معلومة

3.7: مرق التربتون - علم الأحياء

3.7: مرق التربتون - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يقوم التربتوفاناز البكتيري بتغطية الحمض الأميني التربتوفان إلى البيروفات والأمونيا والإندول. الوسط المستخدم لاختبار هذا الإنزيم هو 1٪ تريبتون في الماء.

إجراء

  1. الحصول على أنبوب من مرق التربتون.
  2. باستخدام حلقة التلقيح ، حفيف بعض الكائنات الحية المخصصة لك في المرق.
  3. احتضان الأنبوب لمدة 48 ساعة على الأقل.
  4. بعد فترة الحضانة ، أضف عدة قطرات من كاشف Kovac إلى الأنبوب.

ترجمة

تتفاعل المواد الكيميائية الموجودة في كاشف Kovac مع الإندول لإنتاج لون أحمر. في الاختبار الإيجابي ، ستطفو طبقة حمراء على سطح المرق.

إندول إيجابي


مرق ليسوجيني

مرق ليسوجيني (رطل) هي وسيلة غنية بالتغذية تستخدم في المقام الأول لنمو البكتيريا. قصد خالقها جوزيبي بيرتاني رطل على الوقوف ل مرق ليسوجيني، [1] لكن LB أصبح يعني أيضًا بالعامية مرق لوريا, مرق لينوكس, مرق الحياة أو لوريا - برتاني متوسطة. صيغة ملف متوسط ​​رطل تم نشره في عام 1951 في أول ورقة بحثية لبيرتاني عن اللايسوجيني. في هذه المقالة وصف تجربة الدفعة المفردة المعدلة وعزل العاثيات P1 و P2 و P3. لقد طور متوسط ​​رطل لتحسين شيغيلا النمو وتكوين البلاك. [1] [2]

كانت تركيبات وسائط LB معيارًا صناعيًا لزراعة الإشريكية القولونية منذ خمسينيات القرن الماضي. [3] [4] [5] [6] [7] تم استخدام هذه الوسائط على نطاق واسع في تطبيقات علم الأحياء الدقيقة الجزيئي لتحضير DNA البلازميد والبروتينات المؤتلفة. لا تزال واحدة من أكثر الوسائط شيوعًا المستخدمة للحفاظ على سلالات المختبر المؤتلفة وزراعتها الإشريكية القولونية. [8] ومع ذلك ، بالنسبة للدراسات الفسيولوجية ، يجب تثبيط استخدام وسط LB. [9]

هناك العديد من الصيغ الشائعة لـ LB. على الرغم من اختلافهما ، إلا أنهما يشتركان عمومًا في تركيبة متشابهة إلى حد ما من المكونات المستخدمة لتعزيز النمو ، بما في ذلك ما يلي:

يتم توفير أيونات الصوديوم للنقل والتوازن الأسموزي بواسطة كلوريد الصوديوم. يستخدم التربتون لتوفير الأحماض الأمينية الأساسية مثل الببتيدات والبيبتون للبكتيريا النامية ، بينما يستخدم مستخلص الخميرة لتوفير عدد كبير من المركبات العضوية المفيدة لنمو البكتيريا. تشمل هذه المركبات الفيتامينات وبعض العناصر النزرة.

في ورقته الأصلية عام 1951 ، استخدم برتاني 10 جرامات من كلوريد الصوديوم و 1 جرام من الجلوكوز لكل لتر من محلول لوريا في "مرق L" لعام 1957 نسخًا وصفة بيرتاني الأصلية تمامًا. [6] الوصفات المنشورة لاحقًا تركت الجلوكوز.


3.7: مرق التربتون - علم الأحياء

تقوم بتلقيح كائن حي غير معروف في مرق التربتون. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، أضف 10 قطرات من Kovac. حلقة حمراء تتطور. ماذا تعرف عن الكائن الحي الخاص بك؟ حدد كل ما ينطبق. [/ caption] أ) ينتج الكائن ديسولفهيدراز. ب) ينتج الكائن الحي التربتوفوناز. ج) أنتج الكائن الحامض. د) أنتج الكائن الإندول. E.) يمكن للكائن الحي الاستفادة من التربتوفان. F.) يمكن للكائن الحي الاستفادة من النشا.

تقوم بتلقيح كائن حي غير معروف في مرق التربتون. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، أضف 10 قطرات من Kovac. حلقة حمراء تتطور. ماذا تعرف عن الكائن الحي الخاص بك؟ حدد كل ما ينطبق. [/ caption]
أ) ينتج الكائن ديسولفهيدراز.
ب) ينتج الكائن الحي التربتوفوناز.
ج) أنتج الكائن الحامض.
د) أنتج الكائن الإندول.
E.) يمكن للكائن الحي الاستفادة من التربتوفان.
F.) يمكن للكائن الحي الاستفادة من النشا.

