معلومة

الحالة الحالية لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشر

الحالة الحالية لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشر


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

سألني أحد الزملاء مؤخرًا عما إذا كان من الممكن ترتيب تسلسل الرنا المرسال مباشرة. لقد وجدت ورقة الطبيعة هذه[1] نشرته شركة Helicos في عام 2009 ، حيث وصفوا تطوراتهم في المنطقة. لقد مرت عدة سنوات منذ نشر هذا ، ومع ذلك لا يزال تحليل RNAseq ومعظم التحاليل الترانسكريبتومية الأخرى تتم عن طريق النسخ العكسي للـ RNA إلى الحمض النووي التكميلي.

ما هي الحالة الحالية لتسلسل الحمض النووي الريبي؟ هل فشلت Helicos في تقديم تقنيتها؟ هل ارتقت أي منصات أخرى إلى مستوى التحدي (أو حاولت القيام بذلك)؟ أم أن التكنولوجيا ناجحة في الإنتاج وما زالت طغت عليها التبني الواسع لأساليب التسلسل التقليدية القائمة على cDNA؟


Ozsolak F ، بلات AR ، جونز DR ، Reifenberger JG ، Sass LE ، McInerney P ، Thompson JF ، Bowers J ، Jarosz M ، Milos PM. 2009. تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر. الطبيعة ، 461 ، 814-818 ، دوى: 10.1038 / nature08390.


توقفت شركة Helicos عن شحن الكواشف بين عامي 2010 و 2011 ، حيث لم تتمكن من منافسة شركة Illumina. في الوقت الحالي ، يبدو أن النسخ العكسي -> cDNA المتسلسل Illumina أرخص بكثير من أي خيار آخر ، هذه هي الطريقة السائدة.

ناقش أكسفورد نانوبور التنميط المباشر للحمض النووي الريبي ، لكن للأسف لم يتم شحن منتجهم الأول (للحمض النووي أو غيره) ، ولم يصدروا بيانات حتى ، فقد يستغرق الأمر وقتًا طويلاً.


كانت هناك ورقة صدرت للتو في موقع تسلسل الحمض النووي الريبي ، ولكن في الوقت الحالي ، فإن حد التسلسل الذي تم الحصول عليه هو 4 نقاط أساس. ومع ذلك ، فهي تقنية رائعة وإذا تم تطويرها يمكن أن تكون مفيدة في خلية واحدة RNA-seq ، دون الحاجة إلى تضخيم أو إعداد مكتبة

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23852452


تسلسل مرنا

يكتشف mRNA-Seq النصوص المعروفة والجديدة ويقيس وفرة النسخ لتحليل دقيق وشامل

مقدمة لتسلسل الرنا المرسال

أصبح تسلسل الرنا المرسال (mRNA-Seq) سريعًا الطريقة المفضلة لتحليل النسخ النصية للحالات المرضية والعمليات البيولوجية وعبر مجموعة واسعة من تصاميم الدراسة. بالإضافة إلى كونها وسيلة حساسة ودقيقة للغاية لقياس التعبير الجيني ، يمكن لـ mRNA-Seq تحديد كل من الأشكال الإسوية المعروفة والجديدة للنسخ ، والاندماج الجيني ، والميزات الأخرى بالإضافة إلى التعبير الخاص بالأليل. يقدم mRNA-Seq عرضًا كاملاً لنسخة الترميز غير المقيدة بواسطة مرشح المعرفة السابقة.

مرنا-تسلسل في 3 خطوات بسيطة

تحليل نسخة الترميز في عينات mRNA القياسية باستخدام حل سير العمل السلس هذا.

مزايا تسلسل الرنا المرسال

يوفر mRNA-Seq عددًا من المزايا على مصفوفات التعبير الجيني في تحليل النسخ.

  • يوفر نطاقًا ديناميكيًا أوسع ، مما يتيح قياسًا أكثر حساسية ودقة لتغييرات الطية في التعبير الجيني
  • يلتقط كلاً من الميزات المعروفة والجديدة
  • يمكن تطبيقها على نطاق واسع من الأنواع
الانتقال من المصفوفات إلى mRNA-Seq

طور تحليل التعبير أدوات لتسهيل مقارنة نتائج mRNA-Seq ببيانات الصفيف السابقة.

عرض دقيق وعالي الدقة للنسخة

ضغط النسبة هو قيد تقني راسخ لمصفوفات التعبير الجيني الذي يقلل من النطاق الديناميكي ويمكن أن يخفي أو يغير تغييرات النسخ المقاسة. 1-3 في المقابل ، لا يخضع mRNA-Seq لهذا التحيز ويوفر قياسات أكثر شمولاً ودقة لتغيرات التعبير الجيني.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر mRNA-Seq معلومات حبلا ، والتي تتيح الكشف عن التعبير المضاد للتعبير ، وتسمح بتقدير أكثر دقة للنصوص المتداخلة ، وتزيد النسبة المئوية للقراءات القابلة للمحاذاة.

التوحد و mRNA-Seq

ستانلي لابيدوس ، الرئيس والمدير التنفيذي ومؤسس SynapDx ، يناقش كيف تستخدم الشركة mRNA-Seq لدراسة مرض التوحد.

Faucibus ornare suspendisse sed nisi
استكشف أنظمة NextSeq 1000 و 2000

مع أكثر من 75 ابتكارًا مبتكرًا ، توفر أنظمة التسلسل هذه أجهزة جافة ، وإعداد تشغيل أسهل ، وتحليل ثانوي سريع مع برنامج DRAGEN المدمج. جرب أبسط تدفقات العمل لدينا حتى الآن ، وقم بتنفيذ مجموعة واسعة من تطبيقات التسلسل الناشئة والمتوسطة الإنتاجية.

سير عمل mRNA-Seq الموصى به للعينات القياسية

مكتبة الاعدادية
Illumina الذين تقطعت بهم السبل مرنا الإعدادية

حل بسيط وقابل للتطوير وفعال من حيث التكلفة وسريع ليوم واحد لتحليل نسخة الترميز التي تزيد من إدخال 25 نانوغرام من الحمض النووي الريبي القياسي (غير المتدهور).

التسلسل
NextSeq 1000 & amp 2000 Systems

تدعم أجهزة التسلسل الفوقية منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام ومتوسطة الإنتاجية mRNA-Seq بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من التطبيقات الحالية والناشئة الأخرى.

تحليل البيانات
خط أنابيب DRAGEN RNA

يقوم بالمحاذاة والقياس الكمي واكتشاف الاندماج.

التعبير التفاضلي RNA-Seq

تمكن من تحليل التعبير الجيني التفاضلي.

مقالات تسلسل mRNA مميزة

رسم خرائط التنوع العصبي

يستخدم باحثو معهد ألين mRNA-Seq لتحليل التعبير الجيني في الخلايا العصبية الفردية وتصنيف الخلايا العصبية V1.

تحليل الخلية الواحدة في علم الأحياء التنموي

يناقش الدكتور كولين ترابنيل تجربة مختبره مع خلية أحادية الخلية mRNA-Seq وجهوده لإتاحة أدوات المعلوماتية الحيوية للجميع.

اعتبارات تسلسل الحمض النووي الريبي

تعرف على متطلبات طول وعمق القراءة لـ RNA-Seq وابحث عن الموارد للمساعدة في التصميم التجريبي.

مكتبة التسلسل mRNA الإعدادية

تحديد التعبير الجيني ، وتحديد الأشكال الإسوية المعروفة والجديدة في نسخة الترميز ، واكتشاف اندماج الجينات ، وقياس التعبير الخاص بالأليل من خلال حلول إعداد مكتبة RNA-Seq المحسّنة.

سير عمل مرنا-تسلسل شامل

تسلسل Illumina بواسطة كيمياء التوليف (SBS) هو أكثر تقنيات NGS اعتمادًا ، حيث ينتج ما يقرب من 90٪ من بيانات التسلسل العالمية. *

بالإضافة إلى جودة البيانات الرائدة في الصناعة ، تقدم Illumina تدفقات عمل mRNA-Seq المتكاملة التي تبسط العملية برمتها ، من إعداد المكتبة إلى تحليل البيانات والتفسير البيولوجي.

Illumina الذين تقطعت بهم السبل مرنا الإعدادية

حل بسيط وقابل للتطوير وفعال من حيث التكلفة وسريع ليوم واحد لتحليل نسخة الترميز التي تزيد من إدخال 25 نانوغرام من الحمض النووي الريبي القياسي (غير المتدهور).

إعداد Illumina RNA مع التخصيب

حقق استجوابًا سريعًا وموجهًا لعدد كبير من الجينات المستهدفة مع كفاءة التقاط استثنائية وتوحيد التغطية.

اعثر على مجموعة أدوات إعداد المكتبة المناسبة

استخدم هذه الأداة لتحديد أفضل مجموعة لاحتياجاتك.

نظام MiSeq

السرعة والبساطة للتطبيقات المركزة ، تسلسل عينة واحدة من الرنا المرسال لكل تشغيل.

نظام NextSeq 550

جهاز تسلسل سطح مكتب مرن يدعم تطبيقات متعددة ، مما يتيح تسلسل 5-16 عينة mRNA في تشغيل واحد.

NextSeq 1000 & amp 2000 Systems

توفر أجهزة التسلسل الفوقية منخفضة التكلفة وسهلة الاستخدام ومتوسطة الإنتاجية مرونة فائقة لدعم التطبيقات الجديدة والناشئة.

نظام NovaSeq 6000

إنتاجية ومرونة قابلة للتطوير لأي جينوم أو طريقة تسلسل أو نطاق للمشروع تقريبًا.

أداة مقارنة المنصات

قارن بين أنظمة التسلسل وحدد أفضل نظام لمختبرك وتطبيقاتك.

الكواشف المتسلسلة

ابحث عن مجموعات تتضمن كواشف تسلسلية و / أو خلايا تدفق و / أو مخازن مؤقتة مصممة لكل نظام تسلسل من أنظمة Illumina.

خط أنابيب DRAGEN RNA

يقوم بالمحاذاة والقياس الكمي واكتشاف الاندماج.

التعبير التفاضلي RNA-Seq

تمكن من تحليل التعبير الجيني التفاضلي.

تطبيق RNA-Seq Alignment

يقرأ محاذاة RNA-Seq. يقيس التعبير الجيني ، ويستدعي المتغيرات الصغيرة واندماج الجينات ، ويوفر مدخلات لتطبيقات التعبير التفاضلي.

منصة Illumina DRAGEN Bio-IT

توفر منصة تكنولوجيا المعلومات الحيوية من Illumina DRAGEN (تحليل القراءة الديناميكي للجينومكس) تحليلًا ثانويًا فائق السرعة لبيانات NGS. تتوفر مجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك أحد التطبيقات المصممة لتمكين دراسات الاندماج الجيني.

نظام مسار جينوماتكس (GePS)

يربط جينًا منفردًا أو قائمة جينات ببيانات الشرح للمسارات والأمراض والأنسجة والجزيئات الصغيرة.

دليل iPathway

التعبير الجيني التفاضلي والتفاعل الدوائي وتحليل المرض.

مركز تسلسل BaseSpace

بيئة الحوسبة لجينوم Illumina لتحليل وإدارة بيانات NGS.

محرك ارتباط BaseSpace

مكتبة متنامية من البيانات الجينومية المنسقة لدعم الباحثين في تحديد آليات المرض ، وأهداف الأدوية ، والمؤشرات الحيوية.

الحلول ذات الصلة

RNA-Seq في أبحاث السرطان

يمكن أن تساعد مراقبة تغيرات التعبير الجيني باستخدام mRNA-Seq الباحثين في تحديد المؤشرات الحيوية التي تنبئ بتنبؤ المرض أو الاستجابة للعلاج. تعرف على المزيد حول سرطان RNA-Seq.

تحليل التعبير الجيني لدراسات المرض

يمكن أن توفر دراسات التنميط الجيني القائمة على RNA-Seq رؤية لكيفية مساهمة العوامل الوراثية والبيئية في مجموعة واسعة من الأمراض. تعلم المزيد عن التنميط التعبير الجيني.

اكتشاف العلامات الحيوية للاستجابة لعقاقير الحمض النووي الريبي

تعرف على كيفية استخدام RNA-Seq لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة للاستجابة للأدوية القائمة على الحمض النووي الريبي. الوصول إلى الموارد المصممة لمساعدة المستخدمين الجدد على اعتماد هذا التطبيق. تعرف على المزيد حول تحليل العلامات الحيوية RNA للاستجابة للأدوية.

هل أنت مهتم بتلقي النشرات الإخبارية ودراسات الحالة والمعلومات حول طرق التسلسل؟

مصادر إضافية

دليل الطرق

كل المعلومات التي تحتاجها ، من BeadChips إلى إعداد المكتبة إلى اختيار منظم التسلسل والتحليل. استخدم هذا الدليل لتحديد أفضل الأدوات لمختبرك.

خلية واحدة مرنا تسلسل

تناقش الدكتورة نورما نيف كيف يستخدم الباحثون في جامعة ستانفورد خلية واحدة mRNA-Seq لفهم التطور المبكر.

تحليل بيانات RNA-Seq

تعمل أدوات البرامج سهلة الاستخدام على تبسيط تحليل بيانات RNA-Seq لعلماء الأحياء ، بغض النظر عن خبرة المعلوماتية الحيوية.

RNA-Seq لدراسات التعبير الجيني

تقدم Illumina سير عمل متكامل من mRNA-Seq لفهم أعمق لعلم الأحياء.

تسلسل الحمض النووي الريبي للعينات منخفضة الجودة و FFPE

تقدم RNA-Seq للعينات الثابتة بالفورمالين والمدمجة بالبارافين (FFPE) والعينات الأخرى منخفضة الجودة رؤى قيمة لأبحاث الأمراض.

يقترن نهاية RNA-Seq

جميع أنظمة تسلسل Illumina قادرة على التسلسل المزدوج ، مما يسهل اكتشاف نسخ RNA الجديدة ، والاندماج الجيني ، والمزيد.

