحلة الماء). الخط المكسور: تم تغيير معامل الانتشار الظاهر ليلائم البيانات التجريبية (تظهر النقاط المنفصلة القيم المتوسطة ± SD لمعدل التنفس لنشاط بيروفات كيناز المحدد). تم الحصول على علاقة جيدة بين عمليات المحاكاة والقياسات ل DF = 10 -1.8.

النمذجة الحاسوبية للبيانات الموضحة في الشكل 4 حول تقليل معدل تنفس الميتوكوندريا فى الموقع في خلايا القلب المنفصلة التي تعتمد على ADP الداخلي (في وجود 2mmoll -1 MgATP) عن طريق زيادة نشاط بيروفات كيناز (PK) لنظامين مختلفين. الخامس. ، معدل التنفس في ظل ظروف معينة V̇ معدل التنفس قبل إضافة ATPV̇ATP، معدل التنفس في وجود 2mmoll -1 ATP. الخط الصلب: تم ​​أخذ ثابت الانتشار لـ ADP كـ د0 (مميزة للحركة البراونية في مرحلة الماء). الخط المكسور: تم تغيير معامل الانتشار الظاهر ليلائم البيانات التجريبية (تظهر النقاط المنفصلة القيم المتوسطة ± SD لمعدل التنفس لنشاط بيروفات كيناز المحدد). تم الحصول على علاقة جيدة بين عمليات المحاكاة والقياسات ل DF = 10 -1.8.

ومع ذلك ، فإن منحنى د0 أقل بكثير من الاعتماد التجريبي (الشكل 5 ، النقاط التجريبية). لتتناسب مع النتائج التجريبية الموضحة في الشكلين 4 و 5 ، قمنا بتقليل متوسط ​​معامل الانتشار الظاهر (دتطبيق= DF ×د0) ، داخل الخلايا ، بافتراض أن الدرجة العالية من التنظيم الهيكلي داخل الخلايا (انظر الأشكال 1 ، 2 ، 3) قد تقيد انتشار نيوكليوتيدات الأدينين (ساكس وآخرون ، 2001). لوحظ وجود توافق جيد بين نتائج النمذجة والبيانات التجريبية عندما اقترب DF من قيمة 10 -2 (الشكل 5). هذا يعني أن الانتشار داخل الخلايا لـ ADP (و ATP) من المحتمل أن يكون غير متجانس للغاية ومقيد بشدة في بعض المناطق داخل الخلايا. من المحتمل أن يحدث هذا في أو بالقرب من غشاء الميتوكوندريا الخارجي وبين وحدات ICEU (Aliev and Saks ، 1997 Saks et al. ، 1994 ، 2001).

ومن المعروف أيضا أن القيم العالية للظاهر كمبالنسبة لـ ADP الخارجي ينخفض ​​بشكل ملحوظ من 300-350 ميكرولتر -1 إلى 40-70 ميكرولتر -1 عن طريق التحلل البروتيني الانتقائي (كوزنتسوف وآخرون ، 1996 ساكس وآخرون ، 2001). يؤدي علاج خلايا عضلة القلب المنفصلة لفترة قصيرة باستخدام 1 ميكرول -1 تريبسين أيضًا إلى اضطراب سريع في الترتيب المنتظم للميتوكوندريا في خلايا عضلة القلب وانهيار في شبكة الأنابيب الدقيقة (Appaix et al. ، 2003). وبالتالي ، من الواضح في ظل هذه الظروف ، فقد الهيكل المحدد لوحدات ICEU وإلغاء القيود المحلية داخل الخلايا لانتشار ADP. هذا قد يفسر جيدا الانخفاض في الظاهر كم ل ADP خارجي. بالإضافة إلى ذلك ، لقد أظهرنا سابقًا أنه بعد علاج مماثل للبروتين ، يصبح ADP الداخلي أكثر سهولة بالنسبة لتفاعل PK الخارجي (Saks et al. ، 2001).

تتوافق فرضية عدم تجانس الانتشار داخل الخلايا لـ ADP المتعلقة بهيكل وحدات العناية المركزة مع النتائج الجديدة المفاجئة الموضحة أدناه.

الرابط الظاهر بين طول قسيم عضلي والمعلمات الحركية لتنظيم التنفس

تُظهر النتائج الموصوفة في الأشكال 6 و 7 و 8 ظاهرة جديدة مثيرة للاهتمام - صلة واضحة بين طول القسيم العضلي وتقارب الميتوكوندريا لـ ADP الخارجي ، مقاسة على أنها ظاهرة ظاهرية كم لهذه الركيزة في تنظيم تنفس الميتوكوندريا في الخلايا المنفصلة فى الموقع. لوحظت هذه الظاهرة عندما تمت دراسة حركية تنظيم التنفس بواسطة ADP بتركيزات مختلفة من الكالسيوم الحر في نظامين: ألياف عضلة القلب المنفوخة والألياف "الشبحية" المنفصلة بعد استخراج الميوسين. تمت زيادة تركيز الكالسيوم الحر من 0.1 ميكرولتر -1 إلى 3 ميكرولتر -1 ، وهو ما يتوافق مع النطاق الفسيولوجي للتركيزات (بيرس ، 2001). يوضح الشكل 6 أنه في وجود ATP (أو ركائز الجهاز التنفسي و ADP) ، تؤدي زيادة تركيز Ca 2+ المجاني إلى 3 ميكرولتر -1 إلى تقلص قوي في الأورام اللحمية وتقصير طول الألياف في ألياف القلب السليمة النفاذة. إذا لم تكن الألياف ثابتة ، يبدو أن الميتوكوندريا بين الليف العضلي تندمج نتيجة الضغط عليها معًا إذا كانت الألياف مثبتة في الأديم المرن وتتقلص بشكل متساوي القياس ، يلاحظ المرء ظهور المناطق الفارغة ومسافة طويلة إلى حد ما بين الميتوكوندريا. في كلتا الحالتين ، يتم تشويه بنية الخلية وهيكل وحدات العناية المركزة.

تصوير الميتوكوندريا في ألياف عضلة القلب المنفصلة بواسطة مسبار حساس لاحتمال الغشاء تيراميثيل رودامين إيثيل إيثر (TMRE). (أ) الألياف في وجود 2mmoll -1 ATP ، 2mmoll -1 malate و 5mmoll -1 glutamate (تركيز Ca 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 0.1 ميكرولول -1). (ب) نفس الألياف بعد إضافة كلوريد الكالسيوم (التركيز النهائي للكالسيوم الحر 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 1.0 ميكرول -1). لم يتم إصلاح الألياف اليسرى في حجرة الثنيات ، بينما تم تثبيت الألياف اليمنى (الأطول) بنهاياتها. في A ، يتم استرخاء كلا الألياف. في B ، تتقلص الألياف اليسرى ، بينما تُظهر الألياف اليمنى ، التي تتقلص بشكل متساوي القياس تقريبًا ، تغييرات هيكلية كبيرة بسبب تقلص قسيم عضلي. لاحظ المساحات الفارغة بين الميتوكوندريا.