ب) ينتج الكائن الحي التربتوفوناز.
د) أنتج الكائن الإندول.
E.) يمكن للكائن الحي الاستفادة من التربتوفان.

استخدم رصيد محفظتك أو قم بتحميل محفظتك على الفور باستخدام PayPal أو بطاقة الائتمان للشراء. 5 دولارات لكل حل كامل.


متطلبات تحضير TRYPTICASE SOY BROTH MEDIUM (TSB)

  • دورق مخروطي معقم / دورق مخروطي
  • الملعقة المسطحة
  • هضم البنكرياس للكازين
  • هضم البابوية من وجبة فول الصويا
  • سكر العنب (الجلوكوز)
  • فوسفات هيدروجين ثنائي البوتاسيوم
  • كلوريد الصوديوم
  • قياس الاسطوانة
  • 1N حمض الهيدروكلوريك
  • 1N هيدروكسيد الصوديوم
  • قطاع الأس الهيدروجيني
  • جهاز قياس الوزن
  • ماء مقطرة
  • ورق الزبدة

المواد التكميلية الإلكترونية متاحة على الإنترنت على https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4971935.

تم النشر بواسطة الجمعية الملكية بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

مراجع

. 1994 الآثار المترتبة على توطين bcd mRNA من التوزيع المكاني لبروتين exu في ذبابة الفاكهة التكوُّن. طبيعة سجية 369، 400-403. (دوى: 10.1038 / 369400a0) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. عائلة GFP 2008: رؤى هيكلية في الضبط الطيفي. تشيم. بيول. 15، 755-764. (دوى: 10.1016 / j.chembiol.2008.07.009) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

توماس إن ، كينريك إم ، جيزلر تي ، كيسر جي ، تينكلر إتش ، ستابس إس

. 2005 توصيف وتنميط التعبير الجيني لخط خلوي ثابت يعبر عن مستشعر GFP لدورة الخلية. دورة الخلية 4، 191-195. (دوى: 10.4161 / cc.4.1.1405) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Kintaka R، Makanae K، Moriya H

. 2016 عيوب النمو الخلوي الناجمة عن الحمل الزائد لعمليات توطين البروتين. علوم. اعادة عد. 6، 31774. (doi: 10.1038 / srep31774) Crossref، PubMed، ISI، Google Scholar

. 2008 مجال الرأس العنق من Arabidopsis myosin XI ، MYA2 ، مدمج مع GFP ينتج أنماط F-actin التي تتزامن مع تدفق عضوي سريع في خلايا نباتية مختلفة. بيول مصنع بيول. 8، Artn 74. (doi: 10.1186 / 1471-2229-8-74) Crossref، ISI، Google Scholar

كرافت سي ، ديبلازيس أ ، سورمان إم ، بيتر م

. تتحلل الريبوسومات الناضجة عام 2008 بشكل انتقائي عند الجوع من خلال مسار الالتهام الذاتي الذي يتطلب بروتياز Ubp3p / Bre5p ubiquitin. نات. خلية بيول. 10، 602-610. (دوى: 10.1038 / ncb1723) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Brieger A ، Plotz G ، Hinrichsen I ، Passmann S ، Adam R ، Zeuzem S

. 2012 C- وضع العلامات الفلورية الطرفية يضعف وظيفة بروتينات إصلاح عدم تطابق الحمض النووي. بلوس واحد 7، e31863. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0031863) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

. 2007 المجال C- الطرفية لـ MinC يمنع تجميع الحلقة Z في الإشريكية القولونية . J. باكتيريول. 189، 236-243. (دوى: 10.1128 / JB.00666-06) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Weill U ، Krieger G ، Avihou Z ، Milo R ، Schuldiner M ، Davidi D

. 2019 تقييم موضع علامة GFP على توطين البروتين ولياقة النمو في الخميرة. جيه مول. بيول. 431، 636-641. (دوى: 10.1016 / j.jmb.2018.12.004) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

أندريسن إم ، شميتز سالو آر ، جاكوبس إس

. 2004 علامات التتراسيستين القصيرة لبيتا توبيولين توضح أهمية الملصقات الصغيرة لتصوير الخلايا الحية. مول. بيول. زنزانة. 15، 5616-5622. (دوى: 10.1091 / mbc.e04-06-0454) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 1999 التذبذب السريع من القطب إلى القطب للبروتين المطلوب لتوجيه الانقسام إلى منتصف الإشريكية القولونية . بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96، 4971-4976. (دوى: 10.1073 / pnas.96.9.4971) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Di Ventura B، Knecht B، Andreas H، Godinez WJ، Fritsche M، Rohr K، Nickel W، Heermann DW، Sourjik V

