معلومة

كيف تحل محل منطقة إنترون في البلازميد؟

كيف تحل محل منطقة إنترون في البلازميد؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أفكر في العمل مع pRFHUE-eGFP البلازميد وأود استبدال gpdA intron (وهي منطقة مروج eGFP) بمروج من كائن حي آخر.

ما هي الإستراتيجية الجيدة لاستبدال intron إذا كان لدي بالفعل الجين الآخر في متناول اليد؟ هل سأقطع الشظية بين مواقع تقييد SalI و SmaI ثم أدخل المروج الجديد مع البروزات المتوافقة هناك؟


ستنجح استراتيجيتك ، ولكن إذا كان ذلك ممكنًا ، فقد يكون من الأفضل لك استخدام XmaI بدلاً من SmaI ، لأن الأخير عبارة عن إنزيم قطع غير حاد.

علاوة على ذلك ، لن تحل استراتيجيتك محل الكل gpdA المروج ، إذا كان هذا ما تبحث عنه. قد ترغب في الرجوع إلى ورقتهم ، حيث يتضح من الشكل 1 أن منطقة المروج أطول بكثير من المنطقة الواقعة بين SalI و SmaI:


تحتوي العديد من البكتيريا على عناصر إضافية من الحمض النووي تسمى الكروموسومات البلازميدات. عادة ما تكون هذه الجزيئات صغيرة (بضعة 1000 نقطة أساس) ، دائرية ، مزدوجة الجديلة تتكاثر بشكل مستقل عن الكروموسوم ويمكن أن توجد بأعداد نسخ عالية داخل الخلية. في البرية ، يمكن أن تنتقل البلازميدات بين الأفراد أثناء التزاوج البكتيري وأحيانًا يتم نقلها بين الأنواع المختلفة. تعتبر البلازميدات ذات أهمية خاصة في الطب لأنها غالبًا ما تحمل الجينات المسببة للأمراض ومقاومة الأدوية. في المختبر ، يمكن إدخال البلازميدات في البكتيريا في عملية تسمى التحول.

لإدخال جزء من الحمض النووي في البلازميد ، يتم قطع كل من الجزء والبلازميد الدائري باستخدام إنزيم تقييد ينتج نهايات متوافقة (الشكل ( فهرس الصفحة <1> )). نظرًا للعدد الكبير من إنزيمات التقييد المتوفرة حاليًا ، فعادةً ما يكون من الصعب جدًا العثور على إنزيم توجد له تسلسلات التعرف المقابلة في كل من جزء البلازميد والحمض النووي ، خاصةً لأن معظم نواقل البلازميد المستخدمة في البيولوجيا الجزيئية قد تمت هندستها لاحتواء مواقع التعرف على عدد كبير من نوكليازات التقييد.

الشكل ( PageIndex <1> ): استنساخ جزء من الحمض النووي (أحمر) في ناقل بلازميد. يحتوي الناقل بالفعل على جين محدد محدد (أزرق) مثل الجين المقاوم للمضادات الحيوية. (الأصل- Deyholos-CC: AN)

بعد الهضم المقيد ، يمكن تنقية أو اختيار الأجزاء المرغوبة قبل خلطها مع الليجاز لضمها معًا. بعد فترة حضانة قصيرة ، تكون البلازميدات المربوطة حديثًا ، والتي تحتوي على الجين المعني تحول إلى بكتريا قولونية. يتم تحقيق التحول عن طريق خلط الحمض النووي المترابط مع بكتريا قولونية الخلايا التي تم تحضيرها خصيصًا (أي مصنوعة مختص) لامتصاص الحمض النووي. يمكن تكوين الخلايا المختصة بالتعرض لمركبات مثل CaCl2 أو في المجالات الكهربائية (التفريد الكهربي). نظرًا لأن جزءًا صغيرًا فقط من الخلايا الممزوجة بالحمض النووي سيتحول بالفعل ، أ علامة اختيار، مثل الجين الخاص بمقاومة المضادات الحيوية ، عادة ما يكون موجودًا أيضًا في البلازميد. بعد التحول (الجمع بين الحمض النووي والخلايا المختصة) ، تنتشر البكتيريا على صفيحة أجار بكتيرية تحتوي على مضاد حيوي مناسب بحيث تكون الخلايا التي أدمجت البلازميد فقط قادرة على النمو وتشكيل المستعمرات. يمكن بعد ذلك اختيار هذا واستخدامه لمزيد من الدراسة.

يستخدم علماء الأحياء الجزيئية البلازميدات مثل ثلاثة أبعاد لاحتواء وتضخيم ونقل وأحيانًا التعبير عن الجينات المهمة الموجودة في الحمض النووي المستنسخ. غالبًا ما تكون الخطوة الأولى في تجربة البيولوجيا الجزيئية هي استنساخ (أي نسخ) الجين إلى بلازميد ، ثم قم بتحويل هذا البلازميد المؤتلف مرة أخرى إلى بكتيريا بحيث يمكن صنع نسخ غير محدودة من الجين (والبلازميد الذي يحمله) أثناء تكاثر البكتيريا. هذه ضرورة عملية لمزيد من التلاعب بالحمض النووي ، لأن معظم تقنيات البيولوجيا الجزيئية ليست حساسة بما يكفي للعمل مع جزيء واحد فقط في كل مرة. ولذلك ، فإن العديد من تجارب الاستنساخ الجزيئي وإعادة التركيب هي عمليات تكرارية حيث:

  1. يتم استنساخ جزء من الحمض النووي (عادةً ما يتم عزله عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل و / أو الهضم المقيد) في قطع بلازميد باستخدام إنزيم تقييد متوافق
  2. يتحول البلازميد المؤتلف إلى بكتيريا
  3. يسمح للبكتيريا بالتكاثر ، عادة في الثقافة السائلة
  4. يتم عزل كمية كبيرة من DNA البلازميد المؤتلف من الثقافة البكتيرية
  5. يتم إجراء المزيد من المعالجات (مثل الطفرات الموجهة للموقع أو إدخال قطعة أخرى من الحمض النووي) على البلازميد المؤتلف
  6. يتحول البلازميد المعدل مرة أخرى إلى بكتيريا ، قبل المزيد من التلاعب ، أو للتعبير

تطبيق الاستنساخ الجزيئي: إنتاج الأنسولين المؤتلف

بروتين الأنسولين المنقى أمر بالغ الأهمية لعلاج مرض السكري. قبل ذ لك

1980 ، تم عزل الأنسولين للاستخدام السريري من الجثث البشرية أو من الحيوانات المذبوحة مثل الخنازير. بشكل عام ، كان للأنسولين المشتق من الإنسان خصائص دوائية أفضل ، ولكن كان العرض محدودًا وكان يحمل مخاطر انتقال المرض. عن طريق استنساخ جين الأنسولين البشري والتعبير عنه بكتريا قولونية، كميات كبيرة من الأنسولين مماثلة لهرمون الإنسان يمكن إنتاجها في المخمرات بأمان وكفاءة. يسمح إنتاج الأنسولين المؤتلف أيضًا بإنتاج متغيرات متخصصة من البروتين: على سبيل المثال ، عن طريق تغيير عدد قليل من الأحماض الأمينية ، يمكن صنع أشكال أطول من الهرمون. يحتوي هرمون الأنسولين النشط على جزأين من الببتيد من 21 و 30 حمضًا أمينيًا ، على التوالي. اليوم ، يتم إنتاج جميع الأنسولين بشكل أساسي من مصادر مؤتلفة (الشكل ( فهرس الصفحة <2> )) ، أي الجينات البشرية ومشتقاتها معبر عنها في البكتيريا أو الخميرة.

الشكل ( PageIndex <2> ): قارورة أنسولين. لاحظ أن الملصق يسرد الأصل كـ & ldquorDNA & rdquo ، والذي يرمز إلى الحمض النووي المؤتلف. (Flickr-DeathByBokeh-CC: AN)


محتويات

طول التحرير

يبدأ UTR 5 في موقع بدء النسخ وينتهي بنوكليوتيد واحد (nt) قبل تسلسل البدء (عادةً AUG) لمنطقة التشفير. في بدائيات النوى ، يميل طول UTR 5 إلى أن يكون 3-10 نيوكليوتيدات ، بينما في حقيقيات النوى يميل إلى أن يكون في أي مكان من 100 إلى عدة آلاف من النيوكليوتيدات. [3] على سبيل المثال ، ste11 نسخة شيزوساكارومايس بومب يحتوي على 2273 نيوكليوتيد 5 ′ UTR [4] بينما لاك أوبرون في الإشريكية القولونية فقط سبعة نيوكليوتيدات في 5 ′ UTR. [5] من المحتمل أن ترجع الأحجام المختلفة إلى تعقيد تنظيم حقيقيات النوى الذي يحمله UTR 5-UTR بالإضافة إلى مجمع ما قبل البدء الأكبر الذي يجب أن يتشكل لبدء الترجمة.

يمكن أيضًا أن يكون UTR 5 مفقودًا تمامًا ، في حالة mRNAs بلا زعيم. تقبل الريبوسومات في جميع مجالات الحياة الثلاثة وترجمتها. [6] توجد هذه التسلسلات بشكل طبيعي في جميع مجالات الحياة الثلاثة. يمتلك البشر العديد من الجينات المرتبطة بالضغط تحت قائد 2 - 3 نيوكليوتيدات. تحتوي الثدييات أيضًا على أنواع أخرى من القادة قصيري القامة مثل تسلسل TISU. [7]

تحرير العناصر

تختلف عناصر حقيقية النواة وبدائية النواة 5 ′ UTR اختلافًا كبيرًا. يحتوي UTR بدائية النواة 5 على موقع ربط الريبوسوم (RBS) ، المعروف أيضًا باسم تسلسل Shine – Dalgarno (AGGAGGU) ، والذي يكون عادةً من 3 إلى 10 أزواج قاعدية من كودون البدء. [5] على النقيض من ذلك ، فإن حقيقيات النوى 5 ′ UTR تحتوي على تسلسل إجماع Kozak (ACCAUGG) ، والذي يحتوي على كودون البدء. [5] حقيقيات النوى 5 ′ UTR تحتوي أيضًا على رابطة الدول المستقلة- تفعيل العناصر التنظيمية المسماة إطارات القراءة المفتوحة المنبثقة (uORFs) و AUGs المنبثقة (uAUGs) ورموز الإنهاء ، والتي لها تأثير كبير على تنظيم الترجمة (انظر أدناه). على عكس بدائيات النوى ، يمكن أن تؤوي 5 ′ UTRs الإنترونات في حقيقيات النوى. في البشر،

35٪ من الجينات تؤوي الإنترونات ضمن 5 ′ UTR. [8]

تعديل الهيكل الثانوي

نظرًا لأن UTR 5-UTR يحتوي على نسبة عالية من GC ، فغالبًا ما تحدث الهياكل الثانوية داخله. حلقات دبوس الشعر هي إحدى هذه الهياكل الثانوية التي يمكن وضعها داخل 5 ′ UTR. تؤثر هذه الهياكل الثانوية أيضًا على تنظيم الترجمة. [9]

بدائيات النوى تحرير

في البكتيريا ، يحدث بدء الترجمة عندما ترتبط IF-3 ، جنبًا إلى جنب مع الوحدة الفرعية الريبوسومية 30S ، بتسلسل Shine-Dalgarno (SD) الخاص بـ 5 UTR. [5] يؤدي هذا بعد ذلك إلى تجنيد العديد من البروتينات الأخرى ، مثل الوحدة الفرعية الريبوزومية 50S ، والتي تسمح ببدء الترجمة. تنظم كل خطوة من هذه الخطوات بدء الترجمة.

البدء في العتائق أقل فهمًا. تعد متواليات SD أكثر ندرة ، وتشارك عوامل البدء أكثر مع العناصر حقيقية النواة. لا يوجد تجانس للبكتيريا IF3. [10] بعض mRNAs بلا قيادة. [11]

في كلا المجالين ، تُترجم الجينات التي لا تحتوي على تسلسل Shine – Dalgarno بطريقة أقل فهمًا. يبدو أن المطلب هو عدم وجود بنية ثانوية بالقرب من كودون البدء. [12]

حقيقيات النوى تحرير

تعديل التنظيم المعقد قبل البدء

تنظيم الترجمة في حقيقيات النوى أكثر تعقيدًا منه في بدائيات النوى. في البداية ، يتم تجنيد مجمع eIF4F إلى غطاء 5 ، والذي بدوره يقوم بتجنيد مجمع الريبوسوم إلى 5 ′ UTR. يربط كل من eIF4E و eIF4G 5 UTR ، مما يحد من المعدل الذي يمكن أن يحدث عنده بدء الترجمة. ومع ذلك ، فهذه ليست الخطوة التنظيمية الوحيدة للترجمة التي تتضمن 5-UTR.

تعمل بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RNA) أحيانًا على منع تكوين معقد ما قبل البدء. مثال على ذلك هو تنظيم msl2 الجين. يرتبط البروتين SXL بجزء intron الموجود داخل مقطع 5 ′ UTR من النص الأساسي ، مما يؤدي إلى تضمين intron بعد المعالجة. [13] يسمح هذا التسلسل بتجنيد البروتينات التي ترتبط في وقت واحد بكل من 5 ′ و 3 UTR ، ولا تسمح لبروتينات الترجمة بالتجمع. ومع ذلك ، فقد لوحظ أيضًا أن SXL يمكنها أيضًا قمع ترجمة RNAs التي لا تحتوي على ذيل بولي (A) ، أو بشكل عام ، 3 ′ UTR.

تعديل تنظيم الحلقة المغلقة

منظم مهم آخر للترجمة هو التفاعل بين 3 ′ UTR و 5 UTR.