مراجع
  1. شي إل ، تونج دبليو ، سو زد ، إت آل. منحنيات معايرة الماسح الضوئي ميكروأري: الخصائص والآثار.المعلوماتية الحيوية BMC. 20056 ملحق 2: S11.
  2. Naef F ، Socci ND ، Magnasco M. دراسة الدقة والدقة في مصفوفات قليلة النوكليوتيد: استخراج المزيد من الإشارات بتركيزات كبيرة.المعلوماتية الحيوية. 200319:178-184.
  3. يوين تي ، ورمباخ إي ، بفيفير آر إل ، إبيرسول بج ، سيلفون إس سي. دقة ومعايرة قليل النوكليوتيد التجاري والمصفوفات الدقيقة (كدنا) المخصصة.الدقة الأحماض النووية. 200230: e48.

* حسابات البيانات في الملف. Illumina، Inc. ، 2015

للاستخدام البحثي فقط

ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص باستثناء ما هو مذكور على وجه التحديد.

تقنيات مبتكرة

هدفنا في Illumina هو تطبيق تقنيات مبتكرة لتحليل التباين الجيني والوظيفة ، مما يجعل الدراسات الممكنة التي لم يكن من الممكن تخيلها حتى قبل بضع سنوات فقط. من المهم بالنسبة لنا تقديم حلول مبتكرة ومرنة وقابلة للتطوير لتلبية احتياجات عملائنا. بصفتنا شركة عالمية تضع قيمة عالية للتفاعلات التعاونية ، والتسليم السريع للحلول ، وتوفير أعلى مستوى من الجودة ، فإننا نسعى جاهدين لمواجهة هذا التحدي. تعمل تقنيات التسلسل والصفيف المبتكرة من Illumina على تعزيز التقدم الرائد في أبحاث علوم الحياة ، والجينوميات الانتقالية والمستهلكين ، والتشخيص الجزيئي.


التحقق البيولوجي من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من الأورام الميلانينية الأولية المثبتة بالفورمالين

أنتجت مبادرات مثل أطلس جينوم السرطان والاتحاد الدولي لجينوم السرطان بيانات جزيئية متعددة المنصات عالية الجودة من آلاف عينات الورم المجمدة. على الرغم من أن هذه المبادرات قدمت نظرة ثاقبة في بيولوجيا السرطان ، إلا أن هناك موردًا محتملاً هائلاً لا يزال غير مستغل إلى حد كبير في عينات الفورمالين الثابتة والمدمجة بالبارافين (FFPE) والتي تكون متاحة بسهولة أكبر ولكنها يمكن أن تمثل تحديات تقنية بسبب الارتباط المتشابك للجزيئات الهشة مثل الحمض النووي الريبي. .

استخرجنا الحمض النووي الريبي من الأورام الميلانينية الأولية FFPE وقمنا بتقييم منصتين للتعبير الجيني - تسلسل الحمض النووي الريبي على مستوى الجينوم وسلسلة النانو المستهدفة - لقدرتهما على توليد إشارات بيولوجية متماسكة. للقيام بذلك ، أنشأنا نهجًا محسنًا لتحديد مسارات التعبير الجيني. لقد صقلنا درجات المسار من خلال تعيين الجينات الموجهة بالارتباط. نجري أيضًا مقارنات مع أطلس جينوم السرطان ومجموعات بيانات سرطان الجلد الأخرى المتاحة للجمهور.

أكدت مقارنة أنماط التعبير الجيني ببعضها البعض ، مع الوحدات البيولوجية الراسخة ، والبيانات السريرية والكيميائية المناعية دقة الإشارات البيولوجية من كلا النظامين باستخدام عينات FFPE لبيولوجيا معروفة. علاوة على ذلك ، كانت الارتباطات مع بيانات نتائج المريض متوافقة مع الدراسات السابقة القائمة على الأنسجة المجمدة.

تمثل عينات FFPE من أنواع السرطان التي كان يصعب الوصول إليها سابقًا ، مثل الأورام الميلانينية الأولية الصغيرة ، مصدرًا قيمًا وغير مستغَل سابقًا لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي ومنصات NanoString. يوفر هذا العمل خطوة مهمة نحو استخدام مثل هذه المنصات لإطلاق الأسس الجزيئية الجديدة وإبلاغ القرارات السريرية المستقبلية المدفوعة بيولوجيًا.

لقد أدى تسلسل الحمض النووي الريبي للنسخة الكاملة (RNA-seq) إلى تحسين دقة ودقة وشمولية تقييم الحمض النووي الريبي العالمي مقارنةً بتكنولوجيا ميكروأري للتعبير الجيني. بالإضافة إلى توفير تقييم عالي الجودة ، لا سيما الجينات منخفضة التعبير ، فهو غير مقيد بقيود التهجين ، مما يعني أنه يمكن أيضًا تقييم microRNAs و RNAs غير المشفرة ، بالإضافة إلى الأشكال الإسوية الجينية المتعددة ، وتقاطعات exon-exon ، وجينات الاندماج. علاوة على ذلك ، يوفر RNA-seq قياسات موحدة عبر الجينات ، في حين أن تقنية التهجين يمكن أن تعاني من جودة التحقيق الفردية غير المتكافئة. لذلك ، يمكن الآن مقارنة التعبير الجيني بشكل أكثر دقة عبر الجينات والأشكال الإسوية. RNA-seq هو أيضًا أقل عرضة للتأثيرات المجمعة. تم الاستفادة من هذه المزايا بشكل كبير في الجهود واسعة النطاق مثل أطلس جينوم السرطان (TCGA) 1 والاتحاد الدولي لجينوم السرطان ، 2 حيث تم تقييم آلاف العينات معًا بثقة ودقة عاليتين.

كان أحد قيود تنفيذ تقنية RNA-seq حتى الآن هو الحاجة إلى التحليلات المحضرة من الأنسجة المجمدة. 3 العينات المثبتة بالفورمالين والمدمجة بالبارافين (FFPE) أكثر وفرة ولكنها أيضًا أكثر عرضة لتفتيت الحمض النووي والتدهور العام للعينة ، مما يجعل استخراج الحمض النووي الريبي المحفوظ جيدًا للتسلسل تحديًا صعبًا. 4 ومع ذلك ، إذا كان من الممكن تحسين بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المشتقة من FFPE وتوحيدها ، فسيؤدي ذلك إلى زيادة عدد الكائنات الحية المتاحة بشكل كبير وتبسيط معالجة العينات. علاوة على ذلك ، في العديد من أنواع السرطان ، قد يؤدي قصر التحليلات على الأنسجة المجمدة فقط إلى انحراف العينات نحو ، على سبيل المثال ، الأورام القابلة للاستئصال جراحيًا و / أو الأورام الضخمة ، مما يؤدي إلى تحيز عينة من السكان عن طريق الاختيار. قد يؤدي استخدام عينات FFPE التي تم جمعها بسهولة إلى تقليل تحيزات العينة وتوسيع إمكانية جمع العينات الطولية. أخيرًا ، تكون عينات FFPE أسهل من الناحية الفنية في التعامل ، خاصة إذا كانت مناطق معينة ذات أهمية سيتم تشريحها مجهريًا من الشرائح. تقدم الأورام الميلانينية الأولية توضيحًا غنيًا لهذه المبادئ المهمة. في مجموعة بيانات الورم الميلانيني TCGA ، التي استخدمت عينات مجمدة فقط ، كانت الأورام الميلانينية الأولية منحرفة بشدة نحو الأورام السميكة جدًا (متوسط ​​سمك الورم ، 11 ملم) التي تتوافق مع اللجنة الأمريكية المشتركة للورم الأولي للسرطان T4. 1،5،6 على النقيض من ذلك ، فإن الغالبية العظمى من الأورام الميلانينية الجلدية التي تم تشخيصها في الولايات المتحدة لها سمك ورم 4 مم ، معظمها 1 مم ، وجميعها تخضع بشكل عام لمعالجة FFPE لأغراض التشخيص. سمك الورم هو مؤشر راسخ ومستقل للنتائج السريرية للورم الميلانيني وعامل الورم الأساسي الرئيسي لاتخاذ قرار العلاج 6 ، وبالتالي ، فإن عدم وجود الأورام الميلانينية الأولية الأرق والأكثر صلة سريريًا في مجموعة بيانات TCGA يحد من الفهم الجزيئي الكامل للمرض و الترجمة الممكنة المثلى للعيادة. توفر عينات FFPE الفرصة لتضمين الأورام عبر جميع سماكات الورم في مجموعات بيانات RNA-seq ، والتي نثبت جدواها في هذه الدراسة.

حتى الآن ، قامت 10 دراسات فقط بتقييم الجدوى التكنولوجية لـ RNA-seq على نطاق الترنسكريبتوم من التحليلات المعدة من أنسجة الورم البشرية FFPE. 7-17 على الرغم من أن هذه الدراسات أجرت ضوابط جودة تقنية للبيانات ، بما في ذلك المقارنة المباشرة للمجمدة و FFPE من نفس العينات ، 7 -10 ، 15 فإن مسألة ما إذا كانت البيانات تعكس بدقة البيولوجيا الأساسية تعتمد بشكل أساسي على اكتشاف الاختلافات الكبيرة بين أي منهما الأنسجة الطبيعية والورم 8 أو بين الأنواع الفرعية الورمية المميزة نسبيًا ، 8-14 ، 16 تاركًا سؤال الإخلاص مفتوحًا لمزيد من الاختلافات الدقيقة في التعبير الجيني بين الأورام. لذلك ، كان الهدف من الدراسة الحالية هو إنشاء مناهج ذات صلة بيولوجيًا للتحقق من صحة بيانات التعبير الجيني FFPE. باستخدام 38 عينة أولية من سرطان الجلد ، نظهر ، من خلال طرق متعددة ، أن RNA-seq قادر على إنتاج بيانات التعبير الجيني الصالحة من عينات FFPE الأرشيفية بدقة كافية لتحديد الاختلافات ذات الصلة بيولوجيًا على مستوى المسار بين الأورام.

تم اختيار المرضى من مركز سرطان الجلد التابع لجامعة تكساس إم دي أندرسون ، والمعلوماتية السريرية ، وموارد الأنسجة ، وقاعدة البيانات الأساسية لعلم الأمراض الانتقالية وفقًا لمعايير محددة (ملحق البيانات). تم تضييق الفوج الناتج (N = 357) إلى مجموعة تجريبية من 38 مريضًا. للحصول على معلومات كاملة عن المريض ، راجع ملحق البيانات.

تم استخدام مجموعة عزل miRNA عالية النقاء (روش ، بازل ، سويسرا) لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وتم استخدام عمود Zymo-Spin (Zymo Research ، Irvine ، CA) لإزالة الميلانين من جميع العينات ، بغض النظر عن محتوى الميلانين ، من أجل الاتساق. تم إجراء تسلسل كامل exome ، RNA-seq ، واثنين من لوحات التعبير الجيني NanoString (NanoString Technologies ، سياتل ، واشنطن). تم الإبلاغ عن تفاصيل إضافية ، بما في ذلك مقاييس تشغيل RNAseq ، في ملحق البيانات.

أجرينا تقييمًا مرضيًا لتحديد مساحة سطح الورم قبل استخراج الحمض النووي الريبي ، واستخدمنا هذا للتنبؤ بالعدد المطلوب من شرائح 10 ميكرومتر للحصول على الحد الأدنى من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل حالة مطلوبة. تتوفر آلة حاسبة عبر الإنترنت على http://odin.mdacc.tmc.edu/

يعتمد نهجنا الجزئي التكراري لتوليد درجات المسار على جودة مجموعة جينات الإدخال الأولية. إنها تضع افتراضين: الجينات شديدة الارتباط تمثل إلى حد كبير الوظائف البيولوجية المشتركة ، وتحتوي مجموعات جينات الإدخال عالية الجودة على إشارة قوية بما فيه الكفاية من جينات "علم الأحياء الحقيقي" بحيث عندما يتم حساب الدرجة الأولية الأولية (الشكل 1 أ) ، فإن إشارة البيولوجيا الحقيقية سوف تخرج من الضوضاء (الشكلان 1 ب و 1 ج). لذلك ، فإن اختيار مجموعة جينات الإدخال المناسبة أمر بالغ الأهمية.لقد قدمنا ​​برنامج R "it.r" ودليله وطرق إضافية ومبررات في ملحق البيانات.

الشكل 1. إعادة تعيين تكرارية لمجموعات الجينات لتحديد أعلى الجينات المرتبطة. (أ) رسم تخطيطي للخوارزمية. يتم عرض مجموعة الجينات المناعية لأطلس جينوم السرطان (TCGA) كممثل. تتوقف الخوارزمية عندما يساوي متوسط ​​التكرار النهائي متوسط ​​التكرار السابق ، وبذلك يكون قد وصل إلى النقطة الثابتة. يصبح هذا الوسيط النهائي هو نتيجة المسار. يشير المربع البرتقالي إلى الجينات "الفرعية" النهائية التي تحدد الدرجة. (ب) قيم التكرار الوسيطة لمجموعة الجينات المناعية TCGA. التكرار 3 يساوي التكرار 2 وبالتالي لا يظهر. (ج) قيم التكرار الوسيطة لمجموعة الجينات الصباغية TCGA. (د) مجموعة الجينات المناعية النهائية ، بيانات TCGA. (هـ) مجموعة الجينات الصباغية النهائية ، بيانات TCGA.

استخرجنا الحمض النووي الريبي من 38 عينة خزعة من FFPE من سرطان الجلد الأولي ، تم اختيارها على أساس النتيجة السريرية النهائية (الجدول 1). تم تحضير قسامات الحمض النووي الريبي من كل عينة ، وتمت معالجة التحليلات لتسلسل الحمض النووي الريبي على نطاق النسخ ولوحة منصة NanoString المخصصة والمخصبة بالمناعة (ملحق بيانات الشكل 2A).