. 2013 فصل الكروموسوم بواسطة الإشريكية القولونية نظام دقيقة. مول. النظام. بيول. 9، 686. (دوى: 10.1038 / msb.2013.44) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

أكرلوند تي ، جولبراند ب ، نوردستروم ك

. 2002 تأثيرات نظام Min على الفصل النووي في الإشريكية القولونية . علم الاحياء المجهري 148، 3213-3222. (دوى: 10.1099 / 00221287-148-10-3213) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

دي بوير با ، كروسلي ري ، روثفيلد لي

. 1988 عزل وخصائص minB ، وهو موضع وراثي معقد يشارك في الوضع الصحيح لموقع التقسيم في الإشريكية القولونية . J. باكتيريول. 170، 2106-2112. (دوى: 10.1128 / jb.170.5.2106-2112.1988) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

دي بوير با ، كروسلي ري ، روثفيلد لي

. 1989 يحدد مثبط الانقسام وعامل الخصوصية الطوبولوجي المشفر بواسطة موضع الخلية الصغيرة الموضع المناسب لحاجز الانقسام في بكتريا قولونية . زنزانة 56، 641-649. (دوى: 10.1016 / 0092-8674 (89) 90586-2) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 1997 حلقة MinE: بنية خلية مستقلة عن FtsZ مطلوبة لاختيار موقع التقسيم الصحيح في بكتريا قولونية . زنزانة 91، 685-694. (دوى: 10.1016 / s0092-8674 (00) 80455-9) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

هيل كاليفورنيا ، مينهاردت ، دي بوير بنسلفانيا

. 2001 دورة التعريب الديناميكي لمنظم انقسام الخلايا MinE in الإشريكية القولونية . EMBO J. 20، 1563-1572. (دوى: 10.1093 / emboj / 20.7.1563) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Lutkenhaus J، Sundaramoorthy M

. 2003 MinD ودور عزر Walker A المنحرف ، و dimerization وربط الغشاء في التذبذب. مول. ميكروبيول. 48، 295-303. (دوى: 10.1046 / j.1365-2958.2003.03427.x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Szeto TH، Rowland SL، Habrukowich CL، King GF

. 2003 تسلسل استهداف الغشاء MinD عبارة عن حلزون مرتبط بالدهون قابل للزرع. J. بيول. تشيم. 278، 40 050-40 056. (دوى: 10.1074 / jbc.M306876200) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

Szeto TH، Rowland SL، Rothfield LI، King GF

. 2002 توطين غشاء MinD بوساطة شكل C-terminal الذي يتم حفظه عبر eubacteria و archaea و chloroplasts. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 99، 15693-15 698. (دوى: 10.1073 / pnas.232590599) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

. 2003 مطلوب تسلسل محفوظ عند الطرف C لـ MinD للربط بالغشاء واستهداف MinC للحاجز. مول. ميكروبيول. 47، 345-355. (دوى: 10.1046 / j.1365-2958.2003.03321.x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

دي بوير با ، كروسلي ري ، هاند أر ، روثفيلد لي

. 1991 بروتين MinD عبارة عن غشاء ATPase مطلوب من أجل الوضع الصحيح لـ الإشريكية القولونية موقع التقسيم. EMBO J. 10، 4371-4380. كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

دي بوير با ، كروسلي ري ، روثفيلد لي

. 1992 أدوار MinC و MinD في كتلة الفصل الخاصة بالموقع بوساطة نظام MinCDE لـ الإشريكية القولونية . J. باكتيريول. 174، 63-70. (دوى: 10.1128 / jb.174.1.63-70.1992) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Hernandez-Rocamora VM، Garcia-Montanes C، Reija B، Monterroso B، Margolin W، Alfonso C، Zorrilla S، Rivas G

. 2013 بروتين MinC يقصر الخيوط الأولية FtsZ من خلال التفاعل بشكل تفضيلي مع الوحدات الفرعية المرتبطة بالناتج المحلي الإجمالي. J. بيول. تشيم. 288، 24625-24 635. (دوى: 10.1074 / jbc.M113.483222) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

Hu Z، Mukherjee A، Pichoff S، Lutkenhaus J

. 1999 مكون MinC لنظام اختيار موقع التقسيم في الإشريكية القولونية يتفاعل مع FtsZ لمنع البلمرة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96، 14 819-14 824. (دوى: 10.1073 / pnas.96.26.14819) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