بنية الحلقة المغلقة تمنع الترجمة. وقد لوحظ هذا في Xenopus laevis، حيث يتفاعل eIF4E المرتبط بـ 5 cap مع Maskin المرتبط بـ CPEB على 3 UTR ، مما يؤدي إلى إنشاء نصوص غير نشطة متعدية. يتم رفع هذا التثبيط الترجمي بمجرد فسفرة CPEB ، مما يؤدي إلى إزاحة موقع ربط Maskin ، مما يسمح ببلمرة ذيل PolyA ، والتي يمكنها تجنيد آلية الترجمة عن طريق PABP. [14] ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه الآلية خضعت لتدقيق شديد. [15]

تعديل تنظيم الفيريتين

يتم الحفاظ على مستويات الحديد في الخلايا من خلال تنظيم الترجمة للعديد من البروتينات المشاركة في تخزين الحديد والتمثيل الغذائي. يمتلك UTR 5 القدرة على تكوين بنية ثانوية لعروة دبوس الشعر (تُعرف باسم عنصر استجابة الحديد أو IRE) التي يتم التعرف عليها بواسطة البروتينات المنظمة للحديد (IRP1 و IRP2). في المستويات المنخفضة من الحديد ، يتم حظر ORF الخاص بالمرنا المستهدف نتيجة للعائق الفاصل من ارتباط IRP1 و IRP2 بـ IRE. عندما يكون الحديد مرتفعًا ، لا يرتبط البروتينان المنظمان للحديد بنفس القوة ويسمحان بالتعبير عن البروتينات التي لها دور في التحكم في تركيز الحديد. اكتسبت هذه الوظيفة بعض الاهتمام بعد أن تم الكشف عن أن ترجمة بروتين طليعة الأميلويد قد تتعطل بسبب تعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات إلى IRE الموجود في 5 ′ UTR من mRNA ، مما يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بمرض الزهايمر بشكل تلقائي. [16]

UORFs وإعادة التهيئة التحرير

شكل آخر من أشكال التنظيم الترجمي في حقيقيات النوى يأتي من عناصر فريدة على 5-UTR تسمى إطارات القراءة المفتوحة المنبع (uORF). هذه العناصر شائعة إلى حد ما ، وتحدث في 35-49٪ من جميع الجينات البشرية. [17] uORF هو تسلسل تشفير يقع في 5-UTR الموجود في أعلى موقع بدء تسلسل التشفير. تحتوي هذه uORFs على كود البدء الخاص بها ، والمعروف باسم AUG المنبع (uAUG). يمكن فحص هذا الكودون بواسطة الريبوسومات ثم ترجمته لإنشاء منتج ، [18] والذي يمكن أن ينظم ترجمة تسلسل تشفير البروتين الرئيسي أو uORFs الأخرى التي قد تكون موجودة في نفس النسخة.

تُعرف ترجمة البروتين داخل ORF الرئيسي بعد ترجمة تسلسل uORF باسم إعادة التهيئة. [19] من المعروف أن عملية إعادة التهيئة تقلل من ترجمة بروتين ORF. يتم تحديد التحكم في تنظيم البروتين من خلال المسافة بين uORF والكودون الأول في ORF الرئيسي. [19] تم العثور على uORF لزيادة إعادة التشغيل مع المسافة الأطول بين uAUG وكودون البداية الخاص بـ ORF الرئيسي ، مما يشير إلى أن الريبوسوم يحتاج إلى استعادة عوامل الترجمة قبل أن يتمكن من تنفيذ ترجمة البروتين الرئيسي. [19] على سبيل المثال ، ATF4 يتم إجراء التنظيم بواسطة اثنين من وحدات uORFs الأخرى ، المسماة uORF1 و uORF2 ، والتي تحتوي على ثلاثة أحماض أمينية وتسعة وخمسين من الأحماض الأمينية ، على التوالي. يتداخل موقع uORF2 مع ملف ATF4 ORF. أثناء الظروف العادية ، تتم ترجمة uORF1 ، ثم تحدث ترجمة uORF2 فقط بعد إعادة الحصول على eIF2-TC. تتطلب ترجمة uORF2 أن تمر الريبوسومات بواسطة ATF4 ORF ، الذي يقع كود البدء الخاص به داخل uORF2. هذا يؤدي إلى قمعه. ومع ذلك ، أثناء ظروف الإجهاد ، سيتجاوز الريبوسوم 40S uORF2 بسبب انخفاض تركيز eIF2-TC ، مما يعني أن الريبوسوم لا يكتسب واحدًا في الوقت المناسب لترجمة uORF2. في حين أن، ATF4 مترجم. [19]

آليات أخرى تحرير

بالإضافة إلى إعادة التهيئة ، تساهم uORFs في بدء الترجمة بناءً على:

  • قد تقوم نيوكليوتيدات uORF بتشفير كودون يؤدي إلى مرنا عالي التنظيم ، مما يتسبب في توقف الريبوسوم. [19]
  • رابطة الدول المستقلة وترجمة - تنظيم ترجمة تسلسل ترميز البروتين الرئيسي. [19]
  • التفاعلات مع مواقع IRES. [19]

تحرير مواقع دخول الريبوسوم الداخلي والفيروسات

الفيروسية (وكذلك بعض حقيقيات النوى) 5 ′ UTRs تحتوي على مواقع دخول الريبوسوم الداخلية ، وهي طريقة مستقلة عن الغطاء للتنشيط الترجمي. بدلاً من بناء مجمع عند الغطاء 5 ، يسمح IRES بالربط المباشر للمجمعات الريبوزومية بالنسخة لبدء الترجمة. [20] يمكّن IRES النسخة الفيروسية من الترجمة بكفاءة أكبر بسبب عدم الحاجة إلى مجمع ما قبل التكاثر ، مما يسمح للفيروس بالتكاثر بسرعة. [5]

ام اس ال -2 تحرير النص

نسخ ملف ام اس ال -2 يتم تنظيم النص من خلال مواقع ربط متعددة للطيران Sxl في 5 ′ UTR. [1] على وجه الخصوص ، تقع مواقع البولي يوراسيل هذه بالقرب من إنترون صغير يتم تقطيعه في الذكور ، ولكن يتم الاحتفاظ به في الإناث من خلال تثبيط التضفير. يتم الحفاظ على تثبيط الربط بواسطة Sxl. [1] عند التواجد ، Sxl سيقمع ترجمة msl2 عن طريق زيادة ترجمة كودون البدء الموجود في uORF في 5-UTR (انظر أعلاه لمزيد من المعلومات حول uORFs). أيضا، Sxl يتفوق على TIA-1 في منطقة poly (U) ويمنع تجنيد snRNP (خطوة في الربط البديل) إلى موقع لصق 5. [1]


نتائج

مجموعات البيانات

لحساب الاحتمالات المسببة للأمراض لـ iSNVs ، قمنا ببناء مجموعة تدريب من خلال الجمع بين iSNVs المسببة للأمراض المنسقة يدويًا في HGMD و iSNVs المحايدة المفترض من 1000 Genomes Project المرحلة 3 (الشكل 1 والملف الإضافي 1: الشكل S1). تم اشتقاق iSNVs المحايدة الموثقة في مجموعة بيانات 1000 جينوم من بيانات تسلسل الجينوم من 2500 فرد يفتقرون إلى أنماط ظاهرية إكلينيكية واضحة [1]. لتقليل السلبيات الخاطئة في مجموعة التدريب الخاصة بنا ، قمنا فقط بتضمين iSNVs مع تردد أليل ثانوي (MAF) أكبر من 10٪. نتج عن هذا الاختيار 2438 مسببًا للأمراض و 2،104،613 من حالات iSNVs المحايدة.

سير العمل. أ مصادر البيانات لبناء النموذج. تم جمع iSNVs الممرضة والمحايدة من HGMD و 1000 Genomes Project ، على التوالي. ب تم النظر في ثلاث فئات من الميزات ، وهي ربط RNA ، وهيكل البروتين ، والحفظ التطوري ، لـ iSNVs. يتم سرد مصادر البيانات وأرقام هذه الميزات على الجانب. للحصول على تفاصيل إضافية لمصادر البيانات ، راجع قسم "الأساليب". ج التدفق المنطقي لتطوير نموذج التنبؤ ، بالإضافة إلى تقييم النموذج والتحقق من صحة النتائج

نظرًا لأن قرب iSNV من موقع الوصلة الوصلة يمكن أن يؤثر على نتيجة الربط عبر آليات جزيئية مختلفة ، قمنا أيضًا بتقسيم iSNVs المحددة إلى تلك القريبة والبعيدة من مواقع الوصلات. على سبيل المثال ، قد تتداخل المتغيرات القريبة من مواقع الوصلة الوصلة (on-ss) بشكل مباشر مع تكوين spliceosome ، بينما قد تؤثر iSNVs البعيدة عن مواقع الوصلات (off-ss) على ارتباط بروتينات ربط RNA التنظيمية (RBPs). تم تعريف مواقع الوصلة الوصلة على أنها 13 نقطة أساس في المنبع لمواقع متقبل 3′ و 7 نقاط أساس في المصب لمواقع مانحة 5′ [42]. في المجموع ، كان هناك 1865 on-ss و 573 iSNVs المسببة للأمراض و 3386 on-ss و 2،104،613 iSNVs المحايدة. كشفت هذه البيانات أنه تم العثور على المتغيرات المسببة للأمراض بشكل متكرر في المناطق القريبة من مواقع الوصلات الوصلة مقارنة بالمتغيرات المحايدة (ملف إضافي 1: الشكل S2). لتجنب التحيز المحتمل الناتج عن المسافات المتغيرة لـ iSNVs من مواقع الوصلات ، اخترنا عشوائيًا 852 iSNVs محايدة من مجموعة بيانات 1000 Genomes عن طريق مطابقة توزيع المسافة لمتغيرات HGMD المسببة للأمراض. كفل ذلك مجموعات بيانات أكثر توازناً مع توزيعات مسافات مماثلة بين المتغيرات المسببة للأمراض والمتغيرات المحايدة.

لكل مجموعة من مجموعات البيانات المسببة للأمراض والحيادية والخروج منها ، اخترنا عشوائيًا ثلثي البيانات لاستخدامها كمجموعة تدريب لبناء مصنف غابة عشوائي (ملف إضافي 1: الشكل S1). تم استخدام الثلث المتبقي من البيانات كمجموعة اختبار. لمزيد من الاختبار لأداء النموذج ، قمنا أيضًا باستخراج iSNVs المسببة للأمراض والمحايدة من قاعدة بيانات ClinVar كمجموعة اختبار مستقلة [41] ، والتي تضمنت 121 ons و 51 off-ss المسببة للأمراض و 167 ons و 883 offs. iSNVs المحايدة (راجع قسم "الطرق" للحصول على التفاصيل).

من أجل تحديد الميزات التي تميز iSNVs المسببة للأمراض والمحايدة على النحو الأمثل ، قمنا بتصنيف جميع الميزات إلى ثلاث فئات: (1) ميزات الربط ، وتمييز كيفية تأثير iSNVs الفردية على تنظيم الربط (2) الميزات الهيكلية ، وتقييم كيفية تضمين / استبعاد iSNV الناجم عن iSNV بدلاً من ذلك ، تؤثر exons المقسمة على وظائف البروتين و (3) ميزات الحفظ التطورية ، وقياس درجات الحفظ الأساسي للنيوكليوتيدات لـ 99 جينومًا للفقاريات (الشكل 1).في هذه الفئات الثلاث ، أظهرت 360 ميزة من 438 ميزة قوة كبيرة في فصل العوامل الممرضة والمحايدة على iSNVs ، في حين فصلت 194 ميزة من 436 ميزة iSNVs الخارجة على أساس اختبار تصنيف ويلكوكسون مع تعديل معدل. ص القيمة & lt 0.05 (الشكل 2 وملف إضافي 2: الجدول S1).

تقييم الميزات. أهمية الاختلاف في درجات الميزات بين iSNVs المسببة للأمراض والمحايدة. أ on-ss iSNVs. ب خارج ss iSNVs. كانت السمات من ثلاث فئات - التضفير (الرمادي) ، وتركيب البروتين (الأحمر) ، والحفظ التطوري (الأزرق). راجع أيضًا الملف الإضافي 2: الجدول S1 لمزيد من التفاصيل. في الحبكة ، تمثل كل نقطة ميزة. ال x-المحور هو (القيمة المطلقة) لمتوسط ​​دلتا الميزة ، محسوبًا على أنه "متوسط ​​نقاط iSNVs المسببة للأمراض" ناقص "متوسط ​​درجة iSNVs المحايدة" للميزة المعينة. تم وصف حسابات درجات الميزات في قسم "الطرق". ال ذ-المحور هو قيمة أهمية فرق الدرجة بناءً على اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون (ص القيم التي تم ضبطها بواسطة FDR وتحويلها بواسطة - log10 ، متوجًا عند 10 10 للعرض). نظرًا للنطاقات الديناميكية الكبيرة لقيم الميزات ، تم إعادة قياس متوسطات دلتا إلى النطاق [- 1 ، 1]: x’ = 2 × (x - دقيقة (x))/(الأعلى(x) - دقيقة (x)) − 1

تؤثر iSNVs المسببة للأمراض على الربط البديل

لتقييم تأثير iSNV على تنظيم الربط ، أخذنا في الاعتبار مقياسين: (1) درجات الوصلة-الوصلة المرتبطة بالإكسونات القريبة في كلا الاتجاهين 5 ′ و 3 ، بالإضافة إلى انحراف درجة الوصلة للمتغير من الأليل المرجعي ، و (2) الفرق الناجم عن iSNV في تقارب ربط RBP. تم حساب درجة وصلة الربط عن طريق مصفوفات الموضع الموزونة (PWMs) التي تقيس ميزات التسلسل حول مواقع الوصلات المتعارف عليها (انظر قسم "الطرق" للحصول على التفاصيل) [42]. من المرجح أن تتضمن الدرجات الأعلى الإكسونات المقابلة في الرنا المرسال الناتج. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن iSNVs المسببة للأمراض كانت مرتبطة بشكل متكرر بدرجة أقل بدرجات تقاطع لصق. كانت درجة التقاطع المتوسطة لـ iSNVs المسببة للأمراض على ss 7.37 و 7.11 للمواقع المانحة والمقبلة ، على التوالي ، مقارنة بـ 7.95 و 7.84 لـ iSNVs المحايدة (المعدلة ص القيمة 0.017 و 1.35 × 10 7 على التوالي) (ملف إضافي 2: الجدول S1). بالنسبة إلى iSNVs المسببة للأمراض ، كان متوسط ​​درجات الوصلات 7.63 و 7.95 لمواقع المتبرعين والمقبولين ، مقارنة بـ 8.13 و 8.54 بالنسبة لـ iSNVs المحايد (المعدل). ص القيمة 0.018 و 9.0 × 10 −4 على التوالي) (ملف إضافي 2: الجدول S1). بالإضافة إلى درجات التقاطع ، تم حساب انحراف درجة الوصلة الناتجة عن كل iSNV. كانت قيم الانحراف الوسيط لـ iSNVs الممرضة - 2.96 و - 2.23 للمواقع المانحة والمقبلة ، على التوالي. كان حجم هذه الانحرافات أكبر بكثير من تلك الخاصة بـ iSNVs المحايدة ، والتي كانت 0.034 و 0.059 للمواقع المانحة والمقبلة ، على التوالي (ملف إضافي 1: الشكل S3). اختبار رتبة ويلكوكسون المعدل ص كانت قيم مواقع الجهات المانحة والمستقبلية 1.63 × 10 −211 و 1.28 × 10 −143 ، على التوالي (ملف إضافي 2: الجدول S1 وملف إضافي 1: الشكل S3). تشير هذه النتائج إلى أن iSNVs المسببة للأمراض ترتبط ارتباطًا وثيقًا بتخطي exon.