الجدول 1. خصائص مرض المريض المصنفة حسب حالة تكرار المرض لعينات الدراسة المقابلة (العدد = 38)

الشكل 2. تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) و NanoString مقارنة بشكل إيجابي على نفس العينات. (أ) رسم تخطيطي لسير عمل معالجة العينة. (ب) قيم ارتباط سبيرمان لجميع الجينات البالغ عددها 1،362 المشتركة بواسطة مجموعات بيانات RNA-seq و NanoString ، بالإضافة إلى التقسيم الطبقي حسب التعبير والنطاق الديناميكي. تم تعيين المجسات ذات التعبير المنخفض إلى فئة "التعبير المنخفض" حتى لو كان لديهم نطاق ديناميكي منخفض. طالب ر تم إجراء الاختبار للفئات غير المتداخلة. (*)ص & LT .001. (ج) الجينات ذات الارتباط العالي والضعيف بين المنصات ، المقدمة كخريطة حرارة لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. (D) متوسط ​​الانحراف المطلق مقسومًا على الوسيط (MAD / M) ، وهو قياس النطاق الديناميكي ، لبيانات RNA-seq. كل نقطة هي جين يقابل واحد في (ج). متوسط ​​الارتباط ، متوسط ​​الارتباط.

قمنا أولاً بمقارنة مجموعات البيانات FFPE ، RNA-seq المتطابقة المشتقة من تحليل الحمض النووي الريبي ، ومجموعات البيانات NanoString على أساس مباشر وجين تلو الآخر. من بين 1،362 جينًا مشتركًا بواسطة كلا النظامين ، 924 (68 ٪) كان لها قيمة ارتباط سبيرمان ρ & gt 0.5 (الشكل 2 ب). في البداية ، بدا أن هذا يشير إلى وجود علاقة عامة محدودة بين المنصات ، لكننا استنتجنا أن بعض الجينات قد يبدو أنها ترتبط ارتباطًا ضعيفًا لأسباب لا علاقة لها بالإخلاص عبر الأنظمة الأساسية. لذلك ، سألنا بعد ذلك عن الخصائص التي تفصل بين الجينات الأكثر ارتباطًا (ρ & gt 0.8) من الجينات الأكثر ارتباطًا (ρ & lt 0.4). لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في طول الجين أو محتوى الجوانين-السيتوزين أو موقع الكروموسوم. بدلاً من ذلك ، اكتشفنا خاصيتين تم فرزهما حسب الارتباط: مستوى التعبير الجيني المطلق والمدى الديناميكي. أظهرت الجينات ذات التعبير المطلق المنخفض (ن = 221 جينًا ، 16 ٪ من الإجمالي) ارتباطًا ضعيفًا عبر الأنظمة الأساسية ، مما يشير إلى وجود حد للدقة (الشكل 2 ب). بالنسبة للنطاق الديناميكي ، قمنا بحساب متوسط ​​الانحراف المطلق مقسومًا على الوسيط (MAD / M) لجميع الجينات. كان لأفضل الجينات المرتبطة بالنظام الأساسي وجود MAD / M أعلى بشكل ملحوظ مقارنة مع الجينات المترابطة الأفقر بين الأنظمة الأساسية (ص & lt .001 التين 2 ج و 2 د). وهذا يعكس حقيقة أن مجموعات الأرقام ذات التباين المنخفض يتم تقييمها بشكل سيئ من خلال تحليل الارتباط. بعد إزالة التعبير المنخفض (& lt 1.0 متوسط ​​قراءة لكل كيلو قاعدة مليون) والجينات ذات النطاق الديناميكي المنخفض (& lt 0.25 MAD / M n = 251 جينًا ، 18 ٪ من إجمالي الشكل 2B) ، النسبة المئوية للجينات ذات قيمة ارتباط سبيرمان لـ ρ & gt 0.5 تحسن من 68٪ إلى 84٪ (746 من 890). بشكل عام ، يشير التقييم الفردي على مستوى الجينات مبدئيًا إلى أن NanoString و RNA-seq على عينات FFPE توفر درجة قوية من الاتفاق.

قمنا بعد ذلك باستكشاف الارتباط على مستوى المسار. تميل الجينات ذات الوظائف المماثلة إلى مشاركة أنماط التعبير. 18 وبالتالي ، يمكن أن يكون الارتباط بين جينات محددة ذات صلة مقياسًا للإخلاص البيولوجي لمجموعة بيانات معينة. على سبيل المثال ، BUB1 و TOP2A ، كلا الجينين المرتبطين بدورة الخلية ، يتعايشان باستمرار عبر مجموعة متنوعة من مجموعات البيانات ، بما في ذلك الدراسة الحالية (الملحق الشكل A1). عندما يتم توسيع تحليل الارتباط من جين إلى جين على نطاق أوسع لتحديد مسارات الارتباط ، يمكن للقوة الإجمالية للارتباطات أن تقيس مدى جودة التقاط البيولوجيا الأساسية من خلال جودة مجموعة البيانات. لقد اخترنا استخدام بيانات سرطان الجلد TCGA كحقيقة أساسية مرجعية لتحديد جينات المسار الأساسي المرتبطة ، على أساس الجودة العالية وكمية البيانات المتاحة ، فضلاً عن الدرجة العالية من التوحيد لخط أنابيب TCGA. 1

لتبسيط تحليلات المسار ، سعينا إلى إنشاء درجة مسار لكل مسار يصف بدقة حالة التنشيط النسبية في كل عينة. تتمثل إحدى العقبات التي تعترض هذا النهج في أن الجينات الموجودة ضمن مجموعات الجينات البيولوجية المحددة الحالية (على سبيل المثال ، من قاعدة بيانات التواقيع الجزيئية [MSigDb] http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb) ليست كلها بالضرورة مرتبطة ببعضها البعض ، ومن المحتمل أن تؤدي إلى لدرجة صاخبة. لقد اعتقدنا أنه داخل كل مجموعة جينية توجد مجموعة فرعية من الجينات شديدة الارتباط والتي ، مجتمعة ، تلتقط بشكل أكثر إخلاصًا البيولوجيا الحقيقية للمسار. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة تكرر بشكل متكرر حساب الدرجة على أساس تقسيم الجينات ، حتى تتقارب الدرجة على مجموعة فرعية من الجينات شديدة الارتباط. تم تصميم هذا الإعداد الجزئي لخفض نسبة الضوضاء إلى الإشارة ولتعكس بصدق الإشارة البيولوجية الحقيقية. يوضح الشكل 1 أ هذه العملية التكرارية باستخدام مثال البدء بـ GO_Immune_System_Process من MSigDb لإنشاء درجة مناعية ، ويرد وصف تفصيلي للخطوات في ملحق البيانات. يوضح الشكلان 1B و 1C أمثلة على كيفية تغير درجات TCGA المناعية والخلايا الصباغية أثناء كل تكرار للنتيجة ، وتظهر قوائم الجينات الفرعية النهائية في الشكلين 1D و 1E.

تشير هذه الدرجة العالية من الارتباط المشترك للمجموعة الفرعية النهائية من الجينات إلى تشابه وظيفي داخل مسار واسع أو نوع خلية بالفعل ، فقد تم إثراء المجموعة المناعية النهائية المكونة من 407 جينات (من أصل 1،984) بشكل كبير لجينات البيولوجيا الحقيقية المعروفة ، بما في ذلك CD3, CD8، و CD4 الجينات (ملحق بيانات الشكل 1 د). علاوة على ذلك ، تتوافق درجاتنا المناعية جيدًا مع التوقيع المناعي الموصوف في منشور TCGA الأصلي 1 (الملحق الشكل A2). ثم استخدمنا هذه الجينات 407 كمعيار ذهبي لتقييم قدرة مجموعات بيانات FFPE RNA الخاصة بنا على التقاط بيولوجيا المناعة الحقيقية بالمثل. في الواقع ، حافظت هذه الجينات الـ 407 على درجة عالية من الارتباط مع بعضها البعض في مجموعة بيانات FFPE RNA-seq (الملحق الشكل A2). استخدمنا أيضًا نهجًا آخر لتحديد هذا الارتباط الكمي: لقد استفدنا من النطاق الديناميكي الخاص بالعينة عبر القيم المتوسطة التي تركز على 407 جينات. نظريًا ، يجب أن تحتوي أي عينة معينة على تعبير منخفض أو متوسط ​​أو مرتفع إلى حد ما لجميع الجينات الـ 407 وفقًا لما إذا كانت تحتوي على خلايا مناعية منخفضة أو متوسطة أو عالية ، على التوالي. قد تشير العينات ذات الاختلاف الشديد إلى أن العينة ربما تكون قد قللت من الدقة. بشكل مفاجئ إلى حد ما ، كان لعينات FFPE تناقض أقل بكثير من عينات TCGA (الملحق الشكل A2) ، مما يشير إلى جودة عينة عالية بشكل عام.

قمنا بعد ذلك بمقارنة مجموعتي بيانات FFPE RNA-seq و NanoString. من بين 407 جينة مناعية أساسية حددناها ، كان هناك 190 جينة موجودة على كلا النظامين وتضمنت جينات مناعية أساسية مثل CD3D / E / G, CD4, CD8A / ب، و CD86، مرة أخرى مع الاحتفاظ بالارتباط القوي داخل كل منصة (الشكلان 3 أ و 3 ب). قمنا بعد ذلك بتقييم كل من هذه الجينات الـ 190 على حدة لتحديد مدى جودة كل منصة في التقاط بيولوجيا المناعة الحقيقية كما تم تعريفها عمليًا مسبقًا في هذا القسم. لقد ربطنا كل جين بدرجة المناعة داخل كل منصة ورسمنا نتائج المنصة ضد بعضها البعض (الشكل 3 ب). غالبية الجينات (154 من 190 81 ٪) لها علاقة ارتباط ρ & gt 0.5 على كلا النظامين ، والتي زادت (140 من 163 86 ٪) بعد إزالة الجينات منخفضة التعبير. لا يوجد جين لديه نطاق ديناميكي منخفض. أظهرت المقارنة المباشرة للدرجات المناعية النهائية توافقًا قويًا بين RNA-seq و NanoString (ρ = 0.91) على أساس كل عينة (الشكل 3C). تشير هذه النتائج إلى أنه بعد التحكم في مستوى التعبير ، تمكنت كلتا المنصتين من التقاط الجينات المناعية الإيجابية الحقيقية بنجاح مع الحفاظ على الإخلاص البيولوجي.

الشكل 3. الارتباطات على مستوى المسار داخل وبين المنصات. (أ) خريطة الحرارة للجينات المناعية المستمدة من الشكل 1 د لمجموعات البيانات RNA-seq و NanoString ، مع درجة المناعة في الأعلى. (ب) ارتباط Intraplatform لدرجة المناعة للجينات المناعية الفردية ، تآمر على أنه RNA-seq مقابل NanoString. يتم تسليط الضوء على العديد من الجينات المناعية الرئيسية. (C-E) ارتباط (C) المناعي ، (D) دورة الخلية ، و (E) درجات الجلد بين المنصات. (F ، G) ارتباط درجات EMT والصبغ ضمن (F) الأورام الميلانينية الأولية TCGA و (G) مجموعة بيانات FFPE RNA-seq الحالية. EMT ، الانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة RNA-seq ، تسلسل الحمض النووي الريبي TCGA ، أطلس جينوم السرطان.

لقد أنشأنا درجات للتوقيعات الإضافية: دورة الخلية ، والجلد ، والصبغة ، والانتقال الظهاري - اللحمة المتوسطة (EMT ، قائمة مجموعات الجينات البادئة والمجموعات الفرعية للجينات النهائية ترد في ملحق البيانات). تحتوي مجموعة الجينات الصبغية على منظم التمايز الرئيسي للخلايا الصباغية MITF ومؤثرات MITF المعروفة. على غرار نتائجنا لمجموعة الجينات المناعية ، كانت هناك درجة عالية من الارتباط داخل النظام الأساسي (الملحق الشكل A3). لوحظ أيضًا ارتباط بين المنصات للمسارين مع الجينات التمثيلية على منصة NanoString: دورة الخلية والجلد (الشكلان 3D و 3E). علاوة على ذلك ، لا تزال الجينات غير الموجودة في هذه المسارات الخمسة النهائية تظهر ارتباطًا قويًا عبر النظام الأساسي (الملحق الشكل A3). أخيرًا ، قمنا بمقارنة ارتباط مجموعة intragene لكل من المسارات الخمسة عبر أربع مجموعات بيانات من الأورام الميلانينية الأولية فقط - TCGA ، و FFPE RNA-seq الحالي ، و GSE7553 ، و GSE15605 - مما يوفر تأكيدًا إضافيًا على أنها علامات قوية لمسارات كل منها ( التذييل الشكل A4).

بعد ذلك ، اتخذنا أربعة مناهج متعامدة لدعم الدقة البيولوجية لبيانات FFPE RNA-seq. أولاً ، أجرينا تجميعًا هرميًا لمجموعة البيانات الخاصة بنا مع 21 نوعًا من أورام TCGA باستخدام جينات TCGA الأكثر تنوعًا في عموم السرطان وأظهرنا أن مجموعة بيانات FFPE الخاصة بنا متجمعة بإحكام مع كل من الورم الميلانيني الجلدي والعنبي ، بشكل أساسي من خلال التعبير العالي عن الجينات الخاصة بالخلايا الصباغية ( التذييل الشكل A4). ثانيًا ، أجرينا تجميعًا هرميًا داخل مجموعة بيانات FFPE RNA-seq الخاصة بنا باستخدام الجينات المتغيرة الأعلى وحصلنا على نتائج تتطابق بشكل وثيق مع تلك الخاصة بتحليل سرطان الجلد TCGA ، أي تحديد المجموعات المخصبة للجينات العصبية المحددة والجلد والجينات المناعية (الملحق الشكل A5). ثالثًا ، قمنا بمقارنة جينات المسار الخمسة لدينا بثلاث مجموعات جينية لا يُتوقع أن يتم التعبير عنها بشكل كبير في سرطان الجلد. أكد هذا التحليل أن مساراتنا الخمسة تم التعبير عنها بشكل كبير في مجموعة بيانات FFPE RNA-seq ، في حين أن مجموعات الجينات الثلاث غير الميلانينية كانت إلى حد كبير & lt 1.0 قراءة متوسطة لكل كيلوبايس مليون. أخيرًا ، قمنا بفحص ارتباط المسار المعروف بين مجموعات الجينات الخمس لدينا ، كما هو موضح في دراسات متعددة لخطوط الخلايا: ارتباط EMT والتوقيعات الصباغية. 21 في الجسم الحي ، تعبر أنواع الخلايا اللحمية المتعددة عن توقيع EMT ، مما يضعف الارتباط. ومع ذلك ، في مجموعة بيانات TCGA ، من بين عينات سرطان الجلد الأولية (ن = 103) ، فإن EMT والتوقيعات الصباغية مترابطة (ρ = −0.47 الشكل 3F). ولوحظت نتائج مماثلة في مجموعة بيانات FFPE الخاصة بنا (ρ = −0.41 الشكل 3G). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أنه على مستوى المسار ، تلتقط مجموعات بيانات RNA-seq و NanoString المشتقة من FFPE بدقة الارتباطات البيولوجية الراسخة.