لابريك سي جيه ، كونتي جي ، فيولا إم جي ، كامبرج جل

. تعدل تفاعلات 2019 MinC N- و C-domain تجميع FtsZ ، واختيار موقع التقسيم ، والتذبذب المعتمد على MinD في الإشريكية القولونية . J. باكتيريول. 201، e00374-18. (دوى: 10.1128 / JB.00374-18) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2017 MinD يتفاعل مباشرة مع FtsZ في H10 helix يقترح نموذجًا للتنشيط القوي لـ MinC لزعزعة استقرار بوليمرات FtsZ. بيوتشيم. ج. 474، 3189-3205. (دوى: 10.1042 / Bcj20170357) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2001 التنظيم الطوبولوجي لانقسام الخلايا في بكتريا قولونية يتطلب التذبذب الزماني المكاني للـ MinD تحفيز ATPase بواسطة MinE و phospholipid. مول. زنزانة. 7، 1337-1343. (دوى: 10.1016 / s1097-2765 (01) 00273-8) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Park KT، Villar MT، Artigues A، Lutkenhaus J

. تنظم ديناميكيات التوافق لعام 2017 ربط الغشاء وتفاعل MinD والحد الأدنى من التذبذب. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 114، 7497-7504. (دوى: 10.1073 / pnas.1707385114) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Park KT، Wu W، Battaile KP، Lovell S، Holyoak T، Lutkenhaus J

. 2011 يستخدم مذبذب الحد الأدنى تغييرات توافقية تعتمد على MinD في MinE لتنظيم الحركة الخلوية مكانيًا. زنزانة 146، 396-407. (دوى: 10.1016 / j.cell.2011.06.042) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2006 الحد الأدنى المحدث بالضوضاء في بكتريا قولونية . PLoS Comput. بيول. 2، e80. (دوى: 10.1371 / journal.pcbi.0020080) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

فو X ، شيه يل ، تشانغ واي ، روثفيلد لي

. 2001 حلقة MinE المطلوبة للوضع المناسب لموقع التقسيم عبارة عن هيكل متحرك يغير موقعه الخلوي أثناء الإشريكية القولونية دورة الانقسام. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 98، 980-985. (دوى: 10.1073 / pnas.031549298) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Hsieh CW، Lin TY، Lai HM، Lin CC، Hsieh TS، Shih YL

. 2010 تفاعل مباشر مع غشاء MinE يساهم في التوطين المناسب لـ MinDE في بكتريا قولونية . مول. ميكروبيول. 75، 499-512. (دوى: 10.1111 / j.1365-2958.2009.07006.x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2016 رسم خرائط لأنماط البروتين الأدنى في غرف سائلة محصورة بالكامل. eLife 5، e19271. (دوى: 10.7554 / eLife.19271) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

فضفاض م ، فيشر فريدريش إي ، ريس ي ، كروس ك ، شويل ب

. 2008 المنظمات المكانية لتقسيم الخلايا البكتيرية تنظم نفسها في موجات سطحية في المختبر . علم 320، 789-792. (دوى: 10.1126 / العلوم .1154413) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Vecchiarelli AG، Li M، Mizuuchi M، Mizuuchi K

. 2014 تأثير التقاربات التفاضلية بين MinD و MinE إلى أنيوني فسفوليبيد ديناميكيات الحد الأدنى للنمط في المختبر . مول. ميكروبيول. 93، 453-463. (دوى: 10.1111 / mmi.12669) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

غلوك ف ، براون إف ، هالاتك ي ، فراي إي ، شويل بي

. 2019 تصميم أنظمة تشكيل الأنماط البيوكيميائية من الحد الأدنى من الزخارف. eLife 8، e48646. (دوى: 10.7554 / eLife.48646) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Kohyama S ، Yoshinaga N ، Yanagisawa M ، Fujiwara K ، Doi N

. 2019 يتحكم الحبس بحجم الخلية في توليد واستقرار موجة البروتين من أجل التنظيم الزماني المكاني في الخلايا. eLife 8، e44591. (دوى: 10.7554 / eLife.44591) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Park KT، Wu W، Lovell S، Lutkenhaus J

. 2012 آلية التنشيط غير المتماثل لـ MinD ATPase بواسطة MinE. مول. ميكروبيول. 85، 271-281. (دوى: 10.1111 / j.1365-2958.2012.08110.x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2009 خريطة ديناميكية لتفاعلات البروتين في الإشريكية القولونية مسار الانجذاب الكيميائي. مول. النظام. بيول. 5، ARTN 238. (دوى: 10.1038 / msb.2008.77) كروسريف ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Zacharias DA ، Violin JD ، Newton AC ، Tsien RY

. 2002 تقسيم GFPs أحادي المعدل الدهني إلى نطاقات غشائية دقيقة للخلايا الحية. علم 296، 913-916. (دوى: 10.1126 / العلوم .1068539) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2011 التقسيم الذاتي التنظيم للبروتينات المترجمة ديناميكيًا في انقسام الخلايا البكتيرية. مول. النظام. بيول. 7، 457. (دوى: 10.1038 / msb.2010.111) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Eswar N ، و Webb B ، و Marti-Renom MA ، و Madhusudhan MS ، و Eramian D ، و Shen MY ، و Pieper U ، و Sali A