لتقييم تأثير iSNV على ربط RBP ، قمنا بحساب كل من حجم واحتمالية تغييرات درجة الربط الناتجة عن iSNVs لـ 201 RBPs مع PWMs المعروفة. وجدنا أن iSNVs المسببة للأمراض والمحايدة أظهرت اختلافات كبيرة في ارتباط العديد من RBPs. بشكل عام ، تسبب العامل الممرض في iSNVs والمسبب للأمراض في حدوث تغييرات كبيرة في درجة الربط في 191 و 176 RBPs ، على التوالي ، مقارنةً بـ iSNVs المحايد المعني. على وجه التحديد ، أظهر 137 RBPs اختلافات كبيرة في درجات الربط التي يسببها iSNV بين المتغيرات المسببة للأمراض والمتحايدة ، في حين أظهر 43 RBPs فروقًا ذات دلالة إحصائية بين المتغيرات المسببة للأمراض والحيادية (اختبار تصنيف Wilcoxon المعدل) ص القيمة & lt 0.05 ملف إضافي 2: الجدول S1 وملف إضافي 1: الشكل S4). مجتمعة ، توفر هذه النتائج دليلًا قويًا على أن iSNVs المسببة للأمراض تؤثر على تنظيم الربط وتؤدي إلى تغيير هياكل mRNA.

ترتبط iSNVs المسببة للأمراض بإكسونات ترميز مجالات بروتين مهمة وظيفيًا

لتقييم تأثير iSNVs على وظيفة البروتين ، قمنا بفحص السمات الهيكلية المقابلة لإكسونات التقسيم البديلة المحتملة. افترضنا أن iSNVs المسببة للأمراض تعطل تضفير exons الذي يشفر المجالات الهيكلية للبروتين الرئيسية. لقد التقطنا الميزات الهيكلية للبروتين لأقرب exons المجاورة لـ iSNVs بما في ذلك درجة الاضطراب الجوهري ، والبنية الثانوية (على سبيل المثال ، حلزون ألفا ، أو ورقة بيتا ، أو ملف عشوائي) ، ومساحات سطح يمكن الوصول إليها بواسطة المذيبات (ASA) (ملف إضافي 2: الجدول S1 ) [43 ، 44]. حسبنا أيضًا النسبة المئوية للتداخل من exon المستهدف مع مجالات البروتين المعروفة ، بالإضافة إلى عدد مواقع التعديل المعروفة بعد الترجمة داخل مجال البروتين المشفر exon (ملف إضافي 2: الجدول S1) [45 ، 46].

وجدنا أن exons القريبة من iSNVs المسببة للأمراض كانت أكثر عرضة لتشفير نطاقات البروتين التي تحتوي على درجات اضطراب متوسطة أقل وتحتوي على مناطق منظمة أطول ، مقارنةً بـ exons القريبة إلى iSNVs المحايدة (اختبار تصنيف Wilcoxon المعدل. ص القيمة 2.03 × 10 −11 و 0.0497 لـ iSNVs on-ss و off-ss ، على التوالي) (ملف إضافي 2: الجدول S1 وملف إضافي 1: الشكل S5). تشير هذه النتيجة إلى أن iSNVs المسببة للأمراض لديها احتمالية أعلى لكونها قريبة من exons لتشفير المناطق المهيكلة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن exons القريبة من iSNVs المسببة للأمراض كان لها متوسط ​​درجات ASA أصغر بكثير (معدلة ص القيمة 2.90 × 10 −13 و 0.0103 لـ iSNVs on-ss و off-ss ، على التوالي) ، مما يشير إلى أنهم أكثر عرضة لتشفير المناطق في قلب البروتين بدلاً من المناطق الموجودة على سطح البروتين. علاوة على ذلك ، فإن أقرب exons لـ iSNVs المسببة للأمراض ترميز نسبة مئوية أعلى بكثير من المخلفات التي تتداخل مع مجالات البروتين المعروفة (المعدلة ص القيمة 1.91 × 10 −16 و 1.98 × 10 −5 لـ iSNVs on-ss و off-ss ، على التوالي). مجتمعة ، تُظهر هذه النتائج أن exons القريبة من iSNVs المسببة للأمراض من المرجح أن تقوم بترميز مناطق البروتين المهمة وظيفيًا. من ناحية أخرى ، يشير تحليلنا أيضًا إلى أن الميزات الهيكلية للبروتين توفر معلومات قيمة لتحديد أولويات iSNVs المسببة للأمراض.

يتم توطين iSNVs المسببة للأمراض في المناطق المحمية

أظهرت الدراسات السابقة أن الحفظ التطوري هو سمة مهمة في تقييم القدرة المسببة للأمراض في SNVs [47 ، 48]. لتحديد ما إذا كان iSNV محفوظًا من الناحية التطورية ، قمنا بحساب درجة الحفظ 100 طريقة PhyloP لموضع iSNV ، ومتوسط ​​درجة الحفظ لمنطقة محاطة بأي جانب من جوانب iSNV المرشح بطول 3 نقاط أساس بالإضافة إلى 7 نقاط أساس. أظهرت نتائجنا أن iSNVs المسببة للأمراض لديها درجات حفظ PhyloP أعلى بكثير من iSNVs المحايدة (ملف إضافي 1: الشكل S6). كانت درجة الحفظ المتوسطة لمواضع iSNV المسببة للأمراض على ss 3.08 ، والتي كانت أعلى بكثير من النتيجة - 0.03 لـ iSNVs المحايدة على ss (اختبار تصنيف Wilcoxon المعدل. ص القيمة & لتر 1 × 10 −300). وبالمثل ، كانت الدرجة المتوسطة لمواضع iSNV المسببة للأمراض خارج النظام 0.31 ، مقارنة بـ -0.28 لـ iSNVs المحايدة (المعدلة). ص القيمة 3.21 × 10 −38). تشير درجات PhyloP الإيجابية الكبيرة لمواقع iSNV المسببة للأمراض إلى أنها تطورت ببطء أكبر بكثير من المواقع المحايدة. كانت درجات الحفظ للمناطق المرافقة 3-bp و 7-bp متوافقة مع درجات مواقع iSNV. بالنسبة للمناطق المرافقة ذات 3 نقاط أساس حول iSNVs المسببة للأمراض داخل وخارج النظام ، كانت متوسطات درجات الحفظ الخاصة بها 2.86 و 0.23 ، مقارنة بـ 0.58 و 0.07 لـ iSNVs المحايدة (المعدلة ص القيم 1 × 10 −300 و 5.47 × 10 23 على التوالي). تم العثور على نتائج مماثلة أيضًا للمناطق المرافقة ذات 7 نقاط أساس. تشير هذه النتائج إلى أن iSNVs في مواقع أكثر حفظًا من المرجح أن تكون مسببة للأمراض.

بناء نموذج RegSNPs-intron والأداء والتقييم

استنادًا إلى التضفير وبنية البروتين وميزات الحفظ التطورية الموصوفة أعلاه (ملف إضافي 2: الجدول S1) ، تم إنشاء مصنفات الغابات العشوائية لـ iSNVs ons و offss ، على التوالي. تم بناء النماذج على مجموعة التدريب (ثلثا مجموعة البيانات الأصلية) ، وتم تقييم قدراتها التنبؤية على مجموعة التحقق من الصحة (ثلث مجموعة البيانات الأصلية). تم تحسين المعلمات التشعبية ، مثل عدد الأشجار والحد الأقصى للعمق ، عبر بحث الشبكة مع التحقق من صحة ثلاثة أضعاف في مجموعة التدريب. بالنسبة لـ iSNVs ، احتوى نموذج الغابة العشوائية على 52 شجرة بعمق أقصى 13 شجرة. تشكل نماذج on-ss و off-ss الناتجة RegSNPs-intron.

استنادًا إلى مجموعة التحقق من الصحة (ثلث مجموعة البيانات الأصلية ، غير المستخدمة في تدريب النموذج) ، وصلت RegSNPs-intron إلى AUROC (منطقة تحت منحنى خاصية تشغيل المستقبل) 0.96 ومعامل ارتباط Matthews (MCC) من 0.79 لـ- ss iSNVs وتفوقت على كل من SPANR و CADD (AUROCs 0.77 و 0.81 ، على التوالي ، الشكل 3 أ). بالنسبة لـ iSNVs ، كان RegSNPs-intron AUROC 0.84 (MCC 0.52) ، مقارنة بـ SPANR و CADD AUROCs من 0.54 و 0.69 ، على التوالي (الشكل ثلاثي الأبعاد). هنا ، قمنا أيضًا بحساب AUPR (المنطقة الواقعة تحت منحنى الاسترجاع الدقيق) حيث قد تكون أعداد iSNVs المسببة للأمراض والمحايدة غير متوازنة. بالنسبة لـ on-ss iSNVs ، كان لدى RegSNPs-intron معدل AUPR قدره 0.94 ، مقارنة بـ 0.70 و 0.71 لـ SPANR و CADD ، على التوالي (ملف إضافي 1: الشكل S7A). كان AUPR المقدم من RegSNPs-intron لـ iSNVs خارج ss 0.77 ، مقارنة بـ SPANR و CADD AUPRs من 0.47 و 0.62 ، على التوالي (ملف إضافي 1: الشكل S7C). تشير نتائجنا إلى أن تضمين الميزات الهيكلية للبروتين المشفرة بواسطة exons القريبة ، والتي لا يتم استخدامها من قبل SPANR أو CADD ، يزيد بشكل كبير من أداء RegSNPs-intron في التنبؤ بالإمراضية المتغيرة.

نموذج الأداء والتقييم والتحليل. أج On-ss iSNVs. أ منحنيات خصائص تشغيل جهاز الاستقبال (ROC) لـ RegSNPs-intron (أخضر خالص) و SPANR (أزرق منقط) و CADD (برتقالي متقطع) في مجموعة التحقق من الصحة. ب انتقالات احتمالية محددة بناءً على المعدل الإيجابي الكاذب (الثابت) والمعدل الإيجابي الحقيقي (المتقطع). يشير الخطان المنقطان إلى FPR = 0.05 و 0.1 على التوالي. iSNVs مع FPR & lt 0.05 هي إتلاف، أولئك الذين لديهم 0.05 ≤ FPR & lt 0.1 هم ضرر محتمل، و iSNVs مع FPR 0.1 هي حميدة. ج ROC لـ RegSNPs-intron (أخضر صلب) و SPANR (أزرق منقط) في مجموعة اختبار ClinVar المستقلة. تم استبعاد CADD منذ أن تم استخدام ClinVar في تدريب النموذج الخاص بها. دF Off-ss iSNVs ، مثل أج

لمزيد من تقييم القوى التنبؤية للميزات المتعلقة بالربط والبنية والحفظ ، قمنا ببناء نماذج منفصلة بناءً على ميزات من كل فئة من هذه الفئات الثلاث. بالنسبة لـ iSNVs on-ss ، كانت AUROCs لميزات الربط والتركيب والحفظ 0.92 و 0.72 و 0.92 ، على التوالي بالنسبة لـ iSNVs خارج الخدمة ، كانت AUROCs 0.75 و 0.63 و 0.68 على التوالي (ملف إضافي 1: الشكل S8) . توضح هذه النتائج أن كل فئة من الميزات توفر معلومات مهمة في التنبؤ بالنموذج ، وبالتالي ، فإن الجمع بين الفئات الثلاث ينتج أعلى أداء.

للتحكم في المعدل الإيجابي الكاذب (FPR) لنتائج التنبؤ ، أبلغنا عن iSNVs باستخدام FPR & lt 0.05 كـ إتلاف، iSNVs مع 0.05 ≤ FPR & lt 0.1 as ضرر محتمل، و iSNVs مع FPR ≥ 0.1 مثل حميدة. ذكرت إتلاف كانت للفئة معدلات إيجابية حقيقية (TPR) تبلغ 0.85 و 0.45 لـ iSNVs on-ss و off-ss ، على التوالي ، في حين أن TPRs لـ ضرر محتمل كانت الفئة 0.90 و 0.52 لـ iSNVs on-ss و off-ss (الشكل 3 ب ، هـ).

تقييم أداء النموذج باستخدام مجموعة اختبار مستقلة

قمنا كذلك بتقييم أداء RegSNPs-intron مع مجموعة بيانات مستقلة من ClinVar (الموصوف أعلاه). تم استبعاد جميع ClinVar iSNVs التي لوحظت أيضًا في HGMD أو 1000 مجموعة بيانات جينوم من مجموعة التدريب لتجنب الإفراط في التجهيز. تمشيا مع النتائج الموضحة أعلاه ، أظهر نموذج RegSNPs-intron أداءً أفضل مقارنةً بـ SPANR. كانت RegSNPs-intron AUROCs 0.96 و 0.95 لـ iSNVs on-ss و off-ss ، على التوالي ، في حين كانت SPANR AUROCs 0.89 و 0.72 لـ iSNVs on-ss و off-ss ، على التوالي (الشكل 3 ج ، و). وبالمثل ، أظهر RegSNPs-intron ارتفاعًا في AUPRs. كانت AUPRs RegSNPs-intron 0.92 و 0.66 لـ iSNVs on-ss و off-ss ، بينما كانت SPANR AUPRs 0.87 و 0.06 ، على التوالي (ملف إضافي 1: الشكل S7B و D). لم نقم بتضمين CADD في المقارنة هنا نظرًا لاستخدام بيانات ClinVar في نموذج التدريب الأصلي [17]. تشير هذه النتائج إلى أن RegSNPs-intron يُظهر أداءً مستقرًا ودقة تنبؤ أعلى مقارنةً بـ SPANR عبر مجموعات بيانات مختلفة.