تصوير الميتوكوندريا في ألياف عضلة القلب المنفصلة بواسطة مسبار حساس لاحتمال الغشاء تيراميثيل رودامين إيثيل إيثر (TMRE). (أ) الألياف في وجود 2mmoll -1 ATP ، 2mmoll -1 malate و 5mmoll -1 glutamate (تركيز Ca 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 0.1 ميكرولول -1). (ب) نفس الألياف بعد إضافة كلوريد الكالسيوم (التركيز النهائي للكالسيوم الحر 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 1.0 ميكرول -1). لم يتم إصلاح الألياف اليسرى في حجرة الأرفف المرنة ، بينما تم تثبيت الألياف اليمنى (الأطول) بنهاياتها. في A ، يتم استرخاء كلا الألياف. في B ، تتقلص الألياف اليسرى ، بينما تُظهر الألياف اليمنى ، التي تتقلص بشكل متساوي القياس تقريبًا ، تغييرات هيكلية كبيرة بسبب تقلص قسيم عضلي. لاحظ المساحات الفارغة بين الميتوكوندريا.

تصوير الميتوكوندريا في ألياف عضلة القلب المنفصلة بعد استخلاص الميوسين (الألياف الشبحية) بواسطة مسبار حساس لاحتمال الغشاء تيراميثيل رودامين إيثيل إيثر (TMRE). (أ) ألياف شبحية في وجود 2mmoll -1 ATP ، 2mmoll -1 malate و 5mmoll -1 glutamate (تركيز Ca 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 0.1μmoll -1). (ب) نفس الألياف الشبحية بعد إضافة كلوريد الكالسيوم (التركيز النهائي للكالسيوم الحر 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 1.0μmoll -1). لم تشاهد أي تغييرات هيكلية. تم الحصول على نفس النتيجة لتركيز Ca 2+ مجاني 3μmoll -1 .

تصوير الميتوكوندريا في ألياف عضلة القلب المنفصلة بعد استخلاص الميوسين (الألياف الشبحية) بواسطة مسبار حساس لاحتمال الغشاء تيراميثيل رودامين إيثيل إيثر (TMRE). (أ) ألياف شبحية في وجود 2mmoll -1 ATP ، 2mmoll -1 malate و 5mmoll -1 glutamate (تركيز Ca 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 0.1μmoll -1). (ب) نفس الألياف الشبحية بعد إضافة كلوريد الكالسيوم (التركيز النهائي للكالسيوم الحر 2+ في المخزن المؤقت Ca-EGTA: 1.0μmoll -1). لم تشاهد أي تغييرات هيكلية. تم الحصول على نفس النتيجة لتركيز Ca 2+ مجاني 3μmoll -1 .

تأثير تراكيز الكالسيوم 2+ الحرة المختلفة على معلمات حركية ADP لتنفس الميتوكوندريا في ألياف عضلة القلب المنفصلة والألياف المستخرجة من الميوسين. (أ) تأثير Ca 2+ على الظاهر كم لـ ADP. تراجع دراماتيكي في الظاهر كم ل ADP لوحظ في ألياف التحكم. على النقيض من ذلك ، لا توجد تغييرات في الظاهر كم يمكن رؤية ADP في ألياف الأشباح. (ب) تأثير مختلف تراكيز الكالسيوم 2+ الحرة على الخامسالأعلى.

تأثير تراكيز الكالسيوم 2+ الحرة المختلفة على معلمات حركية ADP لتنفس الميتوكوندريا في ألياف عضلة القلب المنفصلة والألياف المستخرجة من الميوسين. (أ) تأثير Ca 2+ على الظاهر كم لـ ADP. تراجع دراماتيكي في الظاهر كم ل ADP لوحظ في ألياف التحكم. على النقيض من ذلك ، لا توجد تغييرات في الظاهر كم يمكن رؤية ADP في ألياف الأشباح. (ب) تأثير مختلف تراكيز الكالسيوم 2+ الحرة على الخامسالأعلى.

يمنع استخراج الميوسين هذه التغييرات الهيكلية التي يسببها Ca 2+ (الشكل 7). أدت إزالة نسبة كبيرة من الميوسين إلى تقليل نشاط MgATPase الكلي للألياف (تم قياسه في وجود 3mmoll -1 MgATP) من حوالي 4.5-5.0 نانومول / دقيقة - 1 كتلة رطبة (الكتلة الأولية) إلى 0.9-1.0 نانومول / دقيقة - 1 ويتماس. في ألياف الأشباح ، هناك ترتيب منتظم جدًا للميتوكوندريا مع تثبيت دقيق ومتوازي في ذض لوحظ مستوى الخلايا (اتجاه اتجاه الألياف عموديًا على x-محور) ، مما يعطي انطباعًا بنمط مخطط للتوزيع داخل الخلايا للميتوكوندريا. في هذه الألياف الشبحية ، لا تتغير المسافة المنتظمة بين الميتوكوندريا ، المقابلة لطول قسيم عضلي ، مع تغيير تركيز الكالسيوم (الشكل 7). وبالتالي ، لا يوجد تشوه في الهيكل الداخلي المعدل لوحدات العناية المركزة في الخلية.

يوضح الشكل 8 ، بشكل مدهش ، ما هو واضح كم بالنسبة إلى ADP الخارجي في تنظيم تنفس الميتوكوندريا في الألياف السليمة النفاذة ينخفض ​​من 350 ميكرولتر -1 إلى 30 ميكرولتر -1 مع ارتفاع تركيز الكالسيوم الحر إلى 3 ميكرولتر -1 وتشوه بنية الخلية (الشكل 8 أ). انخفاض في الخامسالأعلى كما لوحظ التنفس (الشكل 8 ب). لم يتم ملاحظة أي من هذه التغييرات في ألياف الأشباح. على الرغم من إزالة الميوسين وانخفاض بمقدار 5 أضعاف في نشاط MgATPase الكلي ، فإن الظاهر كم بالنسبة إلى ADP الخارجي (349 ± 34 ميكرولتر -1) يكون مبدئيًا (عند 0.1 ميكرولتر -1 تركيز خال من الكالسيوم) مساويًا للألياف السليمة النفاذة ويظل دائمًا أعلى من 250 ميكرومتر -1 ، حتى عند زيادة تركيز الكالسيوم 2+ الحر إلى 3 ميكرولتر -1 (الشكل 8 أ). الخامسالأعلى لا يتغير سواء مع تغيير تركيز الكالسيوم 2+ الحر (الشكل 8 ب مقارنة بالألياف المنفوخة السليمة ، الخامسالأعلى مرتفع في الألياف الشبحية بسبب استخراج نسبة كبيرة من البروتين ، مثل الميوسين). يوضح استقرار جميع وظائف الميتوكوندريا في ألياف الأشباح أن التغييرات في تركيز Ca 2+ الحر في النطاق المستخدم لا يغير الميتوكوندريا ، والتي قد تنتج عن آلية فتح مسام الانتقال (PTP) (Lemasters et al. ، 1998 ).