سألنا بعد ذلك ما إذا كانت تواقيعنا تتماشى مع الكيمياء المناعية (IHC) أجريت على نفس العينات. يرتبط توقيع دورة الخلية من RNA-seq جيدًا بـ IHC لـ MART1 / pH3 22 (على سبيل المثال ، الخلايا مزدوجة إيجابية لـ MART1 ، وعلامة سرطان الجلد ، و pH3 ، علامة الخلايا المنقسمة الشكل 4 أ) والمعدل الانقسامي الملحوظ (الشكل 4 ب) . تم اكتشاف هذه الارتباطات الإيجابية أيضًا في مجموعة بيانات NanoString (الملحق الشكل A6). علاوة على ذلك ، قيم التعبير الجيني الفردي لـ CD3 و CD8A المرتبطة بالقيم IHC المقابلة. كان هذا الارتباط أقوى للتلوين الإيجابي في مركز الورم (الشكلان 4 ج و 4 د) مقارنة مع المحيط (الملحق الشكل أ 6).

الشكل 4. العلاقة بين درجات المسار وعلم التشريح المرضي. (أ ، ب) ارتباط درجة دورة خلية تسلسل الحمض النووي الريبي إلى (A) pHH3 المناعية (IHC) و (B) معدل الانقسام. (C-F) ارتباط بيانات التعبير الجيني CD8 أو CD3 لتسلسل الحمض النووي الريبي إلى IHC الخاص بها إما في مركز (C ، D) أو محيط (E ، F) من الورم.

سعينا بعد ذلك إلى تحديد كيفية ارتباط نتائج المسار بالبيانات السريرية الأخرى. وجدنا أن درجة الجلد ، التي تحدد كمية جينات البشرة الطبيعية (على سبيل المثال ، إينفولوكرين وكيراتين 1) ، مرتبطة بكل من سمك Breslow ومساحة سطح الورم (الشكلان 5 أ و 5 ب) ، مما يشير إلى أن عينات خزعة الورم الأرق والأصغر قد يكون لها حجم أكبر قليلاً النسبة المئوية لمحتوى البشرة العادية. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط درجة الخلايا الصباغية سلبًا بدرجة الضرر المزمن الناتج عن أشعة الشمس (الشكل 5C) ، وهو مقياس لدرجة الإصابة بالمرونة الشمسية في الجلد الطبيعي المجاور لآفات الورم الميلانيني الأولية في أقسام الأنسجة المصبوغة بالهيموكسيلين والأيوزين. 23

الشكل 5. العلاقة بين درجات المسار وبيانات المريض. (أ ، ب) ارتباط درجة الجلد RNA-seq إلى (A) سمك Breslow أو (B) مساحة سطح الورم. (C) مضاد الارتباط لدرجة صبغة RNA-seq لدرجة ضرر الشمس المزمن. (د) ناتج تحليل التخصيب الجيني الذي يُظهر مجموعات الجينات الانقسامية كما تم إثرائها في عينات من المرضى الذين تكرر المرض لديهم في النهاية. (هـ) ارتباط درجات دورة الخلية RNA-seq أو NanoString للعينات الطبقية حسب حالة التكرار على مستوى المريض. تسلسل الحمض النووي الريبي ، تسلسل الحمض النووي الريبي.

أخيرًا ، أجرينا تحليلًا غير متحيز لإثراء مجموعة الجينات لتحديد المسارات التي ترتبط بنتائج المريض. تمشيا مع نتائج دراسات التعبير الجيني السابقة للورم الميلانيني الأولي ، 24-26 تم إثراء زيادة في التعبير الجيني لدورة الخلية بشكل كبير في عينات المرضى الذين تكرر ظهور الورم الميلانيني لديهم في النهاية (الشكل 5 د). لإثبات الدقة البيولوجية لنتائج مجموعة الجينات الخاصة بنا ، قمنا بعد ذلك بمقارنة درجة دورة الخلية بين الأورام الأولية من التكرار مقابل مجموعات عدم التكرار. لاحظنا فرقًا كبيرًا (ص = .02) بين المجموعتين (الشكل 5E). معًا ، تدعم هذه التقييمات الموجهة نحو المريض الدقة البيولوجية لبيانات FFPE RNA-seq.

نحن نقدم دليلًا على أن تسلسل الحمض النووي الريبي على نطاق الترنسكربيتوم من عينات FFPE الأرشيفية تنتج إشارات متماسكة بيولوجيًا تتطابق جيدًا مع البيانات الإكلينيكية المرضية. في هذه الدراسة ، أنشأنا نهجًا لتقييم درجات المسار الذي يقوم بتجميع قوائم الجينات الفرعية عن طريق إثراء الجينات التي تشكل معًا مجموعات مرتبطة وظيفيًا من أنماط التعبير المترابطة جيدًا. يوفر هذا النهج درجة نظيفة على مستوى المسار لإجراء مقارنات سريعة عبر الأنظمة الأساسية وبيانات المدينة الصحية العالمية ونتائج المريض. الأهم من ذلك ، توضح النتائج التي توصلنا إليها أن NanoString و RNA-seq تولد بيانات مترابطة جيدًا بمجرد إزالة الجينات منخفضة التعبير وذات النطاق الديناميكي المنخفض من التحليلات الإضافية ، والقواعد التي يمكن تطبيقها على مجموعات البيانات الأخرى. الجودة العالية للبيانات التي تم الحصول عليها من كلا النظامين تفتح العديد من الفرص. على سبيل المثال ، يتيح استخدام تسلسل RNA-seq غير المتحيز للنسخة الكاملة اكتشافًا قويًا للمسارات غير المتوقعة ذات الأهمية ، وذلك باستخدام مجموعة موسعة بشكل كبير من عينات FFPE الأرشيفية.

على حد علمنا ، فإن دراستنا هي الأولى التي تقيم الدقة البيولوجية للاختلافات المستمرة في التعبير الجيني في بيانات RNA-seq المشتقة من FFPE بدلاً من الاختلافات الكبيرة بين الأنواع الفرعية للورم و / أو الأنسجة الطبيعية. كما أنه أول من قارن مباشرة بيانات RNA-seq المشتقة من FFPE مع بيانات NanoString ومع نتائج IHC الكمية. الأهم من ذلك ، احتفظت الدرجات على مستوى المسار إلى حد كبير بالارتباطات المرتبة عبر الأنظمة الأساسية. عند تطبيقه في بيئة سريرية ، قد يسهل هذا النهج إلى حد كبير التصنيف المفيد بيولوجيًا للعينات. في حالة الورم الميلانيني الأولي ، قد تساعد نتائج دورة الخلية في تقسيم المرضى الذين يعانون من الورم الميلانيني في مراحله المبكرة إلى أولئك الذين من المحتمل أن ينتكسوا أو ليسوا على نطاق أوسع ، فإن الطبيعة غير المتحيزة لـ RNA-seq ستمكن من الكشف عن مؤشرات حيوية جديدة في مجموعة متنوعة من الإعدادات. تُظهر نتائجنا أيضًا أن تحليلات FFPE RNA-seq تحافظ على نفس الارتباطات بين الجينات الرئيسية مثل مجموعة بيانات الورم المجمد TCGA عالية الجودة وعدد العينات. إذا تم التحقق من صحتها في مجموعات بيانات إضافية ونشرها بشكل مناسب ، فإن النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن FFPE RNA-seq يمكن أن يحدد تغييرات الطيات الدقيقة نسبيًا المرتبطة بالبيولوجيا الأساسية.

بشكل عام ، تدعم بياناتنا بقوة إمكانية تقييم بيانات تعبير الحمض النووي الريبي المشتق من FFPE بشكل قوي للمساعدة في فتح الرؤى البيولوجية ذات الصلة سريريًا. من المحتمل أن يتم تمكين مثل هذه الدراسات من خلال التنفيذ المستمر لبنوك الأنسجة عالية الجودة والمنسقة جيدًا والتي تتضمن بيانات نتائج المريض ذات الصلة سريريًا. نقترح كذلك أن نهجنا يمكن استخدامه على نطاق واسع لحساب درجات المسار بدقة أكبر ، لأن الأساليب الحالية تعالج جميع الجينات في مجموعة الجينات بغض النظر عن درجة الارتباط المشترك. للمضي قدمًا ، نتصور تحليلات مستقبلية واسعة النطاق للأرشيف FFPE RNA-seq لاكتشاف وتحليل FFPE RNA السريري للتحقق من الصحة ، وفي النهاية ، التطبيق السريري ، مع إمكانية إضافية لتطبيق مجموعة الجينات لإنتاج درجات وتقسيم المرضى وفقًا ذات الصلة البيولوجية والسريرية. في المستقبل ، مع التحقق من صحة النتائج ، يترتب على ذلك أنه يمكن إدخال مثل هذه الأساليب في الممارسة السريرية المعاصرة لتسهيل اتخاذ القرار السريري.

بدعم جزئي من برنامج المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المتخصص للتميز البحثي ، منحة الميلانوما رقم P50 CA93459 إلى مركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس ، ومعهد NIH الوطني للسرطان من خلال منحة دعم مركز أندرسون للسرطان بجامعة تكساس. P30CA016672 a جائزة فريق أبحاث الميلانوما العلمية التي تمنح مساهمات خيرية سخية لبرنامج MD Anderson Melanoma Moon Shots التابع لجامعة تكساس ، مؤسسة Dr Miriam and Sheldon G. الميلانوما جائزة النجوم الصاعدة من جامعة تكساس وجائزة المحقق الشاب من تحالف أبحاث الميلانوما 508743 ، وكلاهما لـ LNK

المفهوم والتصميم: لورانس إن كوونج ، لورين هايدو ، آرون واي جون ، تيفاني إل كالديرون ، مايكل إيه ديفيز ، ألكسندر ج.لازار ، جيفري إي.جيرشنوالد

الدعم المالي: مايكل أ.ديفيز ، ألكسندر ج.لازار ، جيفري إي. جيرشينوالد

الدعم الإداري: ألكسندر ج. لازار ، جيفري إي. جيرشينوالد

توفير المواد الدراسية أو المرضى: لورانس إن كوونج ، مايكل تي تتزلاف ، مان كام كوونج ، ألكسندر ج.لازار ، جيفري إي.

جمع وتجميع البيانات: لورانس ن.كوونج ، ماريانا بيتاشيا دي ماسيدو ، لورين هايدو ، آرون واي جون ، مايكل تي تيتزلاف ، تيفاني إل كالديروني ، شيانج جون وو ، مايكل أ.ديفيز ، ألكسندر ج.لازار ، جيفري إي غيرشنوالد

تحليل البيانات وتفسيرها: لورانس إن كوونج ، لورين هايدو ، آرون واي جون ، مايكل تي تيتزلاف ، شيانج جون وو ، مان كام كوونج ، جايسون روزيك ، كينيث هيس ، مايكل أ.ديفيز ، ألكسندر ج.لازار ، جيفري إي.

كتابة المخطوطة: كل المؤلفين

الموافقة النهائية للمخطوطة: كل المؤلفين

يمثل ما يلي معلومات الكشف المقدمة من قبل مؤلفي هذه المخطوطة. تعتبر جميع العلاقات مقابل تعويض. العلاقات ذاتية ما لم تتم الإشارة إليها. أنا = أحد أفراد العائلة المباشرين ، المؤسسة = مؤسستي. قد لا تتعلق العلاقات بموضوع هذه المخطوطة. لمزيد من المعلومات حول سياسة تضارب المصالح الخاصة بـ ASCO ، يرجى الرجوع إلى www.asco.org/rwc أو ascopubs.org/po/author-center.

الأسهم ومصالح الملكية الأخرى: علاجات Sarepta

تمويل البحوث: Array BioPharma

لا علاقة للكشف

لا علاقة للكشف

لا علاقة للكشف

دور استشاري أو استشاري: عدد لا يحصى من علم الوراثة ، نوفارتيس

لا علاقة للكشف

لا علاقة للكشف

لا علاقة للكشف

لا علاقة للكشف

لا علاقة للكشف

دور استشاري أو استشاري: جلاكسو سميث كلاين ، روش ، نوفارتيس ، سانوفي ، فاكينكس ، بريستول مايرز سكويب ، سينداكس ، تقنيات نانو سترينج

تمويل البحوث: GlaxoSmithKline (Inst) ، Roche (Inst) ، AstraZeneca (Inst) ، Merck (Inst) ، Oncothyreon (Inst) ، Myriad Genetics (Inst) ، Sanofi

توظيف: GE Healthcare (I)

قيادة: Beta Cat Pharmaceuticals ، Archer Biosciences

الأسهم ومصالح الملكية الأخرى: آرتشر Biosciences ، Beta Cat Pharmaceuticals

الأتعاب: نوفارتيس ، بريستول مايرز سكويب ، يانسن أورام ، روش

دور استشاري أو استشاري: نوفارتيس ، إلومينا ، جنرال إلكتريك للرعاية الصحية

تمويل البحوث: MedImmune ، أسترازينيكا ، روش ، نوفارتيس

براءات الاختراع والإتاوات والملكية الفكرية الأخرى: إلسفير

السفر والإقامة والمصروفات: بريستول مايرز سكويب ، نوفارتيس

دور استشاري أو استشاري: قلعة العلوم البيولوجية ، ميرك

براءات الاختراع والإتاوات والملكية الفكرية الأخرى: علاجات مركاتور

الشكل A1. مثال على الارتباط المحفوظ بين الجينات والجينات عبر مجموعات البيانات. الارتباط بين TOP2A و BUB1 في أطلس جينوم السرطان ، GSE19234 ، GSE22155 ، ومجموعات بيانات الأنسجة الحالية المضمنة بالفورمالين المثبتة بالفورمالين ، وجميعها تقيم عينات سرطان الجلد لدى المرضى.