تواتر الأليل كان مرتبطا عكسيا مع احتمالية تسبب المرض

بشكل عام ، يجب أن يعكس تواتر الأليل في المجتمع أهمية الوظيفة البيولوجية للمتغير [49،50،51،52،53]. لذلك ، قمنا بفحص العلاقة بين تواتر الأليل والاحتمالية المتوقعة المسببة للأمراض لـ iSNVs التي تم الحصول عليها من Exome Aggregation Consortium (ExAC) و Genotype-Tissue Expression Project (GTEx) ، على التوالي. ركزنا على المقياسين المنخفض (0.0-0.25) والمتوسط ​​(0.0-0.50) لتردد الأليل ، حيث تم تقسيم iSNVs إلى 20 حاوية. لكل حاوية ، تم حساب متوسط ​​احتمالية تسبب المرض لجميع iSNVs. لوحظ وجود ارتباطات سلبية بين تواتر الأليل والاحتمال المسببة للمرض سواء على نطاق منخفض أو متوسط ​​لكل من iSNVs on-ss و off-ss. على وجه التحديد ، بالنسبة للمقياس المنخفض ، تكون الارتباطات كما يلي: ExAC ص = - 0.832 و GTEx ص = - 0.849 لـ on-ss iSNVs و ExAC ص = - 0.686 و GTEx ص = - 0.313 لـ iSNVs off-ss (الشكل 4 أ ، ج). بالنسبة للمقياس المتوسط ​​، تكون الارتباطات كما يلي: ExAC ص = - 0.650 و GTEx ص = - 0.603 لـ on-ss iSNVs و ExAC ص = - 0.834 و GTEx ص = - 0.844 لـ off-ss iSNVs (الشكل 4 ب ، د). تتوافق هذه النتيجة مع النتائج التي توصل إليها الآخرون والتي تفيد بأن احتمالية حدوث المتغيرات ذات الاحتمالية العالية للتسبب في المرض أقل احتمالًا في عموم السكان [34]. يتم توفير توزيعات ترددات الأليل الصغيرة (MAF) ، في كل من المقياسين المنخفض والمتوسط ​​، لجميع iSNVs من ExAC و GTEx في الملف الإضافي 1: الشكل S9.

ارتباطات الاحتمالية المسببة للمرض مع تواتر الأليل أو عدد iSNVs القريبة من أجل exon. أ, ب On-ss iSNVs. الارتباط بين الاحتمالية المسببة للمرض وتواتر الأليل. تم تقسيم عشرين سلة بناءً على ترددات أليل iSNVs التي تم جمعها من ExAC و GTEx. ال x- و ذ- المحاور هي متوسط ​​تواتر الأليل والاحتمال المتوقع للتسبب في المرض لكل صندوق. أ تم قياس تردد الأليل من 0.00 إلى 0.25. ب تم قياس تردد الأليل من 0.00 إلى 0.50. ج, د Off-ss iSNVs ، مثل أ, ب. ه العلاقة بين الاحتمالية المسببة للمرض وعدد iSNVs المجاورة. ال x-المحور هو عدد iSNVs المجاورة (في حدود 300 نقطة أساس من التقاطع). كل قيمة على ذ-المحور هو متوسط ​​الاحتمالية (المتوقعة) المسببة للأمراض لجميع exons التي تحتوي على عدد iSNVs المجاورة المشار إليها بالقيمة المقابلة على x-محور

تحدث iSNVs المسببة للأمراض بالقرب من exons المرتبطة باحتمالية عالية للتسبب في المرض

قمنا كذلك بتقييم تنبؤات RegSNPs-intron من خلال التحقيق في الأهمية الوظيفية للإكسونات القريبة من iSNVs. افترضنا أن exons المهمة وظيفيًا لا تتسامح مع iSNVs القريبة. لاختبار هذه الفرضية ، استخرجنا 75119 exons كان لها على الأقل 1 iSNV ضمن حدود ± 300 نقطة أساس من حدود exon-intron استنادًا إلى بيانات ExAC. تم اختيار iSNV واحد بشكل عشوائي لكل exon ، وتم التنبؤ باحتمالية تسبب المرض باستخدام RegSNPs-intron. تم حساب متوسط ​​قيم الاحتمالية لجميع exons التي لها نفس عدد iSNVs المجاورة (ضمن ± 300 نقطة أساس من التقاطع). لوحظ وجود ارتباط سلبي كبير بين متوسط ​​الاحتمالية المسببة للمرض وعدد iSNVs المجاورة للخارج (ص = − 0.92, ص القيمة = 6.26 × 10 −11) (الشكل 4 هـ). تم إجراء نفس التحليل أيضًا على 160،230 exons استنادًا إلى بيانات تسلسل الجينوم الكامل لـ GTEx. لوحظ ارتباط سلبي مماثل (ص = − 0.78, ص القيمة = 0.07). تشير هذه النتيجة إلى أن الـ iSNVs المسببة للأمراض تميل إلى الحدوث بالقرب من exons المهمة وظيفيًا.

تحديد أولويات المتغيرات intronic الوظيفية المرتبطة بالسمية الخلوية التي يسببها الدواء

طبقنا RegSNPs-intron لتحديد أولويات المتغيرات intronic المرتبطة بالحساسية الخلوية للسمية الخلوية التي يسببها clofarabine. لقد أجرينا سابقًا دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) للنمط الظاهري لاستجابة الكلوفارابين (AUC لمنحنيات السمية الخلوية التي يسببها الدواء) باستخدام 90 خطًا من الخلايا اللمفاوية اللمفاوية HapMap الدولية (LCLs) من مجموعة CEU [54]. SNVs مرتبطة بشكل معتدل بالسمية الخلوية clofarabine (ص القيمة ≤ 0.05) كعلامات أولية. تم استخدام جميع 15،634 iSNVs التي كانت في حالة اختلال توازن (LD) مع علامات البذور وكانت موجودة في حدود ± 300 نقطة أساس من تقاطع لصق في التنبؤات. من بين هذه المتغيرات المرشحة ، تم توقع 622 و 84 iSNVs إتلاف (FPR ≤ 0.05) و ضرر محتمل (0.05 & lt FPR ≤ 0.1) ، على التوالي (706 في المجموع) ، و 14،928 iSNVs كان من المتوقع أن يكون حميدة (FPR & GT 0.1).

التحقق التجريبي باستخدام مقايسة ASSET-seq

للتحقق من صحة تأثيرات iSNV ذات الأولوية تجريبياً على نتيجة الربط ، قمنا بتصميم اختبار مراسل وظيفي عالي الإنتاجية يسمى ASSET-seq يستلزم إدخال قلة تحتوي على iSNV في بلازميد Exontrap معدل (الشكل 5 أ) [55]. تم قياس التأثير على نتيجة الربط الخاصة بـ iSNV المختبَر على أنه الفرق بين النسب المعنية لقراءات التسلسل التي تدعم النسخ المقسمة والشاذة (بما في ذلك غير المقسمة) للأليلات المرجعية والبديلة. تم تحليل الفرق في نسب نوعي نتائج التضفير بين الأليلات المرجعية والبديلة من خلال نموذج الأثر المختلط (انظر قسم "الطرق").

التحقق التجريبي من ASSET-seq. أ تصميم بلازميد لفحص الربط. يشتمل إدراج oligo على 11 نقطة أساس من exon القريب بالإضافة إلى أول 60 نقطة أساس من الإنترون الذي يحتوي على iSNV من الجينات الفردية (كما هو موضح باللون البرتقالي) ، بالإضافة إلى exon البلازميد العام (22 نقطة أساس ، مربع أحمر) وإنترون (خط أسود 19 نقطة أساس) ) مقاطع تجانس لإدخال سلس في المتجه. يتم نسخ الحمض النووي الريبي في الخلايا المنقولة من 5′-UTR إلى إشارة poly-A. تُستخدم بادئات PCR (الأسهم الحمراء) لتضخيم نسخة RNA.ينتج الفحص نصوصًا مقسمة أو غير مقسمة (بالإضافة إلى الأشكال الإسوية الشاذة الأخرى). المروج ، LTR RSV SD ، موقع مانح لصق SA ، موقع متقبل لصق. ب ملخص النتائج التجريبية في ثلاثة خطوط خلوية. المرجع ، مرجع أليل بديل ، أليل بديل. يشير اللون الأزرق إلى iSNV الذي يؤدي إلى انخفاض كبير في المنتجات المقسمة (FDR 0.1) يشير اللون الأزرق الفاتح إلى انخفاض في المنتجات المقسمة غير المهمة (FDR & gt 0.1). يشير اللون الأحمر إلى زيادة كبيرة في المنتجات المقسمة بينما يشير اللون الأحمر الفاتح إلى زيادة طفيفة. المربعات الفارغة عبارة عن فحوصات فاشلة كانت iSNVs غير قابلة للتقييم وغير قابلة للتقييم في جميع خطوط الخلايا الثلاثة (20 في المجموع) تم حذفها. معدل التحقق (لكل خط خلية) هو النسبة المئوية للمقايسات التي تظهر نتيجة مهمة في جميع الاختبارات القابلة للتقييم. ج مثال على التغيير الناجم عن iSNV لنتيجة الربط. إن iSNV (RS6538694) قمع تشكيل منتج المراسل المقسم ، كما هو موضح باستمرار في جميع خطوط الخلايا الثلاثة (ص القيم ≤ 4.6 × 10 −5). ال ذ- المحور هو نسبة log2 للقراءات المقسمة تمامًا (P) إلى القراءة الشاذة (NP ، غير الكاملة وغير المقسمة). ص تم تعديل القيم بواسطة FDR مقابل جميع iSNVs المختبرة. د اتساق النتائج في خطوط خلايا متعددة. ال x-المحور هو نسبة الأرجحية log2 للمنتجات المقسمة والشاذة (فيما يتعلق بالأليلات المرجعية والبديلة) لـ HeLa ، و ذ- و ض- المحاور هي نسب الأرجحية log2 لـ HepG2 و HEK293 ، على التوالي. تمت مقارنة خطوط الخلايا بشكل مزدوج مع iSNVs القابلة للتقييم في كلا خطي الخلية. ارتباطات بيرسون: هيلا مقابل HEK293 = 0.857 (النقاط الزرقاء ، ص القيمة = 1.02 × 10 −22) ، هيلا مقابل HepG2 = 0.959 (النقاط الحمراء ، ص القيمة = 6.66 × 10 −40) ، و HEK293 مقابل HepG2 = 0.894 (النقاط الخضراء ، ص القيمة = 6.65 × 10 −29). تشير الخطوط الصلبة باللون الأزرق الداكن والأحمر والأخضر إلى الارتباطات ذات الصلة

استخدمنا ASSET-seq لاختبار تأثيرات 82 iSNVs على نتائج الربط في 3 خطوط مختلفة من الخلايا البشرية: HeLa و HEK293 و HepG2. تُستخدم خطوط الخلايا هذه ، التي تنشأ من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة ، بشكل شائع في الدراسات البحثية وتُستخدم لإثبات التباين في نشاط التضفير بين الأنسجة المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تمثل أيضًا نموذجًا للتكاثر الفني للمقايسة ، فضلاً عن تمكين الدراسات المستقبلية التي تربط تحليل الربط بالنتائج البيولوجية الجزيئية. تم اختيار متغيرات الاختبار البالغ عددها 82 من 706 متغيرات RegSNPs-intron ذات الأولوية (FPR 0.1) على أنها موجودة في intron على الجانب 3′ من exon الاختباري وضمن 60 nt من تقاطع exon-intron ، بناءً على تصميم الفحص المتطلبات (انظر التفاصيل في قسم "الطرق"). عند إزالة 20 مقايسة فاشلة (على سبيل المثال ، الناتجة عن ترنسفكأيشن أو فشل PCR) ، كانت النسب المئوية لـ 62 iSNVs المتبقية تظهر تأثير الربط الكبير ، أي معدلات التحقق من الصحة ، لخطوط الخلايا الثلاثة هي HeLa 64.4٪ ، HEK293 96.6٪ ، و HepG2 64.7 ٪ (FDR 0.1 بالتوافق مع FPR الشكل 5 ب والملف الإضافي 3: الجدول S2). مثال واحد محدد ، روبية6538694 في هال الجين في الشكل 5 ج. عبر جميع خطوط الخلايا الثلاثة (خمسة مكررات لكل منها) ، لوحظت نسبة أعلى بكثير من منتجات الجينات المقسمة للأليل المرجعي مقارنة بالأليل البديل (ص القيم ≤ 4.6 × 10 −5). بالنسبة للأليل المرجعي ، كان متوسط ​​النسبة المئوية لقراءات التسلسل التي تدعم منتج الجين المضفر 88.4٪ ، بينما انخفضت هذه النسبة إلى 57.1٪ للأليل البديل. علاوة على ذلك ، لاحظنا درجة عالية من الاتساق لتأثيرات iSNVs الفردية على نتائج الربط عبر خطوط الخلايا المتعددة (الشكل 5 د).


بدائل الجينات وإدخالها في الأرز عن طريق استهداف intron باستخدام CRISPR-Cas9

تم استغلال نوكليازات التسلسل المحدد لإنشاء عمليات خروج جينية مستهدفة في نباتات مختلفة 1 ، ولكن استبدال جزء وحتى الحصول على إدخال الجينات في مواقع محددة في جينومات النبات لا يزال يمثل تحديًا خطيرًا. هنا ، نُبلغ عن نُهج استبدال الجينات وإدخالها بوساطة intron التي تؤدي إلى حدوث طفرات باستخدام مسار الانضمام غير المتماثل (NHEJ) باستخدام التكرارات المتناظرة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) - البروتين المرتبط بـ CRISPR 9 (Cas9) النظام. باستخدام زوج من الحمض النووي الريبي الفردي (sgRNAs) الذي يستهدف الإنترونات المجاورة وقالب الحمض النووي للمانحين بما في ذلك نفس الزوج من مواقع sgRNA ، حققنا بدائل الجينات في جين الأرز الداخلي 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) بتردد 2.0٪. حصلنا أيضًا على إدخالات جينية مستهدفة بتردد 2.2٪ باستخدام sgRNA يستهدف intron واحدًا وقالب DNA مانحًا بما في ذلك موقع sgRNA نفسه. تؤوي نباتات الأرز OsEPSPS كان الجين مع البدائل المقصودة مقاومًا للجليفوسات. علاوة على ذلك ، تم نقل بدائل الجينات الخاصة بالموقع وإدخالها بأمانة إلى الجيل التالي. يمكن استخدام هذه الأساليب المطورة حديثًا بشكل عام لاستبدال أجزاء الجينات المستهدفة وإدخال تسلسلات DNA خارجية في مواقع جينومية محددة في الأرز والنباتات الأخرى.