الاستنتاج المهم من هذه البيانات هو أنها تبدو رابطًا بنيويًا ووظيفيًا مباشرًا بين بنية قسيم عضلي ووظيفة الميتوكوندريا ، والتي تتفق مع مفهوم وحدات العناية المركزة.


نتائج

لا يتحقق مطياف الكتلة والتحليل السليكي لبروتين الميتوكوندريا من وجود RAS للميتوكوندريا

أولاً ، من أجل الحصول على دليل غير متحيز لوجود RAS في الميتوكوندريا ، استخدمنا كسور الميتوكوندريا المنقى للتحليل البروتيني. تمت تنقية جزء الميتوكوندريا الخام (CM) ، جنبًا إلى جنب مع النوى والميكروسومات والليزوزومات والسيتوبلازم بالطرد المركزي التفاضلي. من جزء CM ، تم فصل الميتوكوندريا النقية (PM) عن الأغشية المرتبطة بالميتوكوندريا (MAM) ، باستخدام تنبيذ فائق متساوي التكوين على تدرج كثافة بيركول ذاتي التكوين من كبد الفئران. يمثل جزء MAM واجهة الميتوكوندريا مع العضيات الخلوية الأخرى ، ولا سيما الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، حيث تحدث تفاعلات الإشارات والاستقلاب. وبالتالي فهو يحتوي على مكونات من OMM والأغشية الخلوية الأخرى المرتبطة بشكل فضفاض. في المقابل ، الميتوكوندريا النقية خالية من العضيات الأخرى ، ومخصبة للغاية في المصفوفة ، IMM ، OMM ومكونات الفضاء بين الغشاء (للمراجعات الحديثة انظر 25 ، 26). تم فصل البروتينات من كسور CM و PM و MAM بواسطة SDS-PAGE وخضعت لتحليل مطياف الكتلة (الشكل التكميلي S1 ومجموعة البيانات التكميلية S1). قمنا بتجميع قائمة بالجينات ذات الصلة بـ RAS باستخدام قاعدة بيانات علم الوجود الجيني AmiGO (GO) ، وسعينا إلى وجود منتجات النسخ الخاصة بها بين تلك التي تم تحديدها بواسطة تحليل قياس الطيف الكتلي. الأهم من ذلك ، من المكونات الثلاثة ذات الصلة بـ RAS الموجودة في كسور CM و MAM و PM ، لا يشارك أي منها بشكل مباشر في توليد الأنجيوتنسين وربطه (انظر مجموعة البيانات التكميلية S1).

يتم دعم صحة هذه النتائج من خلال استجواب الفهارس غير المتحيزة لبروتين الميتوكوندريا. تجمع قاعدة بيانات MitoMiner النتائج من 47 مسحًا بروتينيًا عبر عدة أنواع 27 ، بينما تجمع MitoCarta بين البروتينات والتصوير وتحليل التسلسل لتسجيل احتمالية توطين الميتوكوندريا للبروتينات الفردية في البشر والفئران ، مما يزيد من الحساسية لتحديد بروتينات الميتوكوندريا. بالإضافة إلى تحليلنا البروتيني في كبد الفئران ، سمح لنا استخدام قواعد البيانات هذه باختبار وجود مكونات RAS وجميع الجينات ذات الصلة من سلسلة من أنواع وأنسجة الثدييات ، بما في ذلك مجموعات الجينات القوارض والأبقار والبشر (مجموعة البيانات التكميلية S2) . مرة أخرى ، أنشأنا مجموعات جينات من أولئك الذين ينتمون إلى جميع مصطلحات GO المتعلقة بـ RAS في قاعدة بيانات AmiGO عبر جميع الأنواع. ثم بحثنا في مقابل جينات الميتوكوندريا المتوقعة في قاعدتي بيانات MitoMiner و MitoCarta. كشف هذا عن توطين الميتوكوندريا للمنتجات الجينية المشاركة في تخليق الألدوستيرون ، كأهداف لـ RAS ، ولكن لم يتم إثبات أي مكونات RAS جوهرية تجريبيًا أو تم التنبؤ بها بشكل بيولوجي لتوطين الميتوكوندريا (مجموعة البيانات التكميلية S2).

في حين أن هذه الأساليب مجتمعة جعلت وجود RAS في الميتوكوندريا أمرًا غير محتمل ، إلا أنها لا تستطيع استبعاد احتمال وجود مكونات بوفرة منخفضة رسميًا. وهكذا ، شرعنا في تحليل الكسور الفرعية للميتوكوندريا المنقى لوجود مكونات RAS الرئيسية باستخدام الترسيب المناعي والتخثر المناعي.

لا تحتوي ميتوكوندريا كبد الفئران على إنزيم ACE القابل للاكتشاف

في حالة وجود RAS وظيفي ومكتفي ذاتيًا في الميتوكوندريا ، فيجب أن يحتوي على إنزيمات تولد AngII ، وهو الدور الذي يؤديه في الغالب ACE ، وهو الإنزيم الأكثر حفظًا تطوريًا ، وهو المسؤول المباشر عن توليد AngII من AngI في جميع أنحاء الجسم. لذلك سعينا للتعرف على الإنزيم المحول للأنجيوتنسين في الميتوكوندريا المنقى من أنسجة كبد الفئران. كما هو مبين في الشكل 1 أ ، يتعرف الجسم المضاد الموجه إلى الطرف C للبروتين على نطاق عالي الوزن الجزيئي (MW & # x02248 150 & # x02005kDa ، توقع MW من ACE) في الكسور المتجانسة والنووية والليزوزومية والميكروسومية ، ولكن ليس في الميتوكوندريا. على العكس من ذلك ، تم إثراء نطاق منخفض MW (& # x0224850 & # x02005kDa) في جزء الميتوكوندريا الخام. كانت هذه الفرقة موجودة أيضًا في كسور الميتوكوندريا النقية من ثلاثة مستحضرات مستقلة وإن كانت بكثافة أقل ومتغيرة. نظرًا لوجود شكل إسوي طبيعي أقصر للإنسان والفئران (ACE-T ، Uniprot <"type": "entrez-protein"، "attrs": <"text": "P47820"، "term_id": "1351843"، "term_text ":" P47820 ">> P47820) ، سعينا لتأكيد هوية النطاق السفلي للميتوكوندريا ميغاواط. وهكذا قمنا بتنقيته عن طريق الترسيب المناعي (الشكل 1 ب) وتحليلنا بواسطة مطياف الكتلة. ومع ذلك ، فإن نتائج التحليل لم تُرجع أي تسلسلات مرتبطة بـ ACE ، مما يشير إلى أن النطاق يمثل ارتباطًا غير محدد بالجسم المضاد. إجمالاً ، أكدت هذه النتائج التحليل البروتيني باستثناء وجود الإنزيم المحول للأنجيوتنسين في الميتوكوندريا.