الشكل A2. التحقق الإضافي من مجموعة الجينات المناعية. (أ) ارتباط النتيجة المناعية المستمدة من أطلس جينوم السرطان (TCGA) والنتيجة المناعية الرسمية لـ TCGA. (ب) مخطط Venn يوضح التداخل في عضوية الجينات بين مجموعة الجينات المناعية المشتقة من TCGA ومجموعة الجينات المناعية الرسمية TCGA. (C) أعلى: خريطة الحرارة لمجموعة بيانات RNA-seq المضمنة بالبارافين (FFPE) البالغ عددها 38 والتي تحتوي على 407 جينات مجموعة الجينات المناعية المشتقة من TCGA. القاع: متوسط ​​الانحراف المطلق مقسومًا على الوسيط (MAD / M) لجميع الجينات المناعية البالغ عددها 407 لكل عينة ، وهو مقياس للخلاف المترابط داخل التوقيع المناعي. (D) مقارنة بين MAD / M المناعي لمجموعات البيانات TCGA و FFPE.

الشكل A3. تُظهر خرائط الحرارة مجموعات الجينات ذات النقطة الثابتة النهائية لـ (A) الانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة (EMT) ودورة الخلية (B) والجلد (C) لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) و NanoString. لكل مجموعة جينية ، يكون لعينات RNA-seq و NanoString نفس الترتيب ، من أعلى إلى أدنى درجة RNA-seq. لا تتوفر جينات نقاط الخلايا الصباغية لـ NanoString نظرًا لعدم وجود جينات الخلايا الصباغية على اللوحة. (D) NanoString المضمنة بالبارافين (FFPE) مقابل ارتباطات FFPE RNA-seq ، مقارنة أعضاء الجينات النهائية للمسارات الخمسة مع جميع الجينات الأخرى المشتركة بين النظامين الأساسيين.

الشكل A4. الارتباطات Intragene-set للمسارات الخمسة. يرتبط كل عضو في مجموعة الجينات بدرجة مجموعة الجينات الإجمالية الخاصة به ، بالنسبة للأورام الميلانينية الأولية فقط في (A) أطلس جينوم السرطان (TCGA) و (FFPE) RNA-seq و (B). مجموعات البيانات GSE7553 و GSE15605. تشير النسب في الأعلى إلى أن الجينات في أنسجة FFPE بـ ρ & gt 0.5. (ج) التجميع الهرمي لأعلى 697 جينة من الجينات السرطانية الأكثر تنوعًا لـ 21 نوعًا من السرطان بالإضافة إلى مجموعة بيانات الورم الميلانيني FFPE. تسليط الضوء على المثلثات المظللة عناقيد. يشير المربع الأصفر إلى الجينات الخاصة بالخلايا الصباغية المخصبة عبر عينات سرطان الجلد ، وتشمل جينات مثل TYR, TYRP1، و ملانا. ACC ، سرطان قشر الكظر BLCA ، سرطان المثانة BRCA ، سرطان الثدي COADREAD ، سرطان القولون والمستقيم EMT ، الانتقال الظهاري واللحمة المتوسطة FFP ، هذه الدراسة GBM: الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال HNSC ، سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة LIHC ، سرطان الكبد سرطان الكلى الحليمي الكلوي LAML ، سرطان الدم النخاعي الحاد LGG ، الورم الدبقي منخفض الدرجة LUAD ، سرطان الغدة الرئوية LUSC ، سرطان الخلايا الحرشفية الرئوية ، الانبثاث MESO ، ورم الظهارة المتوسطة PAAD ، سرطان الغدة البنكرياس الأولي PRAD ، سرطان البروستاتا الجلدي OV ، metastarianCM سرطان الجلد الجلدي THCA ، سرطان الغدة الدرقية UCEC ، سرطان الرحم UVM ، سرطان الجلد العنبي.

الشكل A5. (أ) تجميع هرمي لأعلى 5٪ جينات متغيرة. يتم عرض فئات الجينات المخصبة لثلاث مجموعات على أساس تحليلات Metacore. لم يكن لدى الكتلة النهائية تخصيب واضح. نلاحظ أنه لم يتم استرداد مسار MITF / الخلايا الصباغية ، بسبب مجموعة البيانات الأصغر (ن = 38 عينة هنا الخامس n = 333 في TCGA) والتباين الأقل في التعبير الجيني للخلايا الصباغية ، مما أدى إلى أن هذه الجينات ليست من بين أعلى 5٪. (ب) متوسط ​​القراءات لكل مليون قاعدة (RPKMs) لجميع الجينات ضمن مجموعات الجينات الخمسة المستخدمة في هذه الدراسة ولثلاث مجموعات جينية لا يُتوقع أن يتم التعبير عنها بشكل كبير في سرطان الجلد. تشير النسب المئوية في الأعلى إلى النسبة المئوية للجينات داخل كل جين مجموعة أعلى من 1.0 متوسط ​​عتبة RPKM (خط متقطع). تم اشتقاق مجموعات جينات التحكم الثلاث من قاعدة بيانات الأنسجة الطبيعية GTEx. تشير أشرطة الخطأ إلى المدى المتوسط ​​بالإضافة إلى النطاق بين الشرائح الربعية. ال ذمقياس المحور هو سجل10.

الشكل أ 6. الارتباط بين درجات المسار وعلم التشريح المرضي لبيانات NanoString. (A ، B) ارتباط درجة دورة الخلية NanoString مع (A) pHH3 المناعية (IHC) و (B) معدل الانقسام. (C-F) ارتباط بيانات التعبير الجيني NanoString CD8 أو CD3 مع IHC الخاص بها إما في مركز (C ، D) أو محيط (E ، F) من الورم.


مشاريع لدورات الخريجين والطلبة الجامعيين المتحمسين للغاية

تساهم مشاريعنا في أطلس الخلايا البشرية (HCA) ، و Altas الجزيئي الحيوي البشري (HuBMAP) ، وبرنامج 4D Nucleome (4DN) ، وأبحاث مرض السكري ، وأبحاث مرض الزهايمر.

النسخ المكانية ذات الدقة المكانية العالية للغاية

تسمح طرق النسخ المكانية بتسلسل الحمض النووي الريبي من الأنسجة البشرية أثناء تسجيل المواقع المكانية لكل الحمض النووي الريبي المتسلسل في الأنسجة الأصلية. سيطور هذا المشروع الجيل القادم من أدوات النسخ المكانية التي ستحسن بشكل كبير الدقة المكانية وحجم الأنسجة التي يمكن تحليلها. سنقوم بتطوير شرائح خرائط مكانية عالية الدقة وعالية الكثافة وعالية الدقة وقابلة للتكرار (شرائح HiFi) لتحليل النسخ المكاني.

الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين على نطاق الجينوم

لا يزال رسم خرائط الجينوم لتفاعلات البروتين والبروتين (PPI) شاقًا ومكثفًا للموارد. سيقوم هذا المشروع بتطوير تقنية عالية الإنتاجية تعتمد على الجينوم لرسم خرائط لشبكة PPI البشرية على النطاق الجيني. هذه التكنولوجيا الجينومية وأدواتها المعلوماتية الجينومية المقترنة ستولد خريطة مرجعية لشبكة PPI البشرية.

الكشف عن تفاعلات البروتين الدوائي بين مكتبة الأدوية وجميع البروتينات البشرية من خلال تجربة واحدة

سيطور هذا المشروع تقنية جينومية يمكنها الكشف عن جميع تفاعلات البروتين الدوائي بين مكتبة جزيئات صغيرة ومكتبة بروتينية. من المتوقع أن تحول هذه التكنولوجيا الممارسات الحالية لتحديد فحص الأدوية من خلال زيادة الكفاءة بمقدار 1000 مرة.

الكشف عن تفاعلات الحمض النووي الريبي والكروماتين في الخلايا المفردة

سيطور هذا المشروع تقنيات يمكنها الكشف عن تفاعلات الحمض النووي الريبي وكروماتين في الخلايا المفردة.

العلاقة بين تفاعلات RNA-chromatin على مستوى الجينوم وتنظيم الجينوم ثلاثي الأبعاد

لا يزال من غير الواضح إلى أي مدى يمكن أن تعكس الحمض النووي الريبي المرتبط بالكروماتين التنظيم ثلاثي الأبعاد للجينوم. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا iMARGI (تقنية التسلسل) لرسم خريطة تفاعلات RNA-chromatin على مستوى الجينوم في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وخلايا القلفة وخلايا سرطان الدم. سيقارن هذا المشروع بيانات iMARGI مع بيانات تفاعل الجينوم بما في ذلك Hi-C و PLAC-seq على ثلاثة مستويات مختلفة. على مقياس الحجرة ، سنختبر ما إذا كان كروماتين الحجرة A مرتبطًا بكميات كبيرة من RNAs ، بما في ذلك تفاعلات RNA-chromatin داخل الكروموسومات وبين الصبغيات. على مقياس TAD ، سنختبر ما إذا كانت نهايات RNA لجميع تفاعلات RNA-chromatin تقريبًا محصورة داخل حدود واحد أو عدد قليل من TADs المتتالية. على نطاق الحلقة ، سنختبر ما إذا كانت تفاعلات RNA-chromatin غنية بالتفاعلات المُحسِنة والمُحسِّن المشتقة من PLAC-seq.


RNA-SEQ كعنصر من مكونات الأورام العصبية الدقيقة

بالنسبة لسرطانات الدماغ العدوانية ، فشلت محاولات تحسين العلاج الكيميائي السام للخلايا وأنظمة العلاج الإشعاعي في تحسين التكهنات الكئيبة. بدأت برامج طب الأورام العصبية الدقيقة في استخدام تقنيات NGS لتحديد التعديلات الجزيئية المسرطنة التي يمكن استهدافها بمثبطات مصممة بشكل عقلاني. تتمثل الميزة الفريدة لـ RNA-seq في سياق الطب الدقيق في قدرته على اكتشاف جينات الاندماج المعبر عنها والتي غالبًا ما تكون محركات مسرطنة في سرطان الدماغ. (22) على سبيل المثال ، تم استخدام RNA-seq لتحديد FGFR3-TACC3 جين الانصهار في 3.1٪ من GBM البالغ (الشكل 1). يكتسب FGFR3-TACC3 نشاط كيناز التأسيسي الذي يسبب ورم دبقي عالي الجودة سريع النمو وسريع النمو. أظهر المرضى نتائج واعدة ، مما يدعم إجراء المزيد من التحقيقات السريرية لمثل هذه الأدوية في المرضى المصابين بفيروس FGFR-TACC.

كمثال آخر ، كان RNA-seq ذا قيمة في توصيف اندماج الجينات التي تنطوي على التقى الجين الورمي ، والذي يوجد في 10٪ من GBM للأطفال بالإضافة إلى 15٪ من GBM الثانوي للبالغين ، حيث يرتبطون بسوء التشخيص (الشكل 1). (10 ، 87) مثبطات MET مثل crizotinib هي علاجات واعدة لعلاج إيواء GBMs التقى الاندماج أو التضخيم. (87) كما نوقش أعلاه ، يمكن أيضًا استخدام RNA-seq لتحديد C11orf95& # x02013ريلا الاندماج الذي يدفع NF المسرطنة - & # x003baB الإشارات في أكثر من ثلثي الورم البطاني العصبي فوق البطني ، (38) PVT1-MYC الاندماج في الورم الأرومي النخاعي ، (39) و TTYH1-C19MC الاندماج في الأورام الجنينية مع وريدات متعددة الطبقات ، (88) تحمل جميعها معلومات تشخيصية وإنذارية مهمة.

تشير الدراسات السريرية إلى أن أساليب علاج الأورام الدقيقة لديها القدرة على تحسين النتائج بشكل كبير لمرضى السرطان. أظهر التحليل التلوي لـ 570 دراسة من المرحلة الثانية تحتوي على 32149 مريضًا بالسرطان أن أولئك الذين يتلقون استراتيجية علاج دقيقة كان لديهم معدل استجابة أعلى بكثير (31٪ مقابل 10.5٪) ومتوسط ​​بقاء خالٍ من التقدم (5.9 مقابل 2.7 شهرًا) مقارنة بالمعيار. حددت هذه الدراسة العلاج الدقيق بشكل متحفظ للغاية ، بما في ذلك العلاجات القائمة على علامة بيولوجية واحدة. (89) إن دمج بيانات التسلسل الشامل في برامج الطب الدقيق لديه القدرة على زيادة تحسين النتائج.

استخدمت برامج الطب الدقيق الرائدة ، مثل INFORM (ألمانيا) و MiOncoSeq (جامعة ميشيغان) ، RNA-seq لفحص الاندماجات والمتغيرات الهيكلية وتغييرات التعبير الجيني التي لها آثار تشخيصية وعلاجية. (22 ، 90 ، 91) في دراسة تجريبية لـ INFORM ، تم تحليل مجموعة من أورام الأطفال باستخدام جينوم كامل كامل الإكسوم ، وتغطية منخفضة ، وتسلسل الحمض النووي الريبي جنبًا إلى جنب مع مثيلة وتعبير ميكروأري. كان لدى 26/52 (50٪) من المرضى تغيير قابل للاستهداف ، وفي عشرة مرضى قرر الطبيب إعطاء علاج موجه متطابق ، مع ملاحظة استجابات في بعض الأورام التي لا تستجيب للعلاجات التقليدية. تسلسل الحمض النووي والـ RNA للورم الجرثومي والورم لـ 50 طفلاً وشابًا يعانون من أورام دماغية عالية الخطورة من خلال برنامج MiOncoSeq ، ووجدوا جدوى عالية وقابلية للتنفيذ ، خاصة في أورام الدماغ الدبقية (المخطوطة قيد الإعداد).