تم استخدام نظام CRISPR-Cas9 بدائية النواة من النوع الثاني لتوليد فواصل خيط مزدوجة مستهدفة من الحمض النووي (DSBs) 2-4 ، والتي تحفز إصلاح الحمض النووي من خلال آليتين رئيسيتين: الانضمام إلى النهاية غير المتجانسة (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل 5. NHEJ هي العملية المهيمنة حيث يتم ببساطة إعادة ضم نهايات الحمض النووي المكسور 6. ومع ذلك ، فإن هذه العملية معرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى عمليات إدخال و / أو عمليات حذف صغيرة (indels) عند الاستراحة ، وقد تم استغلالها لإنشاء ضربات قاضية للجينات المستهدفة في أنواع خلايا وكائنات متعددة بما في ذلك النباتات 7،8. إعادة التركيب المتماثل هي عملية أقل تكرارًا ولكنها عالية الدقة ، حيث يمكن إنشاء بدائل الجينات المستهدفة وإدخالها باستخدام DNA مانح متماثل 9،10. كانت هذه التغييرات ذات قيمة كبيرة لدراسات الجينوميات الوظيفية في النباتات وقد تساعد في خلق سمات ذات قيمة زراعية. ومع ذلك ، فإن إنشاء تعديلات دقيقة ، مثل الطفرات النقطية ، واستبدال الجينات ، والضربات الجينية عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، لا يزال يمثل تحديًا خطيرًا 11. تم الإبلاغ عن عدد قليل فقط من الحالات التي تم فيها تعديل جينات النبات الداخلية بدقة عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، وحتى النجاح في هذه الحالات اعتمد بشكل عام على استخدام مخططات اختيار مصممة خصيصًا 11-19. هناك حاجة ملحة لطرق بسيطة وعالمية وفعالة لاستبدال أو ضرب أجزاء من الحمض النووي لأي جينات مستهدفة. نظرًا لأن NHEJ هي عملية الإصلاح المهيمنة وقد لا تؤثر التغييرات الطفيفة في التسلسل intronic على مستوى الربط والتعبير البديل للجين المستهدف ، فقد اخترنا تعديل introns باستخدام Cas9 لتوليد نفس النتائج التي تم تحقيقها من خلال إعادة التركيب المتماثل. هنا ، نصف طرق استهداف intron باستخدام مسار NHEJ لتوليد بدائل الجينات والإدخالات التي تخلق نباتات أرز مقاومة للغليفوسات.


مناقشة

غالبًا ما يكون التعبير عن البروتين المؤتلف في خلايا الثدييات منخفضًا وغير مستقر. من المعروف أن مستوى التعبير عن الجينات المحورة من نظام تعبير للثدييات يرتبط بشكل أساسي بمتجه التعبير ، لذا فإن استخدام ناقل التعبير الأمثل هو مطلب أساسي للتعبير عالي المستوى عن الجينات المحورة في خلايا الثدييات. عادةً ما يتم التحكم في ناقل التعبير بواسطة العناصر التنظيمية 18-20 ، والتي توجد عادةً في المناطق غير المشفرة ، مثل معززات المنبع والمحفزات وعناصر البولي أدينيل والمُنهي في مناطق المصب للجينات 21-24. الإنترونات ، باعتبارها تسلسلات DNA غير مشفرة ، لها وظيفة لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى من خلال مجموعة متنوعة من الآليات ، مثل تعزيز نشاط عملية RNA polymerase II ، وتعزيز التفاعل بين بروتينات التضفير وعوامل نسخ معينة ، وربط وتسهيل أنواع متعددة من آليات معالجة الحمض النووي الريبي والتأثير على تصدير الحمض النووي الريبي النووي ، والكفاءة الانتقالية ، واضمحلال الحمض النووي الريبي 25-27. نظرًا لأن CMV لها كفاءة عالية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا وأصبحت المروج الأكثر شيوعًا لتعبير البروتين المؤتلف 28 ، يمكن تعزيز قوتها من خلال وجود intron المصب 29 ، 30.

في هذه الدراسة ، قمنا بمقارنة تأثير خمسة عناصر intron التي تم وضعها في مناطق المصب من الجينات على مستويات التعبير الجيني في خلايا CHO المنقولة ووجدنا أن SVI هو عنصر intron قوي قوي يزيد من التعبير الجيني في خلايا CHO المنقولة. استخدمنا لأول مرة جين مراسل eGFP والذي يستخدم بشكل متكرر لتقييم التأثير التنظيمي لعنصر التمثيل cis. عادة ما يتم استخدام جين eGFP لأول مرة لدراسة تأثير عنصر cis على التعبير الجيني ومن ثم تمت دراسة الجينات ذات الأهمية (GOI) ، مثل الجسم المضاد والبروتينات الأخرى. أظهرت الدراسات السابقة أن مستوى تعبير GOI كان متسقًا مع جين مراسل eGFP 31-33.

وجدنا أن عناصر intron SVI يمكن أن تنتج كفاءة تعداء أعلى. تتأثر كفاءة تعداء العدوى بحجم الناقل إلى حد ما ، ولكن بنية وتكوين الناقل كان لهما تأثير كبير على كفاءة تعداء العدوى. في هذه الدراسة ، كان حجم خمسة عناصر intron المستخدمة hCMVI و TPLI و IVSI و SVI و CHEFI كما يلي: SVI & lt IVSI & lt TPLI & lt hCMVI & lt CHEFI. ومع ذلك ، أظهر SVI أعلى كفاءة تعداء ، تليها IVSI و TPLI و hCMVI و CHEFI. كانت النتائج متسقة مع نتائج بعض العناصر الأخرى المؤثرة 34.

في عمليات transfections المستقرة ، مقارنةً بـ intron IVS ، تعمل المتجهات التي تحتوي على intron SV40 على تعزيز مستويات تعبير eGFP بحوالي 4.39 ضعفًا في خلية CHO ، وكان تأثير الإنترونات الأخرى متسقًا مع النتائج في عمليات الانتقال العابر. تم الإبلاغ عن أن العديد من عناصر intron يمكن أن تحسن التعبير الجيني في نظام الخلايا الحيوانية للثدييات ، مثل intron A من hCMV كان لها تأثير إيجابي على التعبيرات الجينية في كل من العدوى العابرة العابرة والمستقرة في خلايا الكلى القرد ، والأرومة الليفية للقلفة البشرية ، وخلايا هيلا ، و CHO -خلايا K1 و HEK 293 من 35 إلى 37. يمكن أن يعزز intron البشري الأول EF-1α مستوى التعبير الجيني في خطوط خلايا HeLa و CHO 38. وآخرون. 39. بشكل عام ، أوضحت هذه التقارير أن وضع intron في الجزء العلوي من شريط التعبير يمارس تعبيرًا جينيًا عالي المستوى. أظهرت نتائجنا أولاً أن SVI يمكن أن يحسن التعبير الجيني في خلايا CHO وأثبتت أن hCMVI و SVI الموجودين في اتجاه مجرى كاسيت التعبير يمكن أن يعززان التعبير الجيني. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، مقارنة بـ IVS intron و TPL intron و CHEF1 gene intron1 لم يؤد إلى تعزيز التحوير ، فإن وظيفة التنظيم للإنترونات المختلفة متنوعة وقد يكون السبب مرتبطًا بنوع خط الخلية والمتجه والمحفز ومكون من الإنترونات. على سبيل المثال ، تحتوي TPL introns و CHEFI على المزيد من أشكال ارتباط عامل النسخ (TFB) ولكنها لم تؤد إلى تعزيز التعبير الجيني في اتجاه مجرى كاسيت التعبير ، وقد أدت النتائج إلى اقتراح أن الإنترونات تحتوي على عدد أكبر من أشكال TFB قد تكون مناسبة لـ تحديد موضع المنبع من كاسيت التعبير. يحتوي SV40 intron على 99nt فقط وقد وجد أنه يزيد من كفاءة الربط ونقل مرنا أكثر كفاءة 40-42. في هذه الدراسة ، ينتج عن وضع SV40 intron في اتجاه مجرى كاسيت التعبير أعلى تعبير للجينات المحورة ، وقد تكون هذه النتيجة مرتبطة بوظيفة الربط المشفر ، مما يزيد من طول ذيل بولي A ، ويزيد من عمر النصف لمرنا ومعدل الترجمة.

لمزيد من التحقيق في تأثير intron القوي على التعبير عن الجين المثير للاهتمام ، قمنا بتقييم التعبير عن البروتين العلاجي EPO ، بوساطة SV40 و IVS intron تحت ظروف الثقافة المتوسطة الخالية من المصل. تمشيا مع التعبير الجيني eGFP ، كان مستوى التعبير EPO في خلايا CHO المنقولة مع ناقل يحتوي على إنترون SV40 أعلى بكثير من تلك الموجودة في الخلايا المنقولة بالناقل الذي يحتوي على إنترون IVS.

في الختام ، قمنا أولاً بالتحقيق بشكل منهجي في تأثير خمسة إنترونات على التعبير الجيني في خلايا CHO المنقولة ووجدنا أن SV40 intron يمكن أن يزيد بشكل فعال من التعبير الجيني ، والذي قد يكون عنصرًا تنظيميًا مفيدًا للغاية للتعبير عالي المستوى عن البروتينات المؤتلفة في خلايا CHO.


نقاش

أكدت تسلسل الجيل التالي (NGS) والبيانات الأخرى من العديد من الدراسات المنشورة في السنوات العديدة الماضية ملاحظتنا الأصلية للاحتفاظ بالإنترون 10 في NXF1 مرنا (براونشفايغ وآخرون. ، 2014 بوتز وآخرون. ، 2015 تشو وآخرون. ، 2015). وبالتالي فمن الثابت أن هذا NXF1 يتم التعبير عن الشكل الإسوي للـ mRNA في خطوط خلوية متعددة ، وكذلك في العديد من أنسجة الإنسان والفأر الطبيعي. ومع ذلك ، على الرغم من أن عملنا السابق أظهر أن sNxf1 ، المترجم من هذا الرنا المرسال ، يمكن اكتشافه في خطوط الخلايا السرطانية ، إلا أن التعبير عن هذا البروتين في الخلايا والأنسجة الطبيعية ظل غير مستكشَف ، وكذلك وظيفته المحتملة.

الاحتفاظ بـ intron 10 في NXF1 ينشئ mRNA كودون إنهاء سابق لأوانه (PTC) ، مما يجعله مرشحًا رئيسيًا لـ NMD (للاطلاع على مراجعة حديثة ، انظر (Kurosaki and Maquat ، 2016). وهكذا ، على الرغم من أن mRNA الذي يحتفظ بالإنترون 10 يمكن تصديره إلى السيتوبلازم بسبب من المتوقع أن تمنع آليات CTE و NMD التعبير المستقر للبروتين في السيتوبلازم. على الرغم من هذه العقيدة السائدة ، توضح البيانات المقدمة هنا بوضوح أن sNxf1 يتم التعبير عنه في خلايا وأنسجة الثدييات الطبيعية ، بما في ذلك مناطق عديدة من الدماغ. يبدو أن mRNA الذي يحتفظ بالإنترون 10 يتم التعبير عنه بشكل كبير نسبيًا في معظم الخلايا ، ويلاحظ التعبير البروتيني المستقر فقط في بعض الخلايا.هذا يشير إلى إمكانية وجود آليات غير معروفة تنظم الترجمة و / أو استقرار البروتين المعبر عنه بعد التصدير إلى السيتوبلازم .

توضح تجاربنا على أقسام من دماغ الفئران ، باستخدام أجسام مضادة محددة لتصور sNxf1 ، أن البروتين يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية القشرية الحديثة وفي الخلايا العصبية في مناطق متعددة من الحُصين. في مناطق القشرة المخية الحديثة ، يتم توطين البروتين في النواة والسيتوبلازم في الهياكل التي تبدو وكأنها حبيبات عصبية. بالإضافة إلى ذلك ، يتحد البروتين مع Stau2SS في حبيبات في الخلايا العصبية N2a في المزرعة ، مما يشير إلى دور محتمل للبروتين في تهريب الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي في الدماغ بعد التصدير النووي.

يحتفظ بروتين sNxf1 بمجال ربط Nxf1 RNA ، لذلك من المتوقع أن يكون قادرًا على الارتباط بـ CTE و mRNAs الأخرى ، لكنه يفتقر إلى المجالات التي تتفاعل مع بروتينات مجمع المسام النووي. وبالتالي ، في حد ذاته ، لا يُتوقع أن يعمل كمستقبل للتصدير للهيولي النووي. ومع ذلك ، فقد أظهرنا أن بروتينات Nxf1 الصغيرة والكبيرة يمكن أن تتضاءل من خلال مجالات NH2 الطرفية ، لذلك نفترض أن Nxf1 / sNxf1 dimer هو الوحدة الوظيفية أثناء التصدير.