(أ). لطخة غربية باستخدام مضادات الإنزيم المحول للأنجيوتنسين والأجسام المضادة لـ GRP75 من الكسور تحت الخلوية في كبد الفئران. H-homogenate ، N- جزء نووي ، C-cytosol ، L-lysosomes ، Mc-microsomes. تمت تنقية ميتوكوندريا كبد الفئران عن طريق الطرد المركزي التفاضلي للحصول على الميتوكوندريا الخام (CM) وفصلها أيضًا إلى الأغشية المرتبطة بالميتوكوندريا (MAM) وكسور الميتوكوندريا النقية (PM) عن طريق الطرد المركزي المتساوي (للحصول على التفاصيل ، انظر الطرق). تحتوي كسور الميتوكوندريا فقط على نطاق مناعي 50 & # x02005kDa. تم اقتصاص صور الطعم المناعي لتحديد مناطق الاهتمام. تم تحميل قسامات مختلفة من نفس العينات وفصلها في ظل ظروف متطابقة.شاهد الصور الكاملة على الشكل التكميلي S3. (ب). الترسيب المناعي لـ ACE باستخدام جزء CM كمدخلات باستخدام نهج Pierce Crosslink IP كما هو موضح في الطرق. تم ربط الجسم المضاد 10 & # x02005 & # x003bcg ACE C-20 بالبروتين A / G راتينج الاغاروز وتم استخدام بروتين 1 & # x02005mg كمدخل. تم إجراء الترسيب المناعي إما في محلول ملحي Tris-Buffered ، (TBS ، 0.025 & # x02005M Tris ، 0.15 & # x02005M NaCl pH 7.2) أو TBS مكمل بـ 0.5 & # x02005mM EDTA ، 0.5٪ NP-40 ، 2.5٪ جلسرين لتعزيز الإنزيم المحول للأنجيوتنسين ملزم (د). تم استخدام الجسم المضاد للماعز غير المرتبط (UR) والراتنج بدون الجسم المضاد المتشابك (R) كعناصر تحكم في كل من محاليل TBS و D. تُظهر اللوحة العلوية الكشف المناعي باستخدام نفس الجسم المضاد لـ ACE ، بينما تُظهر اللوحة السفلية المواد الهلامية SDS-PA المطلية بالفضة. تم تحليل النطاق 50 & # x02005kDa في جزء ACE-D بواسطة مقياس الطيف الكتلي ، وتم تحديده على أنه بروتين غير مرتبط بـ ACE أو RAS. تم اقتصاص الصور لإظهار جميع النطاقات المرئية.

في1R موجود في MAM ، لكن لا يوجد AT1جرذ2يمكن اكتشاف ارتباط R أو AngII في جزء PM

في حين أن النتائج السابقة استبعدت إمكانية توليد AngII داخل الميتوكوندريا بواسطة ACE ، لا يزال من الممكن أن تكون الميتوكوندريا هدفًا لـ AngII المتولدة في مواقع أخرى داخل الخلايا أو مستوردة من مصادر خارج الخلية. لذلك سعينا إلى وجود مستقبلات AngII الوظيفية في الكسور تحت الخلوية والفئران تحت الخلية ، باستخدام استراتيجيتين مستقلتين. أولاً ، قمنا بقياس ارتباط محدد لـ [125 I] -AngII في كسور PM و MAM. كما هو مبين في الشكل 2 أ ، اكتشفنا موقع ارتباط واحد عالي التقارب في جزء MAM كما هو مبين في منحدرات هيل بالقرب من الوحدة ، مع ثابت تفكك التوازن شبه النانوي (Kد) وكثافة مستقبلات قصوى (بالأعلى) مقارنة بالنطاق الموجود في غشاء البلازما 29 ، مما يشير إلى أن مواقع ربط AngII الوظيفية موجودة في الأغشية المرتبطة بالميتوكوندريا. ومع ذلك ، أظهرت نفس مواقع الربط عالية التقارب & # x02248 كثافة أقل بمقدار 50 مرة في الميتوكوندريا المنقى ، مما يشير على الأرجح إلى التلوث من جزء MAM ، ومن غير المرجح أن تكون متسقة مع إشارات AngII الفعالة بوساطة. تم منع ربط AngII بمواقع الربط المحلية MAM بواسطة AT المحدد1R المضاد Losartan ، لكنه لا يتأثر بـ AT2مناهض R PD123319 ، مما يشير إلى أن الارتباط كان AT1R ذات الصلة (الشكل 2 ب).

(أ). تقارب (K.د) ، الكثافة (بالأعلى) والتعاون (معامل التل ، nH) لمواقع ربط AngII المحددة في كسور PM و MAM. (ب). ربط محدد لـ [125 I] -AngII في جزء MAM في وجود AT1R (لوسارتان) أو AT2R (PD123319) حاصرات. تم حساب تركيز اللوسارتان من ثوابت التثبيط 29 لحجب & # x0003e95٪ من مستقبل AT1 ولكن & # x0003c2٪ من AT2تم حساب R. [PD123319] لحجب 99٪ من AT2R لكن & # x0003c2٪ من AT1ص. (ج). الكشف عن لطخة غربية من AT1R في الكسور الخلوية. H-homogenate ، C-cytosol ، L-lysosomes ، Mc-microsomes. تمت تنقية ميتوكوندريا كبد الفئران عن طريق الطرد المركزي التفاضلي (CM) وفصلها أيضًا إلى الأغشية المرتبطة بالميتوكوندريا (MAM) وأجزاء الميتوكوندريا النقية (PM) عن طريق الطرد المركزي بيركول (للحصول على التفاصيل ، انظر الطرق). تم استخدام الوحدة الفرعية Cytochrome oxidase IV (CoxIV) كعلامة غشاء داخلي للميتوكوندريا. تم اقتصاص صور الطعم المناعي لتحديد مناطق الاهتمام. تم استخدام نفس الغشاء لكلا الحطام المناعي. شاهد الصور الكاملة على الشكل التكميلي S4.