. 2006 نمذجة بنية البروتين المقارنة باستخدام Modeller. بالعملة. بروتوك. المعلوماتية الحيوية 15، 5.6.1-5.6.30. (دوى: 10.1002 / 0471250953.bi0506s15) كروسريف ، الباحث العلمي من Google

2010 تخصيص عزر تفاعل البروتين MinD من خلال الواجهة ثنائية الأبعاد لمنظم انقسام الخلايا البكتيرية MinE. بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 107، 18416-18 421. (دوى: 10.1073 / pnas.1007141107) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

Klepeis JL، Lindorff-Larsen K، Dror RO، Shaw DE

. 2009 محاكاة الديناميكيات الجزيئية طويلة المدى لهيكل البروتين ووظيفته. بالعملة. رأي. هيكل. بيول. 19، 120-127. (دوى: 10.1016 / j.sbi.2009.03.004) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

C Czaplewski ، Karczynska A ، Sieradzan AK ، Liwo A

. 2018 خادم UNES لمحاكاة الحبيبات الخشنة القائمة على الفيزياء والتنبؤ بهيكل البروتين والديناميات والديناميكا الحرارية. الدقة الأحماض النووية. 46، W304-W309. (دوى: 10.1093 / nar / gky328) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Kretschmer S، Zieske K، Schwille P

. 2017 تعديل واسع النطاق لأنماط وتدرجات البروتين الدقيقة المعاد تشكيلها بواسطة طفرات محددة في تسلسل استهداف الغشاء في MinE. بلوس واحد 12، e0179582. (دوى: 10.1371 / journal.pone.0179582) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

تشانغ واي ، رولاند إس ، كينغ جي ، براسويل إي ، روثفيلد إل

. 1998 العلاقة بين تكوين قليل متغاير ووظيفة مجال الخصوصية الطوبولوجية لـ الإشريكية القولونية بروتين مين. مول. ميكروبيول. 30، 265-273. (دوى: 10.1046 / j.1365-2958.1998.01059.x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

غوسال د ، ترامبايولو د ، عاموس لوس أنجلوس ، لوي ج

. 2014 بروتينات الانقسام الخلوي MinCD تشكل خيوطًا حركية للخلايا مشتركة متناوبة. نات. كومون. 5، 5341. (doi: 10.1038 / ncomms6341) Crossref، PubMed، ISI، Google Scholar

. 2004 يشير تحديد موقع موقع ربط MinE على سطح MinD إلى آلية معقولة لتنشيط الإشريكية القولونية MinD ATPase أثناء اختيار موقع التقسيم. مول. ميكروبيول. 54، 99-108. (دوى: 10.1111 / j.1365-2958.2004.04265.x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

وو دبليو ، بارك كي تي ، هوليواك تي ، لوتكينهاوس ج

. يكشف تحديد هيكل مجمع MinD-ATP لعام 2011 عن اتجاه MinD على الغشاء والموقع النسبي لمواقع الربط لـ MinE و MinC. مول. ميكروبيول. 79، 1515-1528. (دوى: 10.1111 / j.1365-2958.2010.07536.x) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Yang S و Shen Q و Wang S و Song C و Lei Z و Han S و Zhang X و Zheng J و Jia Z

. 2017 توصيف هيكل C- الطرفية لـ MinC وتأثيره في تطور انقسام الخلايا البكتيرية. علوم. اعادة عد. 7، 7627. (دوى: 10.1038 / s41598-017-08213-5) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Zhou H، Schulze R، Cox S، Saez C، Hu Z، Lutkenhaus J

. يكشف تحليل 2005 لطفرات MinD عن المخلفات المطلوبة لتحفيز MinE لقاعدة MinD ATPase والمخلفات المطلوبة لتفاعل MinC. J. باكتيريول. 187، 629-638. (دوى: 10.1128 / JB.187.2.629-638.2005) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2003 تجنيد MinC ، وهو مثبط لتشكيل الحلقة Z ، للغشاء في الإشريكية القولونية: دور MinD و MinE. J. باكتيريول. 185، 196-203. (دوى: 10.1128 / jb.185.1.196-203.2003) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Lackner LL، Raskin DM، de Boer PAJ

. 2003 التفاعلات المعتمدة بين ATP الإشريكية القولونية البروتينات الدقيقة والغشاء الفسفوليبيد في المختبر . J. باكتيريول. 185، 735-749. (دوى: 10.1128 / Jb.185.3.735-749.2003) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Zheng M، Chiang YL، Lee HL، Kong LR، Hsu ST، Hwang IS، Rothfield LI، Shih Y-L