عندما يتم تصدير mRNA مراسل فيروس نقص المناعة البشرية مع intron المحتجزة إلى السيتوبلازم بمساعدة CTE ، يتم تعزيز ارتباط polyribosome وتعبير البروتين بشكل كبير عن طريق الإفراط في التعبير عن Nxf1 وعامله المساعد Nxt1 (Jin وآخرون. ، 2003 ب وآخرون، 2006). يشير هذا إلى تأثيرات Nxf1 / Nxt1 على المستوى السيتوبلازمي ، بما يتجاوز دور هذا المركب في تصدير nucleocytoplasmic. في التجارب المقدمة هنا ، أظهرنا أن تعايش Nxf1 الكبير والصغير ، بدون تعبير Nxt1 ، يمكن أن يعزز أيضًا ارتباط polyribosome والترجمة وأن sNxf1 موجود في polyribosomes. وبالتالي يمكن أن يعمل مغاير Nxf1 على الأرجح على تعزيز كل من التصدير والتعبير السيتوبلازمي عن الرنا المرسال الذي يحتوي على intron محتفظ به و CTE (أو عنصر شبيه CTE). تحتوي العديد من الجينات الأخرى (على سبيل المثال ، ACTN4 و SIRT7) على عناصر يمكن أن تعمل مثل CTEs (Bor وآخرون، 2006). نقوم حاليًا بتوسيع استراتيجية مصيدة النواقل التي تم استخدامها لتحديد هذه ، بالاقتران مع NGS ، لتحديد CTEs الوظيفية الإضافية والجينات التي يمكن تنظيمها بهذه الطريقة.

هناك قبول متزايد بأن mRNAs ذات الإنترونات المحتجزة منتشرة على نطاق واسع في خلايا الثدييات (Buckley وآخرون. ، 2011 ياب وآخرون. ، 2012 براونشفايغ وآخرون. ، 2014 بوتز وآخرون. ، 2015). ومع ذلك ، بسبب القيود المعروفة جيدًا لتصدير mRNAs مع الإنترونات المحتجزة (Chang and Sharp، 1989 Legrain and Rosbash، 1989 Hammarskjold، 1997) ، وحقيقة أن العديد من mRNAs تحتوي على PTCs التي تجعلها أهداف NMD ، تعبير البروتين غالبًا لم يتم تحليله في الدراسات التي تشير إلى احتباس الإنترون. استنادًا إلى البيانات المقدمة هنا ، يبدو من المعقول التكهن بأنه إذا كانت mRNAs ذات الإنترونات المحتجزة تحتوي على عناصر تعمل مثل CTE ، فقد لا يتم تصديرها فحسب ، بل من المحتمل أيضًا ترجمتها إلى بروتين ، على الأقل في بعض الخلايا. ومع ذلك ، فإن المدى الذي تعمل به هذه الآلية لتنظيم التعبير الجيني لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير خارج الأنظمة الفيروسية.

على الرغم من أن الاحتفاظ النووي بالـ mRNAs مع الإنترونات المحتجزة قد تمت دراسته لسنوات عديدة ، إلا أن الآلية الجزيئية للاحتفاظ والروابط بين التصدير النووي والترجمة لا تزال غير مفهومة جيدًا. لقد تم اقتراح أن استئصال الإنترونات يترك "علامة" على الحمض النووي الريبي تسمح بتوظيف Nxf1 وهذا يؤدي إلى تكوين مرنا مختص بالتصدير (Le Hir وآخرون. ، 2000 هوانغ وآخرون. ، 2004 مولر-مكنيكول وآخرون. ، 2016). ومع ذلك ، في NXF1 mRNA الذي يحتفظ فقط بـ intron 10 ، تتم إزالة العديد من introns على حد سواء 5 و 3 إلى هذا الإنترون ، تاركًا عدة علامات "تقاطع exon". ومع ذلك ، لا يتم تصدير هذا الرنا المرسال في حالة عدم وجود CTE وظيفي يجند Nxf1. وبالتالي يجب أن تكون هناك آلية تحتفظ بـ mRNA في النواة حتى تتم إزالة جميع الإنترونات الأخرى. من الممكن أن تتم إزالة جميع الإنترونات باستثناء intron 10 بشكل نسخ متماثل (Carrillo Oesterreich وآخرون. ، 2016) ، بينما يتم تقسم intron 10 لاحقًا وببطء أكبر لإنشاء المقسم بالكامل NXF1 مرنا. ومع ذلك ، هذا لا يفسر لماذا ، بمجرد "إطلاق" الرنا المرسال من آلية النسخ ، لا يتم تصديره ما لم يحتوي الرنا المرسال على CTE. لقد أبلغنا سابقًا أن بروتين السلة النووية Tpr قد يكون متورطًا في آلية "تصحيح التجارب المطبعية" لمنع التصدير غير المنظم لـ mRNAs مع الإنترونات المحتجزة (Coyle وآخرون. ، 2011) ، على غرار الدور المقترح للخميرة الناشئة مثل البروتينات الشبيهة بالميوسين 1 و 2 (Mlp1 / Mlp2 Galy وآخرون. ، 2004 بونيه وآخرون.، 2015 صروفيم وآخرون. ، 2015). كانت هناك أيضًا تقارير تشير إلى أن المجال الذي لا يحتوي على POU والذي يحتوي على بروتين مرتبط بالأوكتامر (Nono / Nrb54) وبروتينات أخرى من نظير البوق قد تلعب دورًا في الاحتفاظ (Chen and Carmichael ، 2009). ومع ذلك ، من الواضح أن هناك حاجة لمزيد من الدراسات التي تتناول هذه المسألة.

لقد أظهرنا مؤخرًا أن NXF1 يتم حفظ CTE بشكل كبير بين أنواع الثدييات ، كما يوجد عنصر ذو تسلسل أولي وثانوي مذهل في التسلسل الأولي والثانوي. NXF1 جين الأسماك teleost (Wang وآخرون. ، 2015). يعمل الزرد CTE بكفاءة ليحل محل Rev / RRE في سياق بنى مراسل فيروس نقص المناعة البشرية في خلايا 293T البشرية ، خاصةً بالتزامن مع Nxf1 و Nxt1 من نفس النوع. يشير هذا إلى أن CTE بالاقتران مع Nxf1 / Nxt1 هي آلية محفوظة للغاية تم استخدامها خلال تطور الفقاريات. لقد بدأنا تجارب على الفئران باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 للتعطيل على وجه التحديد NXF1 دالة CTE عن طريق إنشاء عمليات حذف صغيرة في CTE لجعلها غير وظيفية. من المتوقع أن يسمح هذا بتعبير البروتين "الكبير" لـ Nxf1 في غياب sNxf1 ويجب أن يلقي الضوء على الوظائف المحددة لـ sNxf1 في الدماغ والأعضاء الأخرى.

تُظهر الخلايا العصبية أنماط تضفير بديلة معقدة ومتغيرة للغاية (للاطلاع على مراجعة حديثة ، انظر Vuong وآخرون. ، 2016) ، والاحتفاظ بالإنترون أمر شائع (Buckley وآخرون. ، 2011). بالإضافة إلى ذلك ، فقد تم اقتراح أن NMD قد يتم تعديله لأسفل أثناء تمايز الخلايا العصبية (Bruno وآخرون. ، 2011). ال NXF1 الجين هو جزء من عائلة متعددة الجينات التي ثبت أن العديد من أفرادها يعملون في الخلايا العصبية. معامل تصدير الحمض النووي الريبي 5 (NXF5) في البشر (يُسمى عامل تصدير الحمض النووي الريبي النووي 7 [NXF7] في القوارض) باللدونة المشبكية للحصين (Callaerts-Vegh وآخرون. ، 2015) وكذلك التخلف العقلي (Frints وآخرون. ، 2003) ، والبروتينات التي يتم التعبير عنها من هذا الجين موجودة فقط في الدماغ والخصيتين (Jun وآخرون، 2001). حتى الآن ، تم إثبات مشاركة هذه البروتينات فقط في نقل الرنا المرسال السيتوبلازمي. NXF5 يقع على كروموسوم X ، كما هو الحال مع عامل تصدير الحمض النووي الريبي 2 (NXF2) والعديد من الآخرين NXF أفراد الأسرة (Jun وآخرون، 2001). يتم التعبير عن Nxf2 بشكل كبير في الحصين والخلايا العصبية الأخرى والوظائف في تصدير nucleocytoplasmic (Herold وآخرون. ، 2000 ساساكي وآخرون. ، 2005 تريتياكوفا وآخرون. ، 2005 تشانغ وآخرون. ، 2007). كما تم الإبلاغ عن أن هذا البروتين يؤدي إلى زعزعة الاستقرار NXF1 يتم التعبير عن mRNA والمستويات المنخفضة فقط من بروتين Nxf1 "كامل الطول" في الخلايا العصبية الحُصَينية (Zhang وآخرون. ، 2007). حددت دراسة حديثة NXF1 شكل إسوي مرنا يحتفظ بـ intron 10 في polyribosomes المعزولة من الخلايا العصبية في قرن آمون الماوس باستخدام تحليل RNASeq (تشو وآخرون. ، 2015). تتوافق هذه النتائج مع البيانات الواردة هنا ، والتي تُظهر تعبير بروتين sNxf1 في حصين الفئران. سيكون من المهم بشكل واضح تحليل مجموعة البيانات هذه لـ mRNAs الأخرى التي تحتوي على الإنترونات المحتجزة وتحديد ما إذا كان أي من هذه الرنا المرسال يحتوي على CTEs وظيفية أو يعتمد على sNxf1 للتصدير والترجمة. قد يكون تصدير البروتينات من mRNAs مع الإنترونات المحتجزة والتعبير عنها سمة مهمة للتعبير الجيني العصبي ، وقد تلعب بروتينات Nxf أدوارًا مهمة في تنظيم ذلك ، مما يساهم في النهاية في اللدونة العصبية.


المجسات أو البادئات التي تمتد عبر الإنترونات - (أبريل / 27/2005)

لماذا يجب أن أختار المجسات أو البادئات التي تمتد عبر الإنترونات عندما أصمم لتسلسلات (كدنا) في RT-qPCR؟

من خلال تمديد intron مع الاشعال / المجسات الخاصة بك ، فإنك تتجنب تضخيم أي تلوث للحمض النووي الجيني (الذي يحتوي على إنترونات).

هل يجب أن أقوم بتمديد intron بالكامل أم فقط التقاطع بين exon و intron؟ كيف يمكنني منع تضخيم الحمض النووي الجيني لأنه يحتوي على الكثير من الإنترونات وليس فقط إنترون واحد؟

لم أفعل أي RT-PCR في الوقت الحقيقي ولا أعرف ما إذا كانت البادئات التي تغطي الإنترونات ستساعد لأنك لن ترى العصابات.

الغرض من وجود بادئات تمتد عبر الإنترونات هو التمييز بين ما إذا كان يتم تضخيم النطاق من الحمض النووي الجيني أو cDNA. إذا كان RNA الخاص بك ملوثًا بالحمض النووي والبادئات تمتد على واحد أو أكثر من الإنترونات ، فستحصل على شريطين مع أحدهما من cDNA والآخر من DNA. من الأفضل ترك التمهيدي يمتد إلى إنترونات ليست كبيرة جدًا بحيث يمكنك الحصول على النطاق الإضافي إذا كان هناك تلوث. هناك إستراتيجية أخرى تتمثل في السماح لواحد على الأقل من البادئات بسد تقاطع إكسون-إكسون. لكني أفضل السابق. لمعرفة المزيد عن التصميم التمهيدي RT-PCR ، تحقق من هذا http://www.protocol-online.org/forums/inde. عرض الموضوع = 2706

لقد سمعت فقط عن تقاطعات exon-intron ، لكنني لاحظت أنك تستخدم تقاطعات exon-exon. هل هذا التقاطع موجود؟


كيف تصمم برايمر

تعتبر بادئات قليل النوكليوتيد ضرورية عند إجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يحتاج المرء إلى تصميم بادئات مكملة لمنطقة قالب الحمض النووي. يتم تصنيعها كيميائيًا عن طريق ضم النيوكليوتيدات معًا. يجب على المرء أن يحجب بشكل انتقائي المجموعات التفاعلية على النيوكليوتيدات ويفتحها بشكل متكرر عند إضافة نيوكليوتيد واحدًا تلو الآخر. الخاصية الرئيسية للبادئات هي أنها يجب أن تتوافق مع التسلسلات الموجودة على جزيء القالب (يجب أن تكون مكملة لقالب القالب). ومع ذلك ، لا تحتاج البادئات إلى التوافق مع قالب القالب تمامًا ، فمن الضروري ، مع ذلك ، أن الطرف الثالث من التمهيدي يتوافق تمامًا مع خيط DNA النموذجي حتى يمكن أن تستمر الاستطالة. عادة ما يتم استخدام الجوانين أو السيتوزين في نهاية 3 ، وعادة ما تحتوي نهاية 5 من التمهيدي على امتدادات من عدة نيوكليوتيدات. أيضًا ، يجب أن يشير كلا الطرفين الثلاثة من البادئات المهجنة إلى بعضهما البعض.

حجم التمهيدي مهم جدًا أيضًا. تستخدم البادئات القصيرة بشكل أساسي لتضخيم جزء صغير وبسيط من الحمض النووي. من ناحية أخرى ، يتم استخدام أساس طويل لتضخيم عينة الحمض النووي الجينومي حقيقية النواة. ومع ذلك ، لا ينبغي أن يكون التمهيدي طويلًا جدًا (> 30 ميكرًا من البادئات) أو قصيرًا جدًا. تنتج البادئات القصيرة منتجًا غير دقيق وغير محدد لتضخيم الحمض النووي ، وتؤدي البادئات الطويلة إلى معدل تهجين أبطأ. في المتوسط ​​، يجب أن يكون حجم جزء الحمض النووي الذي يحتاج إلى تضخيم في حدود 1-10 كيلو بايت.

يجب أن يكون هيكل البرايمر بسيطًا نسبيًا ولا يحتوي على هيكل ثانوي داخلي لتجنب الطي الداخلي. يحتاج المرء أيضًا إلى تجنب التلدين التمهيدي الذي يخلق ثنائيات التمهيدي ويعطل عملية التضخيم. عند التصميم ، إذا لم تكن متأكدًا من النوكليوتيدات التي يجب وضعها في موضع معين داخل التمهيدي ، فيمكن للمرء أن يشتمل على أكثر من نوكليوتيد واحد في هذا الموضع يُطلق عليه موقع مختلط. يمكن للمرء أيضًا استخدام إدراج جزيئي قائم على النيوكليوتيدات (إينوزين) بدلاً من نيوكليوتيد عادي لإمكانيات اقتران أوسع.


البلازميدات: التعريف والأنواع والنسخ المتماثل | علم الاحياء المجهري

في هذه المقالة سنناقش: - 1. التعريف من البلازميدات 2. الطبيعة الفيزيائية وعدد نسخ البلازميدات 3. الخصائص 4. عدم التوافق 5. أنواع 6. النسخ المتماثل 7. علاج البلازميد 8. استخدام البلازميدات كناقلات مخروطية.