من أجل إجراء مزيد من التحليل لوجود AT وتوطينه1R و AT2R الأنواع الفرعية ، أجرينا بعد ذلك تحليل لطخة غربية للكسور تحت الخلوية للكبد الجرذ والميتوكوندريا الفرعية. بالاتفاق مع الدراسات الملزمة ، تمكنا من اكتشاف AT1R في جزء CM و MAM ، ولكن ليس في PM (الشكل 2C). في المقابل ، الأجسام المضادة ضد AT2أعطى R سلسلة من النطاقات المناعية (الشكل 3 أ) ، حتى في نطاق الوزن الجزيئي المتوقع للمستقبل (& # x0224840 & # x0201350 & # x02005kD الشكل 3 ب). وهكذا اتبعنا الإستراتيجية المطبقة سابقًا على الإنزيم المحول للأنجيوتنسين ، باستخدام الجسم المضاد لترسب مناعي شركائه الملزمين وحددنا البروتينات الناتجة عن طريق قياس الطيف الكتلي. الترسيب المناعي مع مضاد AT2سحب الجسم المضاد R ثلاثة نطاقات في النطاق 30 & # x0201370 & # x02005kD في MAM وجزئيًا في جزء PM (الشكل 3C). ومع ذلك ، حدد مقياس الطيف الكتلي هذه النطاقات على أنها بروتينات غير مرتبطة.

(أ). العصابات المناعية التي تم الكشف عنها بواسطة sc9040 ، rabbit AT2الأجسام المضادة R في الكسور تحت الخلوية: H-homogenate و C-cytosol و L-lysosomes و Mc-microsomes. تمت تنقية ميتوكوندريا كبد الفئران عن طريق الطرد المركزي التفاضلي (CM) وفصلها أيضًا إلى الأغشية المرتبطة بالميتوكوندريا (MAM) وأجزاء الميتوكوندريا النقية (PM) عن طريق الطرد المركزي بيركول (للحصول على التفاصيل ، انظر الطرق). من أجل التكتل المناعي ، تم استخدام نفس الغشاء كما في الشكل 2 ج. تم اقتصاص الصور لإظهار جميع النطاقات المرئية. ظهور العصابات

يمثل 15 & # x02005kD تلطيخ CoxIV. (ب). تكشف الطريقة أيضًا عن عدة نطاقات حول الوزن الجزيئي المتوقع لـ AT2R. ال AT2تم اقتصاص اللوحة R من (A). تم استخدام الوحدة الفرعية Cytochrome oxidase IV (CoxIV) كعلامة غشاء داخلي للميتوكوندريا ، من نفس الغشاء كما هو مستخدم في (A) والشكل 2C. تظهر الصور الكاملة في الشكل التكميلي S4. (ج). في2R المناعية من جميع الكسور الخلوية وعناصر تحكم IgG مفصولة بـ SDS PAGE وملطخة باللون الأزرق Coomassie. للحفاظ على سلامة IgG عند 130 & # x02005kDa ، استخدمنا مخزن تحميل مؤقت 4 & # x000d7 غير قابل للتشويه بدون dithiothreitol و & # x003b2-mercaptoethanol (200 & # x02005nM Tris HCl pH 6.8 ، 8٪ SDS ، 40٪ جلسرينول ، 0.1٪ بروموفينول أزرق ). تم تحديد ثلاثة نطاقات مناعية من جزء MAM (الدوائر الحمراء) بواسطة مطياف الكتلة على أنها بروتينات غير مرتبطة بـ RAS. تم اقتصاص الصور لإظهار جميع الفرق الموسيقية.

تؤكد هذه النتائج معًا عدم وجود مستقبلات AngII الوظيفية في ميتوكوندريا كبد الفئران ، ولكنها أثارت احتمال أن AngII داخل الخلايا قد يغير وظيفة الميتوكوندريا من خلال عمل ناهض في المستقبلات الموجودة على MAM. لذلك أجرينا مزيدًا من التجارب باستخدام الميتوكوندريا الخام المنقى (التي تحتوي على ميتوكوندريا نقية والأغشية المرتبطة بها) وقمنا بتقييم تأثير AngII على الفسفرة المؤكسدة.

يمارس AngII تثبيطًا هامشيًا على تنفس الميتوكوندريا المعزولة بتركيزات فوقية فسيولوجية

التركيزات الفسيولوجية لـ Angi في البلازما هي في نطاق picomolar ، وفقا لتقارب شبه نانومولار لمستقبلات الأنجيوتنسين على سطح الخلية. لقد وجدنا AT1Rs ذات التقارب العالي بالمثل في جزء MAM. تختلف مستويات أنسجة AngII من picomolar إلى نطاق نانومولار منخفض اعتمادًا على نوع الأنسجة وظروفها 30 ، 31 ، بينما لم يتم الإبلاغ عن أي تركيزات داخل الخلايا لـ AngII حتى الآن. وبالتالي ، قمنا بتحليل تأثير AngII على الميتوكوندريا المعزولة (جزء الميتوكوندريا الخام ، الذي يحتوي على كل من الكسور الفرعية PM و MAM) في نطاق تركيز واسع. لم يكن لتشبع AngII تأثير كبير على معدل التنفس الداخلي للميتوكوندريا القاعدية (5 إلى 25 & # x02005 دقيقة في غياب ركائز خارجية و ADP) مقارنة بعناصر التحكم (الشكل 4 أ والشكل التكميلي S2). وبالمثل ، فإن الإضافة الحادة لـ AngII ، باستخدام التركيزات في النطاق الفسيولوجي (10 & # x02013100 & # x02005nM) لم يكن لها أي تأثير على نشاط المجمعين الأول والثاني في وجود ركائز و ADP (حالة التنفس 3 ، الشكل 4B & # x02013D). أخيرًا ، قمنا بتطبيق AngII في نطاق 1 & # x02005nM-1 & # x02005 & # x003bcM لمدة 20 & # x02005min وقمنا بقياس أنشطة الحالة 3 للمجمعات I و II و IV (الشكل 4E & # x02013G). مرة أخرى ، لم تمارس AngII أي تأثير كبير على التنفس عند تطبيقها في النطاق الفسيولوجي (1 & # x02013100 & # x02005nM) ، بينما تسبب 1 & # x02005 & # x003bcM AngII في انخفاض طفيف ولكنه مهم في المعقد الأقصى الذي يحفزه ADP I- و II و IV - حالة مستقلة 3 التنفس. تشير هذه النتائج إلى أن AngII لا تمارس تأثيرًا محددًا على الفسفرة المؤكسدة في الميتوكوندريا المعزولة من كبد الفئران ، ولكنها قد تستهدف مواقع ربط غير محددة بتركيزات فوق فسيولوجية.