. 2014 التجميع الذاتي لـ MinE على الغشاء هو الأساس لتشكيل حلقة MinE للحفاظ على وظيفة الإشريكية القولونية نظام دقيقة. J. بيول. تشيم. 289، 21252-21 266. (دوى: 10.1074 / jbc.M114.571976) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

Yang M ، Jalloh AS ، Wei W ، Zhao J ، Wu P ، Chen PR

. تم تمكين قياس الأس الهيدروجيني المخصص للمقصورة في الداخل بكتريا قولونية . نات. كومون. 5، 4981. (doi: 10.1038 / ncomms5981) Crossref، PubMed، ISI، Google Scholar

بانزا ف ، ماير ج ، شميس سي ، روثباور يو ، سولنر سي

. 2015 التصوير الحي لديناميات البروتين الداخلي في أسماك الزرد باستخدام الأجسام الصبغية. تطوير 142، 1879-1884. (دوى: 10.1242 / dev.118943) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2006 استهداف وتتبع المستضدات في الخلايا الحية ذات الأجسام النانوية الفلورية. نات. أساليب 3، 887-889. (دوى: 10.1038 / nmeth953) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

2012 فيجي: منصة مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية. نات. أساليب 9، 676-682. (دوى: 10.1038 / nmeth.2019) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2004 STRIDE: خادم ويب لتخصيص البنية الثانوية من الإحداثيات الذرية المعروفة للبروتينات. الدقة الأحماض النووية. 32، W500-W502. (دوى: 10.1093 / nar / gkh429) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar

تساي واي ، هولتون تي ، ييتس تو

. 2015 إمكانية الوصول للانتشار كطريقة لتصور هندسة السطح الجزيئي. علوم البروتين. 24، 1702-1705. (دوى: 10.1002 / pro.2752) Crossref و PubMed و ISI و Google Scholar


إنزيمات كريسبر كاس

روبرت دي فاجرلوند. Peter C. Fineran، in Methods in Enzymology، 2019

2.1.2 المخازن والكواشف

5 مل و 0.5 لتر من مرق Lysogeny Broth (LB) (10 جم / لتر جرثومي ، 5 جم / لتر مستخلص الخميرة ، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم)

عازلة تحلل العقديات: 50 مم HEPES-NaOH ، درجة الحموضة 7.5 ، 0.5 م بوكل ، 10٪ حجم / حجم جلسرين

عازلة شطف البكتيريا: 50 مم HEPES-NaOH ، درجة الحموضة 7.5 ، 0.5 م بوكل ، 10٪ v / v الجلسرين ، 3 مم د- ديستيوبيوتين

العازلة Strep SEC: 10 مم HEPES-NaOH ، درجة الحموضة 7.5 ، 0.5 م بوكل ، 10٪ جلسرين

مثبط البروتياز الخالي من مادة EDTA (روش) cOmplete ™

100 مم فلوريد فينيل ميثان سلفونيل (PMSF)

راتنج Strep-Takin (IBA Sciences)

حمام جليدي بالنيتروجين السائل أو الإيثانول الجاف


مرق تربتيك فول الصويا (TSB) وسائط الثقافة المجففة والمحضرة ، تشخيصات BD

Avantor & reg ، إحدى شركات Fortune 500 ، هي مزود عالمي رائد للمنتجات والخدمات ذات المهام الحرجة للعملاء في مجال الأدوية الحيوية والرعاية الصحية والتعليم والحكومة والتقنيات المتقدمة وصناعات المواد التطبيقية. تُستخدم محفظتنا في كل مرحلة تقريبًا من مراحل أنشطة البحث والتطوير والإنتاج الأكثر أهمية في الصناعات التي نخدمها. تأتي إحدى أعظم نقاط قوتنا من امتلاك بنية تحتية عالمية ذات موقع استراتيجي لدعم احتياجات عملائنا. تمكننا بصمتنا العالمية من خدمة أكثر من 225000 موقع للعملاء وتمنحنا وصولاً مكثفًا إلى مختبرات البحث والعلماء في أكثر من 180 دولة. نضع العلم في حركة لخلق عالم أفضل. للحصول على معلومات ، قم بزيارة www.avantorsciences.com وتجدنا على LinkedIn و Twitter و Facebook.

& نسخ 2021 VWR International، LLC. كل الحقوق محفوظة.
& نسخ 2021 FORTUNE Media IP Limited جميع الحقوق محفوظة. مستخدمة بموجب ترخيص.

لا يدعم موقع الويب هذا إصدار Internet Explorer الخاص بك. نوصيك بالترقية إلى Internet Explorer 11 أو مستعرض آخر مدعوم ، والتحقق لمعرفة ما إذا كنت تستخدم IE11 في وضع عرض التوافق.