تعريف البلازميدات:

بالإضافة إلى الكروموسوم البكتيري (نوكليويد) ، تحتوي الخلايا البكتيرية عادة على عناصر وراثية في السيتوبلازم. توجد هذه العناصر الجينية وتتكرر بشكل منفصل عن الكروموسوم وتسمى البلازميدات. تم الكشف عن وجود البلازميدات في السيتوبلازم البكتيري بواسطة Lederberg في عام 1952 أثناء العمل على عملية الاقتران في البكتيريا.

صاغ ليدربيرج المصطلح & # 8216 بلازميد & # 8217 للإشارة إلى العناصر الوراثية القابلة للانتقال التي تم نقلها من خلية بكتيرية إلى أخرى وتحديد الذكورة في البكتيريا.

حرفيا ، الآلاف من البلازميدات معروفة الآن تم عزل أكثر من 300 نوع مختلف من البلازميدات الطبيعية من سلالات الإشريكية القولونية وحدها. إلى جانب البلازميدات التي تحدث بشكل طبيعي ، تم تطوير العديد من البلازميدات المعدلة صناعياً واستخدامها كناقلات في عملية استنساخ الجينات (الهندسة الوراثية).

الطبيعة الفيزيائية وعدد نسخ البلازميدات:

الطبيعة الفيزيائية للبلازميدات بسيطة للغاية. إنها جزيئات DNA صغيرة مزدوجة الشريطة. غالبية البلازميدات دائرية ، ولكن العديد من البلازميدات الخطية معروفة أيضًا.

يختلف حجم البلازميدات الموجودة بشكل طبيعي من 1 كيلو بايت تقريبًا إلى أكثر من 1 ميغا بايت ، ويعتبر DNA البلازميد النموذجي أقل من 5٪ من حجم الكروموسوم البكتيري. يوجد معظم دنا البلازميد المعزول من الخلايا البكتيرية في تكوين الملف الفائق ، وهو الشكل الأكثر إحكاما للحمض النووي الموجود داخل الخلية.

يشير رقم النسخ إلى حقيقة أن البلازميدات المختلفة تحدث في الخلايا بأعداد مختلفة. توجد بعض البلازميدات في الخلية في 1-3 نسخ فقط ، في حين أن البعض الآخر قد يكون موجودًا في أكثر من 100 نسخة. يتم التحكم في عدد النسخ بواسطة الجينات الموجودة على البلازميد والتفاعلات بين المضيف والبلازميد.

خصائص البلازميدات:

(ط) هي خاصة ببكتيريا معينة أو بضع بكتيريا.

(2) أنها تتكاثر بشكل مستقل عن الكروموسوم البكتيري.

(3) يرمزون إلى التحويل الخاص بهم.

(4) تعمل كحلقات وتندمج بشكل عكسي في الكروموسوم البكتيري.

(5) يمكنهم التقاط ونقل جينات معينة من الكروموسوم البكتيري ،

(6) قد تؤثر على خصائص معينة للخلية البكتيرية ،

(7) تختلف البلازميدات عن الفيروسات باتباع طريقتين.

(8) أنها لا تسبب ضررًا للخلايا وهي مفيدة بشكل عام.

(9) ليس لها أشكال خارج الخلية وتوجد داخل الخلايا ببساطة كدنا حر ودائري نموذجي.

عدم توافق البلازميدات:

في بعض الحالات ، تحتوي الخلية البكتيرية المفردة على عدة أنواع مختلفة من البلازميدات. تمتلك Borrelia burgdorferi المسببة لمرض لايم ، للراحة ، 17 بلازميدًا دائريًا وخطيًا مختلفًا.

في الحالة التي يتم فيها نقل البلازميد إلى خلية بكتيرية جديدة تمتلك بالفعل بلازميدًا آخر ، يُلاحظ بشكل شائع أن البلازميد الثاني (المنقول) غير ملائم ويتم فقده أثناء النسخ المتماثل اللاحق.

تسمى هذه الحالة عدم توافق البلازميد ويقال إن كلا البلازميدات غير متوافقين. تم التعرف على عدد من مجموعات عدم التوافق للبلازميدات في البكتيريا. تستبعد البلازميدات لمجموعة عدم التوافق بعضها البعض من التكاثر في الخلية ولكنها تتعايش بشكل عام مع البلازميدات من المجموعات الأخرى.

تشترك بلازميدات مجموعة عدم التوافق في آلية مشتركة لتنظيم تكرارها وبالتالي فهي مرتبطة & # 8217 ببعضها البعض. لذلك ، على الرغم من أن الخلية البكتيرية قد تمتلك أنواعًا مختلفة من البلازميدات ، فإن كل منها متميز وراثيًا.

أنواع البلازميدات:

توجد أنواع مختلفة من البلازميدات بشكل طبيعي في الخلايا البكتيرية ، ويستند التصنيف الأكثر تفضيلاً لهذه البلازميدات على وظائفها الرئيسية المشفرة بواسطة جيناتها الخاصة.

فيما يلي النوع الرئيسي للبلازميدات المعترف بها على أساس السمة المميزة المذكورة أعلاه:

1. إف بلازميد (أو عامل إف):

F-plasmid أو F-factor (& # 8220F & # 8221 تعني الخصوبة) هو البلازميد المميز جدًا. يلعب دورًا رئيسيًا في الاقتران في بكتيريا E. coli وكان أول ما تم وصفه. إن هذا البلازميد هو الذي يمنح & # 8216 و # 8217 على الخلايا البكتيرية مصطلح "عامل الجنس" يستخدم أيضًا للإشارة إلى البلازميد F بسبب هذه الخاصية. F-plasmid هو جزيء dsDNA دائري مكون من 99159 زوجًا قاعديًا.

تظهر الخريطة الجينية للبلازميد F في الشكل 5.31. تحتوي إحدى مناطق البلازميد على جينات تشارك في تنظيم تكرار الحمض النووي (جينات rep) ، بينما تحتوي المنطقة الأخرى على عناصر قابلة للنقل (جينات IS3 و Tn 1000 و IS3 و IS2) تشارك في قدرتها على العمل كحلقة ، والثالثة كبيرة المنطقة ، منطقة tra ، تتكون من جينات tra وتمتلك القدرة على تعزيز نقل البلازميدات أثناء الاقتران. مثال F- البلازميد للإشريكية القولونية.

R- البلازميدات هي مجموعة البلازميدات الأكثر انتشارًا والأكثر دراسة والتي تمنح المقاومة (ومن ثم تسمى البلازميدات المقاومة) للمضادات الحيوية ومختلف مثبطات النمو الأخرى.

عادة ما تحتوي البلازميدات R على جينات ترمز للإنزيمات القادرة على تدمير وتعديل المضادات الحيوية. لا يتم دمجها عادة في الكروموسوم المضيف. تمتلك بعض البلازميدات R جينًا مقاومًا واحدًا فقط بينما يمكن أن يحتوي البعض الآخر على ما يصل إلى ثمانية.

البلازميد R 100 ، على سبيل المثال ، هو بلازميد زوجي 94.3 كيلو بايت (الشكل 5.32) يحمل جينات مقاومة للسلفوناميدات والستربتومايسين والسبيكتينوميسين والكلورامفينيكول والتتراسيكلين وما إلى ذلك. كما أنه يحمل الجينات التي تمنح مقاومة الزئبق.

العديد من البلازميدات R متزاوجة وتمتلك جينات مقاومة للأدوية كعناصر قابلة للنقل ، فهي تلعب دورًا مهمًا في علم الأحياء الدقيقة الطبية حيث يمكن أن يكون لانتشارها عبر التجمعات الطبيعية عواقب وخيمة في علاج الالتهابات البكتيرية.

تضفي الفوعة البلازميدات الإمراضية على البكتيريا المضيفة. إنها تجعل البكتيريا أكثر إمراضًا لأن البكتيريا أكثر قدرة على مقاومة دفاع المضيف أو إنتاج السموم.

على سبيل المثال ، تسبب بلازميدات Ti-plasmids للبكتيريا Agrobacterium tumefaciens مرض المرارة التاجية للنباتات كاسيات البذور السلالات المسببة للذيفان المعوي للإشريكية القولونية بسبب إسهال المسافر بسبب البلازميد الذي يرمز إلى السم المعوي الذي يحفز إفرازًا واسعًا للماء والأملاح في الأمعاء.

تحمل كول-بلازميدات الجينات التي تمنح البكتيريا المضيفة القدرة على قتل البكتيريا الأخرى عن طريق إفراز البكتريوسينات ، وهي نوع من البروتينات. غالبًا ما تقتل البكتريوسينات الخلايا عن طريق إنشاء قنوات في غشاء البلازما وبالتالي زيادة نفاذية. كما أنها قد تتحلل من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو تهاجم الببتيدوغليكان وتضعف جدار الخلية.

تعمل البكتيريا فقط ضد السلالات وثيقة الصلة. الكولونيل E1 البلازميد الخاص بكود الإشريكية القولونية لتخليق بكتيريوين يسمى كوليسين الذي يقتل سلالات أخرى حساسة للإشريكية القولونية. كولون بلازميدات من بعض كود الإشريكية القولونية لتخليق البكتريوسين ، وهي المراجل التي تقتل أنواع البكتيريا المعوية.

تنتج بكتيريا حمض اللاكتيك جرثومة NisinA التي تمنع بشدة نمو مجموعة واسعة من البكتيريا موجبة الجرام وتستخدم كمادة حافظة في صناعة الأغذية.

5. البلازميدات الأيضية:

تمتلك البلازميدات الأيضية (وتسمى أيضًا البلازميدات المتحللة) جينات لترميز الإنزيمات التي تحلل المواد غير العادية مثل التولوين (المركبات العطرية) ، ومبيدات الآفات (2 ، 4-ثنائي كلورو- حمض فينوكسي أسيتيك) ، والسكريات (اللاكتوز).

TOL (= pWWO) بلازميد Pseudomonas putida مثال على ذلك. ومع ذلك ، فإن بعض البلازميدات الأيضية التي تحدث في سلالات معينة من Rhizobium تحفز تكوين العقيدات في البقوليات وتجري تثبيت النيتروجين في الغلاف الجوي.

يرد ملخص موجز للأنواع المهمة من البلازميدات البكتيرية ومضيفيها وخصائصها في الجدول 5.2.

تكرار البلازميدات:

تتكاثر البلازميدات بشكل مستقل لأن لها أصول النسخ المتماثل الخاصة بها. الإنزيمات المشاركة في تكاثر البلازميد هي إنزيمات خلوية طبيعية خاصة في حالة البلازميدات الصغيرة. لكن بعض البلازميدات الكبيرة تحمل جينات ترمز للإنزيمات الخاصة بتكاثر البلازميدات.

تمتلك البلازميدات عددًا قليلًا نسبيًا من الجينات ، بشكل عام أقل من 30 ، وتهتم الجينات في المقام الأول بالتحكم في عملية بدء النسخ المتماثل وتقسيم البلازميدات المنسوخة بين الخلايا الوليدة ، فإن المعلومات الجينية المنقولة في جينات البلازميد ليست ضرورية للمضيف لأن البكتيريا التي تفتقر إليها عادة ما تعمل بشكل طبيعي.

نظرًا لأن DNA البلازميد صغير الحجم ، فإن العملية الكاملة لتكرارها تتم بسرعة كبيرة ، ربما في 1/10 أو أقل من الوقت الإجمالي لدورة انقسام الخلية.

تتكاثر معظم البلازميدات في البكتيريا سالبة الجرام بطريقة مشابهة لتكرار الكروموسوم البكتيري الذي يتضمن البدء في موقع أصل النسخ والتكرار ثنائي الاتجاه حول دائرة الحمض النووي مما يعطي ثيتا (Ө) وسيطًا.

ومع ذلك ، فإن بعض البلازميدات من البكتيريا سالبة الجرام تتكاثر بطريقة أحادية الاتجاه. تتكاثر معظم بلازميدات البكتيريا موجبة الجرام بواسطة آلية دائرة دائرية مماثلة لتلك المستخدمة بواسطة الملتهمة φx174. تتكاثر معظم البلازميدات الخطية عن طريق آلية تتضمن بروتينًا مرتبطًا بالطرف 5 & # 8242 من كل خيط DNA يتم استخدامه في تحضير الحمض النووي.

علاج البلازميد:

يمكن التخلص من البلازميدات من الخلايا البكتيرية ، وتسمى هذه العملية المعالجة. قد يحدث العلاج بشكل عفوي أو قد يكون ناتجًا عن علاجات مختلفة ، والتي تمنع تكاثر البلازميد ولكنها لا تؤثر على تكاثر الكروموسوم البكتيري وتكاثر الخلايا. يتم تخفيف البلازميدات المثبطة ببطء خارج التجمعات البكتيرية المتزايدة.

بعض عوامل المعالجة شائعة الاستخدام هي صبغات أكريدين ، والأشعة فوق البنفسجية (UV) والإشعاع المؤين ، وتجويع الثايمين والنمو فوق درجات الحرارة المثلى. تتداخل عوامل المعالجة المعالجة هذه مع تكاثر البلازميد أكثر من تكاثر الكروموسوم البكتيري.

استخدام البلازميدات كناقلات للاستنساخ:

زادت أهمية البلازميدات بشكل كبير مع ظهور تقنية الحمض النووي المؤتلف حيث أصبحت نواقل الاستنساخ الأولى ، وحتى اليوم هي أكثر نواقل الاستنساخ استخدامًا خاصة في استنساخ الجينات في البكتيريا.

يتمتعون بهذه الحالة لأن لديهم خصائص مفيدة للغاية مثل نواقل الاستنساخ التي تشمل:

(ط) الحجم الصغير ، مما يجعل من السهل عزل البلازميد ومعالجته

(2) الأصل المستقل للنسخ المتماثل ، والذي يسمح بتكرار البلازميد في الخلية للمضي قدمًا بشكل مستقل عن التحكم المباشر في الكروموسومات

(3) عدد النسخ المتعددة ، مما يجعلها موجودة في الخلية في عدة نسخ بحيث يصبح تضخيم DNA البلازميد سهلاً و

(4) وجود علامات مختارة مثل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية ، مما يجعل اكتشاف واختيار الحيوانات المستنسخة المحتوية على البلازميد أسهل.