(أ). استهلاك الأكسجين القاعدي لميتوكوندريا كبد الفئران المعزول 5 & # x02005 دقيقة بعد النقل إلى غرفة التنفس ، وبعد 5 و 10 و 15 و 20 و 25 دقيقة بعد إضافة AngII (1 & # x02005 & # x003bcM) (ن = 18). (B & # x02013D). استهلاك الأكسجين الناجم عن ADP لميتوكوندريا كبد الفئران المعزولة للمجمعين الأول والثاني ، مع وبدون (تحكم) إضافة حادة لـ AngII بالتركيزات المحددة. يتم تلخيص البيانات على اللوحة (ب). (C) و (D) تظهر آثار تمثيلية فردية من 9 تجارب من 3 مستحضرات مستقلة. (E & # x02013G). استهلاك الأكسجين الناجم عن ADP لميتوكوندريا كبد الفئران المعزولة للمجمعات I و II و IV بعد 20 دقيقة من الحضانة مع وبدون (تحكم) AngII لمدة 20 & # x02005min (n = 9 (1 & # x02013100 & # x02005nM) n = 16 (1 & # x02005 & # x003bcM)). تمثل البيانات متوسط ​​& # x000b1SEM. التحليل الإحصائي: بالنسبة لمعدلات التنفس القاعدي ، تم تقييم الاختلافات على طول الوقت بين العينات بواسطة ANOVA للتدابير المتكررة (تفاعل المجموعة الزمنية: p & # x0003e 0.05). بالنسبة لمعدلات التنفس التي يحفزها ADP ، تم تقييم الفروق بين العينات باستخدام اختبار t للعينة المزدوجة (* p & # x0003c 0.05 AngII مقابل عناصر التحكم لمقارنات المجمعات الأول والثاني والرابع).


يحل الباحثون لغز الميتوكوندريا الذي قد يؤدي إلى علاجات جديدة للأمراض منذ عقود

الائتمان: CC0 المجال العام

نجح باحثو بن ميدسين في حل لغز عمره عقود حول جزيء رئيسي يغذي محطة توليد الطاقة في الخلايا التي يمكن استغلالها لإيجاد طرق جديدة لعلاج الأمراض ، من الاضطرابات التنكسية العصبية إلى السرطان.

الإبلاغ في دراسة جديدة نشرت اليوم في طبيعة سجية، وجد باحثون من قسم علم وظائف الأعضاء في كلية بيرلمان للطب بجامعة بنسلفانيا ومؤسسات أخرى أن الجين SLC25A51 يملي نقل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD +) ، وهو أنزيم أساسي في التمثيل الغذائي الخلوي ، إلى الميتوكوندريا ، حيث الطاقة من العناصر الغذائية يتم تحويلها إلى طاقة كيميائية للخلية. يعد انخفاض مستوى NAD + سمة مميزة للشيخوخة وقد ارتبط بأمراض مثل ضمور العضلات وفشل القلب.

قال المؤلف الكبير المشارك جوزيف أ. بور ، دكتوراه ، أستاذ مشارك في علم وظائف الأعضاء و عضو في معهد بن للسكري والسمنة والتمثيل الغذائي. "هذا الاكتشاف يفتح مجالًا جديدًا تمامًا من البحث حيث يمكننا بالفعل معالجة - استنفاد أو إضافة انتقائي - NAD + على مستوى خلوي ، الآن بعد أن عرفنا كيف يتم نقله."

Xiaolu Ang Cambronne ، دكتوراه ، أستاذ مساعد في قسم العلوم البيولوجية الجزيئية في جامعة تكساس في أوستن ، عمل كمؤلف مشارك.

يختم هذا الاكتشاف مجهولًا منذ فترة طويلة حول كيف يجد NAD + طريقه إلى مصفوفة الميتوكوندريا. تم تداول العديد من الفرضيات ، بما في ذلك فكرة أن الميتوكوندريا الثديية كانت غير قادرة على نقل NAD + ، وبدلاً من ذلك اعتمدت كليًا على تخليق NAD + داخل العضية ، ولكن في عام 2018 ، وضع مختبر باور هذه الفكرة للراحة عندما ذكرت في دراسة eLife أن الناقل كانت في الحقيقة مسؤولة.

من هناك ، بدأ الفريق بحثه عن الهوية الجينية لناقل NAD + للميتوكوندريا في الثدييات ، واستهدف العديد من الجينات ، بما في ذلك SLC25A51 ، التي كان من المتوقع أن تكون ناقلة ، لكن الوظيفة ظلت مجهولة. يقوم أفراد عائلة SLC25A بتشفير البروتينات الموضعية في الميتوكوندريا والتي تحمل المواد عبر أغشية الميتوكوندريا.

"في نهجنا ، ركزنا على الجينات التي تم تحديدها على أنها ضرورية للبقاء الخلوي. NAD + هو جزيء أساسي مطلوب للحفاظ على إنتاج الطاقة بوساطة الميتوكوندريا. وتوقعنا أن فقدان نقل NAD + للميتوكوندريا من شأنه أن يعطل الفسفرة التأكسدية وربما يقلل من بقاء الخلية "، كما قال المؤلف الرئيسي تيموثي س. لونغو ، دكتوراه ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر باور.

في التجارب المعملية ، عزل الباحثون الميتوكوندريا من الخلايا البشرية وقاسوا مستويات NAD + بعد التخلص من SLC25A51 أو الإفراط في التعبير عنه. باستخدام NAD + "أجهزة الاستشعار الحيوية" التي تستهدف الميتوكوندريا ، أظهروا أن التغيير في مستوى التعبير الجيني يتحكم في مستويات NAD + في الميتوكوندريا على وجه التحديد.

"لقد لاحظنا أن فقدان تعبير SLC25A51 قد أدى إلى تغيير كبير في قدرة الميتوكوندريا على استهلاك الأكسجين وتوليد ATP وكذلك نقل NAD + إلى المصفوفة. أيضًا ، بالتعاون مع مختبر Cambronne ، تمكنا من إثبات هذا التعبير عن SLC25A51 في الخميرة التي تفتقر إلى قال لونغو: "أعادت ناقلات NAD + للميتوكوندريا الذاتية نقل NAD + للميتوكوندريا".