كثيرًا ما حددت دراسات الأورام الدقيقة الرائدة هذه أهدافًا متعددة لكل مريض ، مما يشير إلى أن العلاجات المشتركة قد تعمل على تحسين الاستجابة في الدراسات المستقبلية. من شأنها أن تؤثر على خصائص الامتصاص والتوزيع والتمثيل الغذائي والإفراز (ADME) للأدوية المرشحة. (90) أخيرًا ، كشفت هذه الدراسات عن مجالات للتحسين في المستقبل ، مثل أوقات التسلسل الأطول من المتوقع والتي أخرت الإجراء السريري ونقص إدارة الغذاء والدواء الأمريكية. وكلاء معتمدون لمرضى الأطفال. (22)

أحد الاعتبارات المتعلقة بنهج دقيق قائم على علم الأورام لأورام الدماغ الخبيثة هو عدم تجانسها داخل الورم ، مما يثير القلق من أن عينة خزعة واحدة قد لا تلتقط التعديلات الجزيئية الموجودة في مناطق أخرى من الورم. الورم والأورام الدبقية المتكررة تظهر تباعدًا جينيًا كبيرًا عن الورم الأولي لا يمكن تفسيره عن طريق عدم التجانس في الورم الأصلي. (92) لذلك ، سيكون التخطيط الدقيق للخزعة ، مع إعادة الخزعة وإعادة تحديد ملامح أورام الدماغ الخبيثة المتكررة ، ضروريًا للاستجابات المثلى. (92)


تطبيع

يختلف التقاط mRNA من الخلايا الفردية داخل العينات وعبرها ، لذلك يساعد تطبيع البيانات في التغلب على هذا التحيز. تستخدم طرق مثل Scanpy58 و Seurat6 و CellRanger نفس طريقة تطبيع المكتبة العالمية. تضرب هذه الطريقة أولاً كل خلية بمعامل مقياس 10e 4 و a تحويل السجل الطبيعي كل قيمة. يساعد هذا في معالجة البيانات التي تنحاز إلى القيم الكبيرة ولا تقلل من القيم الصغيرة. تقوم بعض الطرق بتوسيع نطاق البيانات وفقًا لتباين الوحدة والقيمة المتوسطة والانحراف المعياري بحد أقصى 10 لمنع الهيمنة على جينات معينة. لا تزال ممارسة التراجع عن المتغيرات البيولوجية مثل تأثيرات دورة الخلية وجينات الميتوكوندريا وعمق العد محل نقاش حول ما إذا كانت مفيدة أم لا لأن هذه العوامل قد تمثل عمليات بيولوجية. نظرًا لأنه لا يتم فهم جميع العمليات البيولوجية ، فإن تراجع واحد أو اثنين من التقنيات البيولوجية قد يعزز أو يخفي الآخرين.

بعد التطبيع ، تتمثل المشكلة الشائعة في مجموعات بيانات scRNA-seq في تأثيرات الدُفعات. هذا هو المكان الذي يمكن فيه تصور الاختلاف بين مجموعات بيانات scRNA-seq بناءً على عينات تم إعدادها على دفعات منفصلة. يمكن أن يكون هذا شائعًا في عينات السرطان لأن المرضى المختلفين وأنواع الأنسجة وظروف العلاج يمكن أن تؤدي إلى تأثير دفعة واحدة. تم تطوير بعض الخوارزميات مثل ComBat لتصحيح هذه التأثيرات. ومع ذلك ، فإن الخوارزميات الأكثر شيوعًا لـ scRNA-seq تصحيح الدفعة هي Harmony24 و LIGER57 و Seurat 347 ، حيث ثبت أنها تتفوق على طرق تصحيح الدُفعات الحالية في معظم مجموعات البيانات. حاليًا ، نفذت Cell Ranger 3.0 by 10X Genomics أيضًا أقرب الجيران المتبادلين خوارزمية (MNN) 18 لتصحيح كيميائياتها المختلفة. في بعض الحالات التي تكون فيها الدُفعات مختلفة بشكل أكبر عن بعضها البعض مثل تلك التي تحتوي على أنواع مختلفة من الأنسجة ، أو مواد كيميائية مختلفة ، قد لا يكون تصحيح الدُفعات MNN كافيًا. وبالتالي ، يمكن استخدام طرق التكامل مثل Seurat47 و LIGER57 و Harmony24 و BBKNN (Polanski et al. ، 2020) لتصحيح تأثيرات الدُفعات مما يسمح بتكامل أفضل لمجموعات بيانات scRNA-seq.


الحالة الحالية لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشر - علم الأحياء

مختبر رئيسي حكومي للكيمياء التحليلية لعلوم الحياة ، جامعة نانجينغ ، نانجينغ ، الصين

(ب) مركز الابتكار التعاوني للكيمياء لعلوم الحياة ، جامعة نانجينغ ، نانجينغ ، الصين

ج كلية الكيمياء والهندسة الكيميائية ، جامعة نانجينغ ، نانجينغ ، الصين
بريد الالكتروني: [email protected]

د قسم الهندسة الطبية الحيوية ، كلية الهندسة والعلوم التطبيقية ، جامعة نانجينغ ، نانجينغ ، الصين
بريد الالكتروني: [email protected]

الملخص

2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleic acid (FANA) ، وهو أحد أنواع حمض الزينو النووي (XNA) ، تمت دراسته بشكل مكثف في الطب الجزيئي والبيولوجيا التركيبية بسبب أنشطته الفائقة في إسكات الجينات والتحفيز. على الرغم من أن FANA مطلوبة بشكل عاجل ، إلا أنه لا يمكن إجراء تسلسل مباشر لها من خلال أي منصة موجودة. يُظهر تسلسل Nanopore ، الذي يحدد جزيء تحليلي واحد مباشرة من خواصه الفيزيائية والكيميائية ، وعدًا بتسلسل XNA المباشر. كدليل على المفهوم ، تُظهر البوليمرات المتجانسة المختلفة لـ FANA إشارات انسداد المسام المميزة جيدًا في Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopore. من خلال ربط FANA بشريط محرك DNA ، تم إثبات تسلسل FANA المباشر باستخدام phi29 DNA polymerase بواسطة تسلسل تحول الطور المستحث بواسطة Nanopore (NIPSS). عند ربطه بقالب FANA ، يُظهر بوليميريز الحمض النووي phi29 نشاط النسخ العكسي غير المتوقع عند مراقبته في اختبار جزيء واحد. بعد مزيد من التحقيقات في المجموعة ، تبين أن phi29 DNA polymerase عبارة عن نسخة عكسية غير معروفة سابقًا لـ FANA تعمل في درجة حرارة الغرفة ، ومن المحتمل أن تكون مثالية لتسلسل النانو. تمثل هذه النتائج أول تسلسل مباشر لـ XNA المعدل بالسكر وتشير إلى أن phi29 DNA polymerase يمكن أن يكون بمثابة إنزيم واعد للتسلسل المستدام لمجموعة متنوعة من XNAs.


الموارد الحسابية

مجموعة الحوسبة عالية الأداء (HPC): مرفق حوسبة مركزية عالية الأداء (HPC) بسعة تخزين 1.5 بيتابايت تسمى & ldquoMinerva & rdquo متاحة لتحليل البيانات الثانوية والثالثية. تتكون مجموعة Minerva من 120 هيكل من Dell C6145 ذو نصلتين يبلغ إجماليهما 7680 نواة (64 مركزًا لكل عقدة) مع سرعة ذروة تبلغ 70 تيرافلوب ، متصلة ببعضها البعض من خلال شبكة InfiniBand ذات معدل البيانات الرباعية (QDR ، 40 جيجابت في الثانية). تم تجهيز كل عقدة حسابية بذاكرة 256 جيجابايت على الأقل ، مع عقدة ذاكرة عالية بسعة 1 تيرابايت. تم تحسين الأجهزة التي يمكن الوصول إليها للتحليل للوظائف المتوازية المرتبطة بوحدة المعالجة المركزية مثل تعيين قراءة NGS ، بالإضافة إلى الوظائف الموازية مثل إعادة بناء شبكة Bayesian المرتبطة بالذاكرة. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح وصلات InfiniBand عالية السرعة الوظائف التي تتطلب ذاكرة مشتركة كبيرة ، مثل المقارنات الشاملة لنتائج RNAseq الخاصة بالشكل الملصق لإنشاء شبكات تعبير مشترك خاصة بالشكل الإسوي. Minerva متصلة بمجموعة Genomics Core وشبكة Mount Sinai عبر روابط إيثرنت مزدوجة سعة 10 جيجابايت. العقد الممكّنة لـ GridFTP متاحة أيضًا لنقل البيانات بسرعة إلى مواقع خارجية.الوصول إلى موارد حسابية ISMMS مقيد بجدران الحماية ويتم توفير الوصول الخارجي من خلال shell / ftp الآمن مع المصادقة الثنائية.

تعد بيئات البرامج والبرمجة المتوفرة في Minerva هي الأفضل من نوعها ، وتتضمن معايير المجتمع مثل Linux و MPI. تقوم المجموعة بتشغيل مديري الموارد والجدولة لتحقيق التوازن بين عبء العمل ، وتحسينها لمعالجة أكبر عدد ممكن من الوظائف لتحقيق أعلى استخدام إجمالي للماكينة ، وإنتاجية العمل ، ومعدل نجاح المهمة. يتم تشغيل Minerva بوقت تشغيل يزيد عن 95٪ ، باستخدام تقنيات إدارة تكوين قابلة للتطوير وقابلة للتكرار. يتم توفير تخزين أرشفة طويل المدى بواسطة نظام Tivoli Storage Manager (TSM) عالي السعة ويحمي من فقدان البيانات. يتم الاحتفاظ بنسخة واحدة من الأشرطة خارج الموقع (نيو جيرسي) وتبقى نسخة واحدة في الموقع في Mount Sinai. جميع البيانات الموجودة على الأشرطة مشفرة. وفقا لسياسة سيناء ، يتم الاحتفاظ بالأشرطة لمدة ست سنوات على الأقل.

يوفر نظام ملفات Minerva سعة بيانات واسعة (ما يقرب من 14 بيتابايت من التخزين بشكل عام) لتخزين بيانات البحث والوصول إليها بأداء عالٍ ، استنادًا إلى IBM Spectrum Scale (المعروف سابقًا باسم GPFS). يتكون نظام ملفات Minerva من طبقات تخزين مختلفة لضمان استفادة المستخدمين من الحد الأقصى من الأداء ، ويتم تثبيته على حوالي 600 عقدة بما في ذلك تجمع فلاش بسعة 264 تيرابايت. معمل تطوير التكنولوجيا لديه مخصصات مخصصة تبلغ 670 تيرابايت لمختلف المشاريع بالتوازي.

تحليل خلية واحدة

جهة الاتصال: كريستين بومونت ، دكتوراه: أستاذ مساعد ومدير مشارك في تطوير تكنولوجيا الجينوم أحادية الخلية ([email protected])

سيتم توفير رابط نموذج التقديم عبر الإنترنت عند الانتهاء من تفاصيل المشروع. يجب تقديم نموذج التقديم هذا قبل تقديم العينة. يكون تسليم العينة بين الساعة 10 صباحًا و 3 مساءً (2 مساءً لـ CITESeq) في Icahn 13-76.

نحن نقدم مجموعة واسعة من المناهج القياسية والمخصصة لتحليل النسخ الفردية والمكانية ، المصممة حول الوصول إلى التكنولوجيا التالية:

عينة التحضير لتحليل خلية واحدة:

  • Miltenyi GentleMACS Octodissociator لتفكك الأنسجة إلى معلقات خلية واحدة
  • نظام فرز Levitas LeviCell (المتوقع في أبريل 2021) لإثراء الخلايا الحية / النوى قبل تحليل الخلية المفردة

خلية واحدة / تحليل النوى:

  • 10X Genomics Chromium system للحصول على إنتاجية عالية 3 & rsquo / 5 & rsquo تسلسل الحمض النووي الريبي من آلاف إلى عشرات الآلاف من الخلايا المفردة أو النوى لتحديد المجموعات السكانية الفرعية وتحليلات التعبير. نحن نقدم جميع التنميط المناعي ، و CITESeq ، و ATACSeq ، و RNA / ATACSeq متعدد الأجزاء ، ومقايسات خلية مفردة تعتمد على التطوير الإضافي باستخدام هذه الأدوات.

متطلبات الإدخال: تعليق خالٍ من الحطام لما لا يقل عن 500000 خلية (& gt80٪ صلاحية) لخلايا scRNASeq و scATACSeq وخلايا 1e6 على الأقل (& gt80٪ صلاحية) لـ CITESeq. يجب أن يكون التعليق بتركيز 1e6 خلية / مل في PBS + 0.04٪ BSA

  • CellSee منصة خلية واحدة لاختيار الخلايا ذات الإنتاجية المتوسطة والعالية وتطبيقات تطوير الأساليب المخصصة. تختلف متطلبات الإدخال حسب التجربة & ndash جهة الاتصال للحصول على التفاصيل.
  • منصة MissionBio Tapestri لتسلسل DNA amplicon التجاري والمخصص على مستوى الخلية المفردة. تختلف متطلبات الإدخال حسب التجربة & ndash جهة الاتصال للحصول على التفاصيل.
  • منارة Berkeley Lights منارة لعزل ما يصل إلى 3500 خلية مفردة (أو دفعات من الخلايا) لخلية واحدة أو بيولوجيا خلوية منخفضة الدخل في الوقت الفعلي مع العديد من خطوط الأنابيب الجزيئية لتوصيف الخلايا المفردة المختارة. تختلف متطلبات الإدخال حسب التجربة & ndash جهة الاتصال للحصول على التفاصيل.
  • Fluidigm C1 لعزل ما يصل إلى 96 خلية مفردة لاستخدامها بعد ذلك لأغراض تسلسل الخلية المفردة بالاشتراك مع خطوط الأنابيب الجزيئية المختلفة لتضخيم الحمض النووي الريبي و الحمض النووي للخلية الواحدة.
  • 10x Genomics Visium: نحن مزود خدمة معتمد لهذا الاختبار ، والذي يستخدم للتنميط النسخي المكاني للأنسجة حتى 6.5 مم × 6.5 مم.