استخدام أداة وضع العلامات الطرفية بوساطة dUTP Nick (TUNEL) و Caspase 3/7 لقياس موت خلايا البشرة في الضفادع المصابة بداء الكيتريديوم

نقيس كمية موت خلايا البشرة في الضفادع المصابة بداء الفطريات الفطرية باستخدام طريقتين. أولاً ، نستخدم وسم الطرف النهائي بوساطة dUTP (TUNEL) فى الموقع علم الأنسجة لتحديد الفروق بين الحيوانات المصابة سريريًا وغير المصابة. ثانيًا ، نجري تحليل تسلسل زمني لموت الخلايا المبرمج على العدوى باستخدام تحليل بروتين كاسباس 3/7.

الملخص

تعاني البرمائيات من خسارة كبيرة في التنوع البيولوجي على مستوى العالم وأحد الأسباب الرئيسية هو مرض الفطريات الفطرية المعدية. هذا المرض ناجم عن مسببات الأمراض الفطرية Batrachochytrium dendrobatidis (ب) ، الذي يصيب البشرة ويعطلها ، ومع ذلك ، لم يتم تحديد التغيرات المرضية بشكل صريح. يمكن استخدام موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) بواسطة مسببات الأمراض لتدمير الأنسجة المضيفة ، ولكن يمكن أيضًا أن يكون آلية مضيفة لمقاومة المرض لإزالة العوامل الممرضة. في هذه الدراسة ، نحدد كمية موت خلايا البشرة للحيوانات المصابة وغير المصابة باستخدام مقايسين مختلفين: وسم نهاية dUTP بوساطة ترانسفيراز النهائي (TUNEL) ، و caspase 3/7. باستخدام نسيج الجلد البطني والظهري والفخذ في اختبار TUNEL ، نلاحظ موت الخلايا في خلايا البشرة فى الموقع من الحيوانات المصابة سريريًا ومقارنة موت الخلايا مع الحيوانات غير المصابة باستخدام الفحص المجهري الفلوري. من أجل تحديد كيفية تغير مستويات موت الخلايا المبرمج في البشرة على مدار مسار العدوى ، نزيل عينات من إصبع القدم كل أسبوعين على مدار 8 أسابيع ، ونستخدم اختبار caspase 3/7 مع البروتينات المستخرجة لتحديد النشاط داخل العينات. ثم نربط نشاط caspase 3/7 بحمل العدوى. يعتبر اختبار TUNEL مفيدًا في توطين موت الخلايا فى الموقع، ولكنها مكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً لكل عينة. يعتبر اختبار caspase 3/7 فعالًا لأحجام العينات الكبيرة وتجارب الدورة الزمنية. ومع ذلك ، نظرًا لأن خزعات أطراف أصابع الضفدع صغيرة ، هناك مستخلص محدود متاح لتوحيد العينة عبر طرق القياس الكمي للبروتين ، مثل اختبار برادفورد. لذلك ، نقترح تقدير مساحة سطح الجلد من خلال التحليل الفوتوغرافي لخزعات إصبع القدم لتجنب استهلاك المستخلصات أثناء توحيد العينة.

مقدمة

تعاني البرمائيات حاليًا من أكبر الخسائر في التنوع البيولوجي العالمي لأي نوع من أنواع الفقاريات 1. السبب الرئيسي لهذه الانخفاضات هو مرض جلدي مميت بالفطريات الفطرية الناجم عن مسببات الأمراض الفطرية Batrachochytrium dendrobatidis، Bd 2. يصيب العامل الممرض البشرة بشكل سطحي ، مما قد يؤدي إلى اختلال وظائف الجلد مما يؤدي إلى فقدان شديد للكهارل وسكتة قلبية وموت 3. مختلف آليات المناعة المضيفة المحتملة ضد ب قيد الدراسة حاليًا ، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات 4 و 5 والنباتات البكتيرية الجلدية 6 ومستقبلات الخلايا المناعية 7 و 8 ونشاط الخلايا الليمفاوية 9 و 10. ومع ذلك ، فإن القليل من الدراسات تستكشف ما إذا كان موت الخلايا المبرمج للبشرة وموت الخلايا هو آلية مناعية ضد هذا الممرض المميت.