يمكن استهداف مستويات NAD + في علاجات الأمراض المختلفة ، ومع ذلك ، فقد كان نهجًا شاملاً ، حيث يتم زيادة المستويات أو تقليلها في جميع أجزاء الخلية ، مما يؤدي إلى خطر حدوث تغييرات غير مقصودة في التعبير الجيني أو أنواع أخرى من التمثيل الغذائي . هذه الدراسة هي أول حالة منشورة حيث حدد الباحثون هدفًا محددًا وقللوا المستويات في الميتوكوندريا فقط دون أي أجزاء أخرى من الخلية.

يمكن أن يكون للتحكم في مستويات NAD + وبالتالي عمليات التمثيل الغذائي في الميتوكوندريا آثارًا كبيرة على دراسة وتطوير علاجات جديدة للأمراض. يمكن أن يؤدي تنشيط آلية النقل إلى جعل الخلايا تفضل حالة التنفس لتوليد الطاقة ، بدلاً من تحلل السكر. تعتمد أنواع السرطان المختلفة ، على سبيل المثال ، بشكل كبير على تحلل السكر ، لذا فإن خلق بيئة غير مواتية بدون هذا التمثيل الغذائي يمكن أن يكون إحدى الإستراتيجيات. أو ، على العكس من ذلك ، قد يكون من الممكن إنكار خلايا سرطان الجهاز التنفسي الشديدة NAD + في الميتوكوندريا ، لذا فهي مجبرة على الاعتماد على تحلل السكر. يتطلب القلب كميات وفيرة من الطاقة التي تنتجها الميتوكوندريا لتزويد الأنسجة المحيطية بالدم باستمرار. يعد الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا من العوامل الرئيسية المساهمة في قصور القلب ، لذا فإن استهداف قدرة الميتوكوندريا على نقل NAD + قد يحسن وظيفة القلب للقلب الفاشل. فيما يتعلق بالتمرين ، فإن التحول نحو التمثيل الغذائي المؤكسد يمكن أن يعزز القدرة على التحمل.

لا يزال العمل في أيامه الأولى ، ولكن تم فتح الباب لإجراء تحقيقات جديدة تتمحور حول الميتوكوندريا NAD + وهذا الجين. بعد ذلك ، سيدرس الباحثون الوظيفة الفسيولوجية لنقل NAD + وكيف يتم تنظيم هذه الآلية ، بالإضافة إلى طرق تشغيل النقل وإيقافه خارج تقليل أو زيادة التعبير الجيني.

قال باور: "إن أسلوب تغيير تجمع NAD + الخاص بالميتوكوندريا على وجه التحديد هو شيء يبحث عنه العديد من الباحثين ، لذلك أتوقع أن نرى هذا الجين مستهدفًا في العديد من الأنظمة". "أعتقد أن هذه ستكون أداة قيّمة حقًا لمساعدتنا على فهم وظيفة الميتوكوندريا NAD + وإمكاناتها العلاجية بشكل أفضل."


النتائج

لم يتم الكشف عن أي فروق بين الحضانات لجميع المعلمات المقاسة ، وبالتالي تم تجميع البيانات من الحاضنات A و B.

تنفس الميتوكوندريا

الدولة 3 م

لكلا المجمعين ، عرضت الحالة 3 أمتار نفس النمط بين الأنماط الانقسامية لـ 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية و 24 درجة مئوية (الشكل 2 أ ، ب) وكذلك بين درجات الحرارة لنوعين من الأنماط. كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين اثنين من الأنماط الانقسامية عند 18 درجة مئوية (ص= 0.0168 لبيروفات + مالات + برولين و ص& lt0.0001 من أجل sn الجلسرين -3 فوسفات) ، ساأنا أعلى من ساثالثا.

ساأظهر II زيادة طفيفة من 12 درجة مئوية إلى 24 درجة مئوية ، مع وجود اختلافات كبيرة بين 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية (ص- القيم ≤0.0201 لكلا المجمعين) ، وبين 18 درجة مئوية و 24 درجة مئوية (ص& lt0.0001 لكلا المجمعين). اكتشفنا انخفاضًا كبيرًا عند مقارنة 28 درجة مئوية مع 24 درجة مئوية (ص& lt0.0001 لكلا الأنماط). زادت الحالة 3 أمتار من المجمع الثالث بشكل ملحوظ من 18 درجة مئوية إلى 24 درجة مئوية (ص& lt0.0001) مع البقاء مشابهًا عند 24 درجة مئوية و 28 درجة مئوية (ساII) أو زيادة طفيفة ل ساالثالث (ص=0.0426).

الدولة 4o

ساكان لدى II حالة أعلى بكثير من 4 درجات ساIII عند 18 درجة مئوية (ص≤0.0021 لكلا المجمعين) و 24 درجة مئوية (ص- القيم ≤0.0123 لكلا المجمعين) ، بينما عند 12 درجة مئوية و 28 درجة مئوية ، كانت أعلى بكثير بالنسبة لـ ساالثالث (ص- القيم ≤0.0497) ولكن فقط عندما يتم توفير ركائز للمركب I (الشكل 2C ، D).

لاحظنا أيضًا فروقًا ذات دلالة إحصائية بين 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية (المركب I ، ص& lt0.0001) ، 12 درجة مئوية و 24 درجة مئوية (ص& lt0.0001 لكلا المجمعين) ، وبين 18 درجة مئوية و 24 درجة مئوية (ص- القيم ≤0.0011 لكلا المجمعين) في ساII. عند 28 درجة مئوية ، لوحظ انخفاض كبير نسبيًا مع 24 درجة مئوية للمركب I in ساالثاني (ص=0.0002).

في سازادت الحالة الثالثة 4o للمركب I بشكل كبير من 12 درجة مئوية إلى 28 درجة مئوية بينما في المجمع الثالث انخفضت بين 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية (ص= 0.0106) وزادت بين 18 درجة مئوية و 24 درجة مئوية و 28 درجة مئوية (الشكل 2 ج ، د).

نسب ADP / O

عند استخدام ركائز للمركب I (الشكل 2E) ، كان هناك فرق إحصائي بين الخطين عند 12 درجة مئوية ، مع نسبة ADP / O أعلى لـ ساII ميتوتايب (ص= 0.0003). بين درجات الحرارة ، ساالثاني و ساأظهر III اختلافات كبيرة ، مع نسبة ADP / O أعلى عند 24 درجة مئوية مقارنة بـ 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية و 28 درجة مئوية (جميع ص- القيم ≤0.0002).

بالنسبة للمجمع III (الشكل 2F) ، حدث الفرق المهم الوحيد بين الأنماط الانقسامية عند 28 درجة مئوية ، مع ساالثالث هو أقل (ص= 0.0093). من بين درجات الحرارة ، لم يتم الكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية ساالثاني حين ساأظهرت III زيادات كبيرة عند 18 درجة مئوية و 24 درجة مئوية مقارنة بـ 12 درجة مئوية (ص- قيم ≤0.0054) ومع 28 درجة مئوية (ص- القيم ≤0.0026).