متطلبات الإدخال: الأنسجة المجمدة الطازجة المخزنة في كتلة OCT لا يزيد حجمها عن 6.5 مم × 6.5 مم

المصفوفات الدقيقة

قام معهد Icahn لعلوم البيانات وتكنولوجيا الجينوم وقسم علم الوراثة وعلوم الجينوم باستثمار كبير في معدات المعالجة عالية الإنتاجية لمشاريع BeadArray الكبيرة. نحن نشغّل روبوتين مناولة السوائل TECAN Evo ، قادران على معالجة 24 شريحة في كل مرة. الماسح الضوئي Illumina HiScan microarray الخاص بنا هو أفضل نظام مع ذراع آلية تسمح بالحصول على بيانات ميكروأري على مدار 24 ساعة. من خلال المعدات والمرافق الموجودة ، يمكن لجوهر الجينوميات معالجة ما يصل إلى 600 عينة في الأسبوع.

إذا كنت ترغب في إرسال عينات لتحليل BeadArray ، يرجى الاطلاع على نموذج صفحة الإرسال للموقع والتسعير. التوجيه للتصميم التجريبي متاح أيضا.

حول المصفوفات الدقيقة

المصفوفات الدقيقة للحمض النووي هي تقنية راسخة لتوصيف الجينوم على نطاق واسع لنسخ الجينات ، وتغير النيوكليوتيدات الأحادية ، وتغير رقم النسخ ، ومثيلة السيتوزين اللاجينية. يستخدم جوهر علم الجينوم لدينا الطريقة الأكثر قوة ودقة في السوق & ndash & ndashthe منصة Illumina BeadArray.

تقليديا ، كانت المصفوفات الدقيقة عبارة عن شرائح زجاجية مطبوعة بخيوط DNA قصيرة. هذه الطريقة لها عيوب خطيرة مثل مورفولوجيا البقعة غير المتساوية ، وتحيز الإشارة بسبب موضع البقعة ، ومرونة التصميم المنخفضة. تعتبر BeadArrays طريقة فريدة لتقنية المصفوفات الدقيقة ، باستخدام شرائح زجاجية ذات فتحات بحجم الميكرومتر لإيواء حبات مغلفة بقليل النوكليوتيد. يتم استخدام BeadArrays كمصفوفة قياسية ، باستثناء خطوة فك الترميز الجزيئي التي يتم تنفيذها بواسطة الماسح الضوئي.

يمكن استخدام منصة BeadArray للتنميط الجيني ، وتقدير نسخ الجينات ، ومثيلة السيتوزين.

غالبًا ما يتم إجراء دراسات التنميط الجيني البشري باستخدام Infinium HD باستخدام OmniExpress (750k SNPs) أو Omni2.5-8 صفيفات (2.4M SNPs). هذه الرقائق قادرة أيضًا على تقدير متغير رقم النسخ (CNV). تتوفر أيضًا رقائق محتوى مخصصة لدراسات ارتباط الجينوم الواسع (GWAS). لمزيد من المعلومات ، يرجى الاتصال بنا مع تفاصيل مشروعك.

تتوفر رقائق تحليل التعبير الجيني للبشر والفئران والجرذان. تحتوي جميع الرقائق على جميع الجينات المعروفة والعديد من الحمض النووي الريبي التنظيمي. اعتبارًا من مارس 2012 ، أوقفت شركة Illumina رقائق microRNA وخدمات التعبير الجيني المخصصة.

يمكن إجراء مسح الميثلة على مستوى الجينوم في العينات البشرية (بما في ذلك الخلايا الجذعية والخلايا السرطانية) باستخدام مجموعة مثيلة بشرية 450 كيلو. تغطي هذه المجموعة جزر CpG والمواقع المعروفة بأنها ميثلة في المروجين ومواقع DNase شديدة الحساسية ومناطق مروج miRNA.

تعرف على المزيد حول عينات الفورمالين الثابتة والمدمجة بالبارافين والتي يمكن استخدامها في دراسات التنميط الجيني


مركز تسلسل الجيل التالي من Science Park - Smithville

تم إنشاء مرفق تسلسل الجيل التالي (NGS) التابع لمركز إم دي أندرسون للسرطان التابع لجامعة تكساس في عام 2012 ، بدعم من جائزة دعم المرافق الأساسية البالغة 6 ملايين دولار من CPRIT. تم تجديد دعم هذا المرفق بشكل تنافسي في عام 2016 مع مكافأة إضافية لدعم المرافق الأساسية CPRIT بقيمة 5 ملايين دولار. منشأتنا هي مورد NGS إقليمي في وسط تكساس يدعم أبحاث السرطان المبتكرة وعالية التأثير التي تتطلب إمكانات واسعة النطاق لتسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من NGS. تم بناء منشأة NGS الخاصة بنا حول مجموعة مستخدمين تضم أكثر من 40 باحثًا في مجال السرطان من MD Anderson Science Park وحرم هيوستن ، UT Austin ، UT Medical School Houston ، Baylor College of Medicine ، The Methodist Hospital Research Institute ، جامعة رايس ، Texas A & ampM ، وتكساس جامعة الولاية - سان ماركوس. يمكن للباحثين المؤهلين الآخرين في منطقة وسط تكساس الوصول إلى خدمات مرفق NGS ، رهنا بتوافر الوقت على جهاز التسلسل. لقد أنشأنا العديد من بروتوكولات التسلسل ، بما في ذلك بروتوكولات للعينات منخفضة المدخلات وخطوط أنابيب المعلوماتية الحيوية المرتبطة بها. نواصل إضافة قدرات جديدة بناءً على احتياجات البحث لمجموعة مستخدمينا.

يتطلب استخدام هذا العنصر الأساسي إقرارًا بمنح دعم المرافق الأساسية CPRIT (# RP120348 & amp # RP170002) في منشوراتك بغض النظر عن مصدر التمويل.


الحالة الحالية لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشر - علم الأحياء

REPAIRtoire هي قاعدة بيانات على الإنترنت لبيولوجيا أنظمة تلف الحمض النووي وإصلاحه. تجمع قاعدة البيانات وتنظم الأنواع التالية من المعلومات: (1) تلف الحمض النووي المرتبط بالعوامل البيئية المطفرة والسمية للخلايا ، (2) المسارات التي تشتمل على العمليات الفردية والتفاعلات الأنزيمية المتضمنة في إزالة الضرر ، (3) البروتينات المشاركة في إصلاح الحمض النووي و (4) الأمراض المرتبطة بالطفرات في الجينات التي تشفر بروتينات إصلاح الحمض النووي. يتم تمثيل مسارات إصلاح الحمض النووي والتسامح على شكل رسوم بيانية وفي شكل جدول مع أوصاف كل خطوة إصلاح والبروتينات المقابلة ، ويتم الرجوع إلى الإدخالات الفردية إلى الأدبيات الداعمة وقواعد البيانات الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر على الإنترنت أداة لرسم مجمعات بروتينات DNA مخصصة.

SpliProt3D هي قاعدة بيانات على الإنترنت من الهياكل التمثيلية المحددة تجريبياً والمتوقعة حسابيًا لبروتينات جسيم لصق الإنسان.

MODOMICS هو أول نظام قاعدة بيانات شامل لبيولوجيا أنظمة تعديل الحمض النووي الريبي. إنه يدمج المعلومات حول التركيب الكيميائي للنيوكليوسيدات المعدلة ، وتوطينها في تسلسل الحمض النووي الريبي ، ومسارات تركيبها الحيوي والإنزيمات التي تنفذ التفاعلات المعنية (بما في ذلك تسلسل البروتين وبيانات الهيكل المتوفرة). كما يوفر معلومات الأدبيات وروابط لقواعد البيانات الأخرى. يمكن الاستعلام عن قاعدة البيانات عن طريق نوع النيوكليوسيد (على سبيل المثال A ، G ، C ، U ، I ، m1A ، nm5s2U ، إلخ) ، نوع الحمض النووي الريبي ، موضع نيوكليوسيد معين ، نوع التفاعل (مثل المثيلة ، الثيول ، نزع الأمين ، إلخ) ، واسم أو تسلسل إنزيم مهم. تتضمن خيارات عرض البيانات رسومًا بيانية للمسارات التي تشتمل على نوكليوزيد الاستعلام ، ومحاذاة تسلسل متعددة لتسلسل الحمض النووي الريبي ، وأشكال جدولية مع بيانات الإنزيم والأدب. يمكن الوصول إلى محتويات MODOMICS من خلال شبكة الويب العالمية على http://genesilico.pl/modomics/

RNA Bricks هي قاعدة بيانات لزخارف بنية RNA ثلاثية الأبعاد وجهات اتصالها ، سواء مع نفسها أو مع البروتينات. توفر قاعدة البيانات التعليقات التوضيحية لدرجات جودة الهيكل والأدوات اللازمة للبحث والمقارنة حول بنية RNA ثلاثية الأبعاد.

RNArchitecture هي قاعدة بيانات توفر وصفًا شاملاً للعلاقات بين العائلات المعروفة من RNAs المهيكلة غير المشفرة ، مع التركيز على أوجه التشابه البنيوية. التصنيف هرمي ويشبه النظام المستخدم في قواعد بيانات SCOP و CATH لهياكل البروتين. مستواها المركزي هو Family ، الذي يبني على كتالوج Rfam ، ويجمع RNAs وثيقة الصلة. يتم وصف هياكل الإجماع للعائلات بتمثيل هيكل ثانوي منخفض. يتم تجميع العائلات ذات الصلة التطورية في العائلات الفائقة. يتم تجميع الهياكل المماثلة كذلك في البنى. المستوى الأعلى ، الفئة ، ينظم العائلات في فئات هيكلية واسعة جدًا ، مثل الحمض النووي الريبي المركب البسيط أو المعقد. يتم حاليًا تصنيف بعض المجموعات في مستويات مختلفة من التسلسل الهرمي على أنها & ldquounclassified & rdquo. لكل عائلة بها بنية (هياكل) ثلاثية الأبعاد محددة تجريبياً ، يتم توفير بنية تمثيلية. تقدم RNArchitecture أيضًا نماذج نظرية لهيكل RNA 3D وهي مفتوحة لتقديم النماذج الهيكلية من قبل المستخدمين. مقارنة بقواعد البيانات الأخرى ، تعتبر RNArchitecture فريدة من نوعها في تركيزها على تصنيف RNA القائم على الهيكل ، وفي توفير منصة لتخزين تنبؤات بنية RNA ثلاثية الأبعاد. يمكن الوصول إلى RNArchitecture على http://iimcb.genesilico.pl/RNArchitecture/.

* من المتوقع أن يتطور التصنيف مع توفر بيانات جديدة ونود تشجيع جميع الأطراف المهتمة على تقديم اقتراحاتهم للتحسين بالإضافة إلى تنبؤات الهيكل ثلاثي الأبعاد *

تلخص الخرائط ثنائية الأبعاد لجهات الاتصال التفاعلات بين الأحماض الأمينية في الهيكل. إنها تكشف عن أنماط مميزة للتفاعلات بين الهياكل الثانوية والثانوية الفائقة وهي جذابة للغاية للتحليل البصري. يمكن بسهولة حساب التداخل في خرائط التلامس المتبقية لهيكلين ، مما يوفر مقياسًا حساسًا لتشابه بنية البروتين.

لقد طورنا طريقة لنمذجة تجانس ثلاثية الأبعاد لهياكل الحمض النووي الريبي. يتطلب محاذاة تسلسل زوجي وقالب هيكلي لإنشاء نموذج هيكلي ثلاثي الأبعاد لتسلسل RNA الهدف إما عن طريق مقاربات مؤتمتة بالكامل أو قائمة على البرنامج النصي. ModeRNA قادر على التعامل مع 115 تعديلاً مختلفًا للنيوكليوتيدات وسد الفجوات باستخدام شظايا مشتقة من مكتبة شظايا واسعة النطاق.

RNAmap2D هي أداة برمجية لحساب خرائط الاتصال والمسافة بناءً على معايير يحددها المستخدم ، وإلى حد ما ، مقارنة كمية للأزواج أو سلسلة من خرائط جهات الاتصال وتصور النتائج.

Filtrest3D هو برنامج للتمييز بين عدد كبير من النماذج البديلة لهيكل البروتين أو هيكل بروتين - ليجند ضد مجموعة من القيود المشتقة من التحليلات التجريبية منخفضة الدقة (مثل الربط المتبادل ، والطفرات ، والخلل الدائري ، وما إلى ذلك) وكذلك من التنبؤات الحسابية (مثل إمكانية الوصول إلى المذيبات وخرائط التلامس بالأحماض الأمينية).

PyRy3D هي أداة برمجية لنمذجة الهياكل للمجمعات الجزيئية الكبيرة. يستخدم محاكاة مونت كارلو لأخذ عينات من مساحة التوافق ولتحديد أفضل ملاءمة لهياكل المكونات المعقدة في خريطة الكثافة. تعتمد عملية البناء المعقدة على قيود المسافة المستمدة من التجارب.

لقد طورنا اثنين من الإمكانات ذات الدقة المتوسطة والقائمة على المعرفة لتسجيل نماذج البروتين-الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها عن طريق الالتحام: الإمكانات شبه الكيميائية (QUASI-RNP) والشراك الخداعية باعتبارها إمكانات الحالة المرجعية (DARS-RNP). تستخدم كلتا الإمكانات تمثيلًا خشنًا للحبيبات لكل من جزيئات الحمض النووي الريبي والبروتين وقادران على التعامل مع هياكل الحمض النووي الريبي مع المخلفات المعدلة بعد النسخ. في اختباراتنا التي قارنت هذه الطرق بالإمكانيات الأخرى المنشورة ، أظهر DARS-RNP أعلى قدرة على تحديد الهياكل الشبيهة بالأصلية.

SimRNA - أداة لمحاكاة ديناميات RNA المطابقة ، بما في ذلك تنبؤ بنية RNA 3D

SupeRNAlign هي أداة للتراكب المرن لهياكل RNA ثلاثية الأبعاد. ينفذ برنامجنا خوارزمية تكرارية تقسم هياكل الحمض النووي الريبي إلى أجزاء وتثبيتها باستخدام الأدوات الموجودة (حاليًا محاذاة R3D). أخيرًا ، يتم حفظ الهياكل المتراكبة في ملف .pdb ويتم إنشاء محاذاة تسلسل.