يتم عزل ناقل البلازميد من الخلية البكتيرية وفي موقع واحد بواسطة إنزيم التقييد. يحول الانقسام DNA البلازميد الدائري إلى جزيء DNA خطي.

الآن يتم ربط الطرفين المفتوحين للبلازميد الخطي بنهايات الحمض النووي الغريب ليتم إدخاله بمساعدة إنزيم DNA ligase. هذا يعيد توليد هجين دائري أو بلازميد خيمري ، والذي يتم نقله إلى بكتيريا حيث يتكاثر ويستمر إلى أجل غير مسمى.

أحد أكثر البلازميدات استخدامًا في استنساخ الجينات في البكتيريا هو pBR322 ، والذي يحتوي على جينات مقاومة للأمبيسيلين والتتراسيكلين والعديد من مواقع التقييد. عندما يتم إدخال دنا أجنبي في جين مقاومة الأمبيسيلين لـ pBR322 ، فإن البلازميد لم يعد قادرًا على منح مقاومة للأمبيسيلين.


أساليب

سلالات الخميرة والبلازميدات

الجميع س. الخباز السلالات في هذه الدراسة لها الخلفية الجينية التالية: his3Δ1 :: TEF2-mCherry :: URA3 :: RPS28Ap-YiFP-KAN :: NAT canΔ1 :: STE2pr-Sp_his5 lypΔ1 :: STE3pr-LEU2 leu2Δ0 ura3Δ0.

تم أخذ سلالات Y-intron-FP من Yofe وزملائه [36] وتم إدخالها بجين مقاومة Kan مدمج 3 ′ نهائيًا في YFP. لإعادة تكوين الطفرات المكتشفة بعد تطور المختبر (سلالات الإنقاذ) ، قمنا بتضخيم شرائط Y-iموت-FP-KAN وتحويلها إلى سلالة تحكم السلف ، واختيار مع KAN. والجدير بالذكر أن جميع السلالات تحمل أيضًا بروتين mCherry-fluorescent مدفوعًا ببروتين مستقل TEF2 المروج الذي تم استخدامه لتطبيع التباين من خلية إلى أخرى لمستويات التعبير YFP-Kan.

وسائط

نمت الثقافات عند 30 درجة مئوية في وسط غني (1٪ مستخلص خميرة جرثومية ، 2٪ ببتون جرثومي ، و 2٪ دكستروز [YPD]).خلال جميع التجارب ، تمت إضافة G418 إلى الوسط بتركيز 3 مجم / مل ، وهو أعلى بمقدار 10 أضعاف من المعيار.

تجارب التطور

تم إجراء تجارب التطور المعمل عن طريق التخفيف التسلسلي اليومي لمدة 80 يومًا. نمت الخلايا على 1.2 مل من YPD + G418 عند 30 درجة مئوية حتى الوصول إلى المرحلة الثابتة ثم تم تخفيفها بعامل 1: 120 في وسائط جديدة (حوالي 7 أجيال لكل تخفيف ، ما مجموعه حوالي 560 جيلًا).

قياسات النمو السائل

نمت الخلايا في YPD + G418 عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تم تخفيفها إلى OD = 0.05 في YPD + G418 ، وتم أخذ قياسات الكثافة الضوئية (600 نانومتر) على فترات 30 دقيقة. تم إجراء مقارنات النمو باستخدام 96 طبقًا جيدًا ، وتم الحصول على منحنى النمو لكل سلالة بمتوسط ​​15 بئراً على الأقل.

قياسات التدفق الخلوي لمستويات YFP-Kan

نمت الخلايا في YPD + G418 عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تم تخفيفها إلى OD = 0.05 في YPD + G418 ، وتم وضعها عند 30 درجة مئوية ، وتم اتباعها حتى وصلت إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي بكثافة بصرية تتراوح بين 0.4 و 0.5. بعد ذلك ، تم قياس مستويات YFP و mCherry لما بين 20000 و 50000 خلية لكل ثقافة باستخدام قياس التدفق الخلوي. تم إجراء البوابات وفقًا للتشتت الجانبي والأمامي ، وتم تطبيع مستويات YFP مع إشارة mCherry لكل خلية على حدة.

قياسات PCR الكمية لكفاءة الربط

نمت الثقافات في YPD + G418 عند 30 درجة مئوية حتى وصلت الخلايا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي بكثافة بصرية تقارب 0.4. بعد ذلك ، تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة MasterPure (Epicenter) وتم نسخه عكسيًا إلى cDNA باستخدام بادئات عشوائية. تمت إضافة ما مجموعه 2 ميكرولتر من (كدنا) إلى كل تفاعل كقالب لـ qPCR باستخدام مجموعة cycler الخفيفة 480 SYBR I الرئيسية ونظام LightCycler 480 (Roche Applied Science) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. لكل سلالة ، تم إجراء qPCRs مع تكرارين إلى ثلاثة تكرارات بيولوجية وثلاثة تكرارات تقنية. تم إجراء أول qPCR يستهدف الإصدار المقسم بالنسخة ، مع تمهيدي أمامي يكمل تقاطع exon-exon وكتلة عكسية في اتجاه مجرى النهر. استهدف PCR الثاني النسخة غير المقسمة من النص ، مع التمهيدي الأمامي الذي يكمل intron ونفس التمهيدي العكسي للتفاعل الأول: Fإكسون إكسون = 5′-CACTTTAGGTTATGGTTT-3 ′ F.إنترون = 5′-CTTCAATTTACTGAATTTGTATG-3 ′ Rعلى حد سواء = 5′-GTCTTGTAGTTACCGTCA-3 ′.

يتم الإبلاغ عن كفاءة الربط على أنها متوسط ​​Cp للنسخة المقسمة مطروحًا منها متوسط ​​Cp للإصدار غير المقسم.

التسلسل العميق مرنا

نمت الثقافات في YPD + G418 عند 30 درجة مئوية حتى وصلت الخلايا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي بكثافة بصرية تقارب 0.4. ثم تم حصاد الخلايا بالطرد المركزي وتجميدها في النيتروجين السائل. تم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول معدل لمجموعة nucleospin 96 RNA (Machery-Nagel). على وجه التحديد ، تم إجراء تحلل الخلية في صفيحة عميقة 96 بئر عن طريق إضافة 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على 1 M سوربيتول و 100 ملي EDTA و 0.45 ميكرولتر من lyticase (10 وحدة دولية / ميكرولتر). تم تحضين الصفيحة عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لكسر جدران الخلايا وطردها لمدة 10 دقائق عند 3000 دورة في الدقيقة ، تليها إزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، استمر الاستخراج كما هو الحال في بروتوكول مجموعة nucleospin 96 RNA ، فقط باستخدام β-mercaptoethanol بدلاً من DTT. تم نسخ مقتطفات الحمض النووي الريبي (RNA) المختارة من Poly (A) ذات الحجم التقريبي 200 بت في الثانية إلى cDNA باستخدام بادئات بولي (T) تم ترميزها بمعرف جزيئي فريد (UMI). تم بعد ذلك تضخيم cDNA وتسلسله باستخدام Illumina HiSeq 2500.

تحليل التسلسل العميق مرنا

تم إجراء معالجة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في Voichek وزملاؤه [59]. بعد فترة وجيزة ، تمت محاذاة القراءات باستخدام Bowtie [60] (المعلمات: - أفضل - أ - م 2 - ستراتا - 5 10) إلى جينوم س. سيريفيسيا (R64 من SGD) مع كروموسوم إضافي يحتوي على تسلسل بناء YFP-Kan. لكل تسلسل ، قمنا بتطبيع تحيز PCR باستخدام UMIs ، كما هو موضح في Kivioja وزملائه [61]. بعد ذلك ، تم جمع القراءات لكل نهاية جين (400 نقطة أساس في المنبع إلى 200 نقطة أساس في اتجاه المصب من نهاية ORF 3) لتقدير مستوى تعبير الجين. تم استبعاد الجينات ذات التغطية الأقل من 10 قراءات. لتطبيع الاختلافات في التغطية بين العينات ، قمنا بتقسيم كل تعبير جيني على إجمالي عدد القراءة لكل عينة ثم ضربنا في 10 6. بعد ذلك ، تم حساب نسبة التعبير بين مستعمرة متطورة / إنقاذ للسلف ، وسجل2 تم إجراء العملية على تلك النسبة. تم استخدام هذه القيم لمقارنة مستويات التعبير لمجموعات الجينات (الجينات الريبوزومية ، جينات الاستجابة العامة للضغط ، جينات آلات الربط ، الجينات المحتوية على intron) ومستويات YFP-Kan mRNA كما هو موضح في المخطوطة. عند حساب مستويات التعبير عن آلات الربط ومجموعات الجينات المحتوية على intron ، تم استبعاد جينات الاستجابة للضغط والريبوسومات من التحليل من أجل تجنب التحيز من التنظيم الخلوي بسبب التغيرات في علم وظائف الأعضاء ومعدل نمو الخلايا.

هندسة الجينوم كريسبر

بروتوكول CRISPR لـ س. الخباز تم إجراؤه كما هو موضح سابقًا [62]. بعد فترة وجيزة ، تم استنساخ تسلسلات gRNA التي تستهدف موقعًا بالقرب من (& lt50 bps) موضع الطفرات المرغوبة في ناقل bRA89 الذي يسمح بالتعبير المشترك عن Cas9 و gRNA. تم تحويل بلازميد كريسبر (1 ميكروغرام) إلى خلايا خميرة (20 ميكرولتر) جنبًا إلى جنب مع كاسيت dsDNA للإصلاح مع الطفرات المرغوبة (500 نانوغرام) باستخدام بروتوكول تحويل الخميرة القياسي. تم طلاء الخلايا على ألواح انتقائية (YPD + hygromycin ، 50 مجم / مل) ، وتم فحص المستعمرات باستخدام تسلسل PCR و Sanger للطفرات المرغوبة ، ونمت المستعمرات الإيجابية على وسائط متساهلة لمدة 24 ساعة للتأكد من فقدان بلازميد كريسبر ، والنسخ. تم تخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.

يحتوي شريط الإصلاح على تماثل 45 نقطة أساس في كل طرف ، ويحيط بالطفرة المرغوبة. نظرًا لأن الطفرة لم تعدل تسلسل PAM ، فقد تم أيضًا إدخال طفرات مترادفة إضافية جنبًا إلى جنب مع الطفرة المطلوبة لإيقاف قطع الموضع بواسطة مجمع Cas9 + gRNA. تم تقديم هذه الطفرات المترادفة أيضًا إلى الخلفية الجينية ذات الصلة دون الطفرات المرغوبة وتم التأكد من عدم تأثيرها على النمو الخلوي أو مستويات التعبير YFP.

الترسيب المناعي المشترك للحمض النووي الريبي

نمت خلايا الخميرة في YPD عند 25 درجة مئوية حتى المرحلة اللوغاريتمية وتم جمعها عن طريق الطرد المركزي. تم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت RNA-IP بحجم 1 × (25 ملي مولار Tris-HCl [7.5 درجة الحموضة] ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مولار MgCl2، 0.5٪ [v / v] Triton X-100 ، 0.2 ملي PMSF في الأيزوبروبانول ، 0.5 ملي مولار DTT ، 40 وحدة من مثبط RiboLock RNase [Thermo Fisher Scientific] ، كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA [Roche Diagnostics and Sigma-Aldrich] ) و lysed مع دوامة قوية ثلاث مرات ، 20 ثانية ، 6 م / ث مع FastPrep-24 Instrument (MP Biomedicals) في وجود 1 × حجم بيليه من الخرز الزجاجي. بالنسبة للترسيب المناعي ، تم تحضين المستحلبات التي تم تطهيرها مع أو بدون جسم مضاد Gbp2 أو Npl3 (أرنب متعدد النسيلة ، عصامي) عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة متبوعًا بإضافة 10 ميكرولتر من حبات البروتين G sepharose (Amersham Biosciences) ومزيد من الحضانة عند 4 درجات. C لمدة ساعتين. تمت إضافة DNase I (QIAGEN) الخالي من RNase أيضًا لهضم الحمض النووي أثناء الحضانة. تمت معالجة ما مجموعه 100 ميكرولتر من المحللة باستخدام DNase I واحتضانها عند 4 درجات مئوية بالتوازي. تم غسل الخرزات خمس مرات باستخدام عازلة RNA-IP. تم عزل الحمض النووي الريبي من كل من العينات المحللة والعينة باستخدام كاشف TRIzol (Thermo Fisher Scientific) وتم التصفية التتابعية في 20 ميكرولتر من DEPC ddH المعالج2O. قبل النسخ العكسي ، عولجت عينات الحمض النووي الريبي باستخدام TURBO DNA-مجانا Kit (Thermo Fisher Scientific) للقضاء على الحمض النووي المتبقي.

النسخ العكسي و qRT-PCR للحمض النووي الريبي المترسب

تم نسخ نفس تركيز الحمض النووي الريبي من جميع العينات عكسيًا باستخدام FastGene Scriptase II cDNA Kit (NIPPON Genetics EUROPE) مع Random Hexamer Primer (Thermo Fisher Scientific). تم تحضير عينات PCR باستخدام qPCRBIO Sygreen Mix Lo-ROX (PCR Biosystems) ، وتم إجراء qRT-PCR باستخدام CFX Connect Real-Time PCR Detection System (مختبرات Bio-Rad) لمدة 45 دورة مع درجة حرارة تصلب 60 درجة مئوية. التمهيدي الأمامي (5′-TTATTCACTGGTGTTGTCCC-3) والتمهيدي العكسي (5′-CATGGAACTGGCAATTTACC-3) الذي يرتبط بشكل خاص بـ YFP-كان استخدمت. تم إجراء كل تفاعل PCR في ثلاث نسخ ، وتم استخدام متوسط ​​قيمة Cq في مزيد من التحليل. من كل قيمة Cq eluate ، تم استبدال قيمة Cq المقابلة لها (ΔCq). تم طرح Cq لعينة التحكم في عدم وجود جسم مضاد من Cq للعينة المنسدلة (Cq). تم حساب ارتباط الحمض النووي الريبي بمقدار 2 −ΔΔCq.


شاهد الفيديو: أساسيات تفاعل الـ PCR (شهر نوفمبر 2022).