RCRs و UCRs

يتم عرض نتائج RCRs في الشكل 3. أظهرت المقارنات بين الأنماط الانقسامية وجود سجلات RCR أعلى بكثير من أجل ساII عند 12 درجة مئوية في المستوى المعقد الأول (ص= 0.0231) ، وكذلك عند 28 درجة مئوية عند المستوى المركب الثالث (ص= 0.0143). والمثير للدهشة أن RCR لـ ساكان الثاني أقل بكثير من ساالثالث عند 24 درجة مئوية (ص= 0.0292) عندما تم توفير الركائز للمركب الأول.

في كلا النوعين ، لم تكن RCRs للمركب I مختلفة بين 18 درجة مئوية و 28 درجة مئوية ولكن كلاهما كان أعلى بشكل ملحوظ عند 12 درجة مئوية (ص- القيم ≤0.0309 لكل من الأنماط المتوسطة) و 24 درجة مئوية (ص- القيم ≤0.0139 لكلا النوعين من الأنماط). علاوة على ذلك ، كان RCR عند 12 درجة مئوية أعلى من 24 درجة مئوية لـ ساالثاني (ص= 0.0238) ، بينما لاحظنا الاتجاه المعاكس لـ ساالثالث (ص= 0.0043). لاحظنا زيادات طفيفة ولكنها مهمة من 12 درجة مئوية إلى 28 درجة مئوية على المستوى الثالث المعقد. نتائج UCRs موضحة في الجدول 2. لم يتم الكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية في UCRs بين السلالات أو بين درجات الحرارة.

القياسات الأنزيمية

لم يتم الكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية بين الأنماط الانقسامية (الشكل 4 أ) في نشاط ACO في أي درجة حرارة ، مما يشير إلى عدم وجود فروق في الإجهاد التأكسدي المدعوم بكل من هذه الخطوط ، على الأقل في الميتوكوندريا. ينعكس هذا من خلال عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين كلا الأنماط الانقسامية في مستويات MDA (البيانات غير معروضة).

تقاس وظائف الميتوكوندريا عند أربع درجات حرارة مختلفة في الميتوكوندريا المعزولة من نمطي الانقسام سيمولانس ذبابة الفاكهة سأناالثاني و sأناثالثا. حالة 3 التنفس مع ركائز (أ) معقدة أنا (بيروفات + مالات + برولين) و (ب) sn حالة الجلسرين -3 فوسفات 4 مع مثبط أوليجوميسين عند مستوى (C) معقد 1 و (D) معقد III ADP / O محسوب من (E) المركب I و (F) المركب III. النتائج تعني ± sd. لمدة 10 مستحضرات الميتوكوندريا. تم تعيين الأهمية كما صالعلامة & lt0.05 * تشير إلى الاختلافات بين الحروف الأنماط الخفية التي تشير إلى الاختلافات بين درجات الحرارة مع اختلاف إحصائي عن b و c ، و b يختلف إحصائيًا عن c.

تقاس وظائف الميتوكوندريا عند أربع درجات حرارة مختلفة في الميتوكوندريا المعزولة من نمطي الانقسام سيمولانس ذبابة الفاكهة سأناالثاني و sأناثالثا. حالة 3 التنفس مع ركائز (أ) معقدة أنا (بيروفات + مالات + برولين) و (ب) sn حالة الجلسرين -3 فوسفات 4 مع مثبط أوليجوميسين عند مستوى (C) معقد 1 و (D) معقد III ADP / O محسوب من (E) المركب I و (F) المركب III. النتائج تعني ± sd. لمدة 10 مستحضرات الميتوكوندريا. تم تعيين الأهمية كما صالعلامة & lt0.05 * تشير إلى الاختلافات بين الحروف الأنماط الخفية التي تشير إلى الاختلافات بين درجات الحرارة مع اختلاف إحصائي عن b و c ، و b يختلف إحصائيًا عن c.

كان نشاط COX أعلى بشكل ملحوظ بالنسبة لـ ساIII فقط عند 12 درجة مئوية (ص& lt0.0001 الشكل 4 ب). علاوة على ذلك ، لاحظنا زيادة طفيفة من 12 درجة مئوية إلى 28 درجة مئوية لكلا النوعين مع وجود اختلافات كبيرة بين 12 درجة مئوية و 18 درجة مئوية و 24 درجة مئوية و 28 درجة مئوية.

عند 18 درجة مئوية ، كان نشاط CAT أعلى في ساأنا مقارنة مع ساالثالث (ص= 0.0116) بينما كانت أقل عند 28 درجة مئوية (ص= 0.0005) (الشكل 4 ج).

قدرة COX الزائدة والتحكم في التمثيل الغذائي للتدفق

نشاط IV المركب وتنفس الميتوكوندريا مع البيروفات ، malate ، l -proline و sn تم تثبيط الجلسرين -3 فوسفات بواسطة أزيد الصوديوم. قمنا بفحص السعة الزائدة الظاهرية لـ COX عند التدفق العالي من خلال ETS باستخدام مجموعة من الركائز التي تقلل إلى أقصى حد من المجمعات I و III. أدت معايرة أزيد إلى تثبيط زائدي لـ COX. تعرض مخططات العتبة تدفق المسار كدالة لنشاط COX ، ويتم تعريف عتبة تثبيط COX على أنها تقاطع المنحدر الأولي مع الملاءمة الخطية للمنحدر النهائي (الشكل 5). السعة الزائدة الظاهرية لـ COX هي اعتراض استقراء الانحدار الخطي للمنحدر النهائي مع المحور عند تثبيط كوكس صفر. اكتشفنا عتبة ، وبالتالي ، سعة زائدة من COX عند 12 درجة مئوية مع عدم وجود تمييز بين الأنماط الانقسامية (604٪ ، ص 2 = 0.9139 من أجل ساالثاني و 613٪ ، ص 2 = 0.9301 من أجل ساالثالث).

والمثير للدهشة ، أنه مع زيادة درجات الحرارة ، اختفت السعة الزائدة من COX وتم إجراء مقارنات بين مختلف كأنا و جأنا. لاحظنا زيادة كأنا مع درجات حرارة متزايدة ولكن لا توجد فروق بين الأنماط الانقسامية تم الكشف عنها (الجدول 1).


شاهد الفيديو: تحديد مؤشرات جهاز التنفس لمريض مع متلازمة ضيق النفس الحاد ARDS (شهر نوفمبر 2022).