QRNAS هو امتداد لطريقة محاكاة AMBER مع شروط إضافية مرتبطة بروابط هيدروجينية واضحة ، وأزواج قاعدة مستوية مشتركة ، وتنظيم العمود الفقري ، والقيود المخصصة. QRNAS قادر على التعامل مع RNA و DNA و chimeras و hybrids منها ، ويتيح نمذجة الأحماض النووية التي تحتوي على بقايا معدلة.

SimRNAweb هي واجهة خادم ويب لطريقة SimRNA لطريقة نمذجة بنية RNA 3D

يعد GeneSilico MetaServer بوابة لعدد من طرق الطرف الثالث للتنبؤ بهيكل البروتين (تحديد المجالات ، والتنبؤ بالهيكل الثانوي ، والتعرف على أضعاف ، وأخيراً ، إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد). يمكن للمستخدمين إرسال تسلسل البروتين (أو المحاذاة) بنقرة واحدة ، ثم تحليل ملخص النتائج الناتجة عن العديد من الطرق ، والتنبؤ في النهاية ببنية البروتين وفقًا لنهج "الإجماع".

تبني هذه الأداة نماذج البروتين عن طريق إعادة تجميع أجزاء من محاذاة التعرف على الطيات. يمكن للمستخدمين تحديد مجموعة من المحاذاة من إخراج MetaServer أو تقديم المحاذاة الخاصة بهم. سيقوم البرنامج بتوليد نماذج بديلة ، وتحديد الأجزاء التي تظهر إما توافق الآراء في نماذج مختلفة أو - في حالة عدم وجود توافق في الآراء - تظهر أفضل توافق نسبيًا للأحماض الأمينية مع بيئة بقية النموذج. سيتم إعادة تجميع هذه الأجزاء لإنشاء نموذج هجين ، والذي سيتم تحسينه بشكل أكبر من خلال تجربة محاذاة بديلة في المناطق غير المتوافقة لتحسين توافق بنية التسلسل.

يسهل هذا الخادم البسيط العرض المرئي لهياكل البروتين ثلاثية الأبعاد (3D). إنها بوابة لعدد من الطرق لتقييم بنية البروتين (ANOLEA أو PROSAII أو PROVE أو VERIFY3D) ، ولكنها تحدد أيضًا المخلفات المدفونة وتصور الحفظ المتسلسل. كمدخل ، فإنه يأخذ ملف PDB ، واختيارياً ، محاذاة تسلسل متعدد. كإخراج ، يقوم الخادم بإرجاع ملف يتم فيه استبدال عمود عامل B بقيم المعلمة المختارة (جودة البنية أو دفن المخلفات أو الحفظ). يمكن تصور هذه القيم على هيئة ألوان باستخدام عارضات البنية مثل RASMOL أو SWISS PDB VIEWER.

هذا إصدار "ألفا" من الخادم للتمييز بين عدد كبير من النماذج البديلة لبنية البروتين مقابل مجموعة من القيود المشتقة من التحليلات التجريبية منخفضة الدقة (مثل الارتباط المتبادل ، والطفرات ، والازدواج الدائري ، وما إلى ذلك) أيضًا. بدءًا من التنبؤات الحسابية (مثل إمكانية الوصول إلى المذيبات وخرائط التلامس بالأحماض الأمينية).

بينما تحسب معظم طرق النشوء والتطور الأشجار بناءً على محاذاة التسلسل ، فإن هذا الخادم (STRUcture CLAssification) يسمح باستخدام هياكل البروتين. المدخلات المسبقة عبارة عن محاذاة لإحداثيات البروتين المصدرة من SWISS PDB VIEWER. يحدد المستخدم المسافة المقطوعة ويختار المقاييس التي يجب استخدامها لحساب "المسافات التطورية" بين هياكل البروتين. يعرض الخادم سلسلة من الأشجار غير المتجذرة بتنسيق NEXUS ومصفوفات المسافة المقابلة ، بالإضافة إلى شجرة إجماع. هذه الطريقة مفيدة للغاية في "منطقة التماثل الشفق" ، حيث تكون متواليات الأحماض الأمينية متباينة للغاية بحيث لا توفر علاقات موثوقة.

يوفر خادم الويب CompaRNA معيارًا مستمرًا لطرق خادم الويب والمستقلة المؤتمتة للتنبؤ بالهيكل الثانوي لـ RNA. لقد تم استلهامها من خوادم EVA و Livebench لقياس أدوات التنبؤ ببنية البروتين ، والتي ساهمت بشكل كبير في التقدم في مجال المعلوماتية الحيوية الهيكلية. الهدف من CompaRNA هو تقييم حالة الفن في التنبؤ بهيكل الحمض النووي الريبي ، وتقديم صورة مفصلة لما هو ممكن باستخدام الأدوات المتاحة ، وأين يتم إحراز التقدم وما هي المشاكل الرئيسية المتبقية. يعد خادم CompaRNA مصدرًا قيمًا لجميع الباحثين الذين يركزون اهتمامهم على استخدام وتطوير أساليب التنبؤ بهيكل الحمض النووي الريبي.

خادم ModeRNA هو أداة عبر الإنترنت لنمذجة بنية RNA ثلاثية الأبعاد من خلال النهج المقارن ، بناءً على بنية RNA للقالب ومحاذاة تسلسل القالب المستهدف المحدد من قبل المستخدم. يوفر خيارًا للبحث عن القوالب المحتملة ، بالنظر إلى التسلسل المستهدف. يوفر الخادم أيضًا أدوات لتحليل وتحرير وتنسيق ملفات بنية RNA. يسهل استخدام برنامج ModeRNA ويقدم خيارات جديدة مقارنة بالبرنامج المستقل.

MetalionRNA هو خادم ويب للتنبؤ بأيونات المعادن (المغنيسيوم والصوديوم والبوتاسيوم) في هياكل RNA ثلاثية الأبعاد ، بناءً على إمكانات إحصائية مستخلصة من تحليل مواقع الربط التي لوحظت في هياكل RNA التي تم حلها تجريبياً. الخادم قادر أيضًا على التنبؤ بمواقع ربط Mg2 + لهياكل الحمض النووي.

MetaGramLocN هي طريقة للتنبؤ بالتوطين الخلوي للبروتينات سالبة الجرام. MetaGramLocN هي بوابة لعدد من طرق التنبؤ الأولية (أنواع مختلفة: ببتيد الإشارة ، برميل بيتا ، حلزونات عبر الغشاء وتنبؤات التوطين دون الخلوي).تدمج MetaGramLocN الطرق الأولية وتوفر بناءً على مخرجاتها تنبؤات عامة بالتوافق. لإجراء تنبؤ لتسلسل البروتين الخاص بك ، استخدم إرسال أو عميل SOAP في معيارنا ، كان أداء MetaLocGramN أفضل مقارنة بالطرق التنبؤية الأخرى لـ SCL ، نظرًا لأن متوسط ​​معامل ارتباط Matthews وصل إلى 0.806 مما عزز القدرة التنبؤية بنسبة 12٪ (مقارنة بـ PSORTb3) .

لا تضمن تجارب التبلور المشترك للبروتينات مع الأحماض النووية وجود كلا المكونين في البلورة. أثناء عمله كطالب دكتوراه مع Matthias Bochtler ، طور Grzegorz Chojnowski DIBER - طريقة يمكن من خلالها التنبؤ بالمحتوى البلوري (DNA؟ بروتين؟ أو كليهما؟) من بيانات الحيود. الآن ، قمنا معًا بتطوير RIBER ، والذي يجب استخدامه عندما يكون البروتين و RNA في انخفاض التبلور. تعتمد مجموعة RIBER / DIBER المدمجة على تقنيات التعلم الآلي لعمل تنبؤات كمية موثوقة لمحتوى الكريستال للمستخدمين غير الخبراء وعلم البلورات عالي الإنتاجية. يتطلب RIBER / DIBER بيانات الحيود بدقة 3.0 Å على الأقل بتنسيق MTZ أو CIF.

MinkoFit3D هي طريقة لتركيب مجموعات الجزيئات الكبيرة أو مكوناتها في خرائط كثافة الإلكترون. يعتمد نهجنا على إيجاد "ممرات ضيقة" مستدل عليها من حد مجموع مينكوفسكي لسطحين متعددي السطوح للهيكل وخريطته. بعد التوافق الأولي ، يتم استخدام القوة الغاشمة القوية أو الخوارزمية الجينية لبناء تجميع أولي ، ويتم تطبيق صقل متعدد الأجسام في مساحة كثافة الإلكترون المباشرة.

يعد GeneSilico MetaServer بوابة لعدد من طرق الطرف الثالث للتنبؤ بهيكل البروتين (تحديد المجالات ، والتنبؤ بالهيكل الثانوي ، والتعرف على أضعاف ، وأخيراً ، إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد). يمكن للمستخدمين إرسال تسلسل البروتين (أو المحاذاة) بنقرة واحدة ، ثم تحليل ملخص النتائج الناتجة عن العديد من الطرق ، والتنبؤ في النهاية ببنية البروتين وفقًا لنهج "الإجماع".

يوفر RNAmetaserver الوصول إلى التسلسل الفردي (21) والطرق المقارنة (14) للتنبؤ بالهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي. يأخذ تسلسل RNA الخاص بك ، ويرسله إلى البرامج التمهيدية للهيكل الثانوي المثبتة محليًا على الخادم ، ويجمع كل الهياكل المتوقعة ، إلى جانب التنبؤ التلوي المحسوب بواسطة RNAmetaserver ، يعرضها في النتائج. يعد التنبؤ التلوي الذي تم إنشاؤه بواسطة الخادم هو أفضل هيكل ثانوي ممكن لتسلسل RNA للاستعلام وفقًا لمعايير CompaRNA

يوفر QA-RecombineI واجهة ويب لتقييم جودة نماذج بنية البروتين ثلاثية الأبعاد ولتحسين دقة النماذج عن طريق دمج أجزاء من نماذج الإدخال المتعددة. في المرحلة الأولى (وضع QA) ، يتنبأ خادمنا بالجودة العالمية لنماذج الإدخال ويقدم تقديرات للجودة المحلية مثل الانحراف بين ذرات C-α في النماذج والذرات المقابلة في البنية الأصلية غير المعروفة. جنبًا إلى جنب مع نماذج الإدخال ، أصبحت هذه التنبؤات لاحقًا مدخلات للمرحلة الثانية (RecombineIt-mode) ، حيث يتم دمج الأجزاء التي يُتوقع أن تكون أفضل من غيرها بشكل حكيم لتوليد نماذج هجينة (إجماع). أخيرًا ، يتم تسجيل النماذج الهجينة بواسطة MQAPs المطبقة في وضع ضمان الجودة ثم تقديمها إلى المستخدم

NPDock هو خادم ويب لنمذجة الهياكل المعقدة للبروتين-RNA والبروتين-DNA. فهو يجمع بين GRAMM لرسو السفن الجزيئي العالمي ، والتسجيل مع إمكانات إحصائية ، وتجميع الهياكل الحاصلة على أفضل الدرجات ، والتحسين المحلي.

ClaRNA هي طريقة جديدة للتصنيف الحسابي لجهات الاتصال في هياكل RNA ثلاثية الأبعاد. الميزات الفريدة للبرنامج هي القدرة على تحديد جهات الاتصال غير الكاملة ومعالجة النماذج ذات الحبيبات الخشنة. تتم مقارنة كل مزدوج من بقايا الريبونوكليوتيد القريبة مكانيًا في بنية الاستعلام بمجموعات المضاعفات المرجعية التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل عدد كبير من هياكل الحمض النووي الريبي المحددة تجريبياً ، وتعيين درجة تصف تشابهها مع نوع واحد أو أكثر من أنواع الاتصالات المعروفة ، بما في ذلك الاقتران ، التراص ، تفاعلات القاعدة مع الفوسفات وقاعدة الريبوز.

يبني خادم الويب BrickworX نماذج RNA و DNA في خرائط كثافة الإلكترون بدقة منخفضة تصل إلى 4 Å. عند الإدخال ، يتطلب البرنامج ملف MTZ مع اتساع ومراحل عامل البنية.

GDFuzz3D هي طريقة لنمذجة بنية البروتين ثلاثية الأبعاد ، والتي تبدأ من تسلسل البروتين وخريطة التلامس بين بقايا الأحماض الأمينية. يمكنه التعامل مع الخرائط المتوقعة التي تحتوي على سبيل المثال ، احتمالات جهات الاتصال بين جميع المخلفات ، وجزء كبير من جهات الاتصال التي تم توقعها بشكل غير صحيح. إنه غير مناسب للتنبؤ بالهياكل بناءً على الخرائط مع عدد قليل من جهات الاتصال المتوقعة.

يأخذ البرنامج كمدخل مجموعة من تسلسلات الحمض النووي الريبي غير المعدلة ومجموعة من متواليات البروتين المقابلة لبروتين الخلية ، ويحدد جميع بقايا الحمض النووي الريبي التي تتوافق مع مواقع التعديل المعروفة مع الإنزيمات المعروفة ، ويعثر على متماثلات من إنزيمات تعديل الرنا الريباسي المعروفة ، والخرائط التنبؤات على المسارات المعروفة لتعديل الحمض النووي الريبي ، لتحديد تفاعلات التعديل الممكنة نظريًا لجميع المواضع في tRNAs الاستعلام.

SupeRNAlign هي أداة للتراكب المرن لهياكل RNA ثلاثية الأبعاد. ينفذ برنامجنا خوارزمية تكرارية تقسم هياكل الحمض النووي الريبي إلى أجزاء وتثبيتها باستخدام الأدوات الموجودة (حاليًا محاذاة R3D). أخيرًا ، يتم حفظ الهياكل المتراكبة في ملف .pdb ويتم إنشاء محاذاة تسلسل.


شاهد الفيديو: الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين YouTube (شهر نوفمبر 2022).