قد يكون موت الخلايا ، إما من خلال موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) أو النخر (الموت غير المبرمج) ، في البشرة من أمراض ب عدوى. تشير الأبحاث السابقة إلى ذلك ب قد تؤدي العدوى إلى موت الخلايا المبرمج لأنه لوحظ حدوث اضطراب في التقاطعات داخل الخلايا عندما يتعرض إإكسبلنتس الجلد إلى طاف زوسبوري في المختبر 11 . بالإضافة إلى ذلك ، تغيرات البشرة التنكسية في ب- ضفادع مصابة تمت ملاحظتها باستخدام المجهر الإلكتروني 12 ، 13. تشير تحليلات النسخ إلى أن مسارات موت الخلايا المبرمج يتم تنظيمها في الجلد المصاب 14 ، وخلايا الطحال البرمائية تخضع لموت الخلايا المبرمج عند تعرضها ب طاف في المختبر 15 . على الرغم من الحجم المتزايد للأدلة التي تشير إلى ذلك ب يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا المضيفة في المختبر, في الجسم الحي الدراسات التي تستكشف أو تحدد آليات موت الخلايا المبرمج من خلال تطور العدوى غير متوفرة. علاوة على ذلك ، من غير المعروف ما إذا كان المضيف يستخدم موت الخلايا المبرمج كاستراتيجية مناعية دفاعية للقتال ب العدوى ، أو إذا كان موت الخلايا المبرمج من أمراض المرض.

في هذه الدراسة ، هدفنا إلى الكشف عن موت خلايا البشرة وموت الخلايا المبرمج في الحيوانات المصابة في الجسم الحي باستخدام طريقتين: فحص البروتين caspase 3/7 ، ووسم نهاية dUTP بوساطة النقل الطرفي (TUNEL) فى الموقع فحص. نظرًا لأن كل اختبار يكتشف جوانب مختلفة من موت الخلية 16 ، توفر هذه الطرق معًا فهمًا كاملاً للآليات التي ينطوي عليها موت الخلية ، وتضمن قياسًا دقيقًا للتأثير. يحدد اختبار caspase 3/7 نشاط caspases المستجيب 3 و 7 ، مما يتيح القياس الكمي لكل من مسارات موت الخلايا المبرمج الداخلية والخارجية. في المقابل ، يكتشف اختبار TUNEL تجزئة الحمض النووي ، والتي تسببها آليات موت الخلايا بما في ذلك موت الخلايا المبرمج والنخر والتشقق 17. نحن نستخدم اختبار TUNEL للتحقيق في موقع موت الخلايا داخل البشرة لكل من الحيوانات المصابة وغير المصابة سريريًا باستخدام ثلاثة أقسام مختلفة من الجلد: الظهر ، والبطن ، والفخذ Pseudophryne corroboree. تحدد هذه الطريقة الموقع التشريحي لموت الخلايا ، بالإضافة إلى تمييز موقعها داخل طبقات بشرة معينة. ثم نستخدم مقايسة caspase 3/7 لإجراء تقدير متسلسل زمني لموت الخلايا المبرمج طوال فترة الإصابة لمدة 8 أسابيع في Litoria verreauxii alpina. نحن نأخذ عينات من إصبع القدم كل أسبوعين من نفس الحيوانات ويمكننا ربط حمل عدوى مسببات الأمراض مع نشاط caspase 3/7.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

بروتوكول

وافقت جامعة جيمس كوك على أخلاقيات الحيوان في التطبيقات A1875 لـ P. coroboree و A1897 و A2171 من أجل L. v. alpina.

1. تربية الحيوان ومراقبته

  1. حيوانات المنزل بشكل فردي ، في بيئة مناسبة للأنواع ، مع جدول مناسب للمياه والتغذية والتنظيف. افحص الحيوانات يوميًا.
    1. استخدم الأفراد البالغين من الأشخاص المعرضين لخطر الانقراض Pseudophryne corroboree (لفحص TUNEL ، القسم 4) والتهديد Litoria verreauxii alpina (لمقايسة Caspase 3/7 ، القسم 5) ، تم التبرع بها من مرافق التربية الأسيرة. حافظ على الحيوانات في درجة حرارة 15-18 & # 176 درجة مئوية ، على ركيزة من الطحالب والحصى ، ورشها يوميًا بمياه التناضح العكسي ، وأطعمها 3 مرات أسبوعيًا بالصراصير المحملة بالأمعاء.
    1. قتل ببطء مع جرعة زائدة من tricaine methanesulfonate (MS222) (0.1٪ w / v MS222 إلى pH 6 - & # 1607 مع بيكربونات الصوديوم في ماء الصنبور القديم). احتفظ بالحيوانات في MS222 لمدة 10 دقائق بعد توقف كل حركاتها ولا تظهر أي استجابة للمنبهات.

    2. اختبار ب عدوى

    1. المسح ل ب
      1. امسح كل حيوان بمسحة جديدة معقمة من الرايون (مسحة واحدة لكل حيوان). استخدم طريقة المسحة التالية: خمس مرات على الخزان وخمس مرات على كل فخذ وجانب وطرف. هذا إجمالي 45 ضربة.
      2. قم بتدوير المسحة برفق أثناء وبين السكتات الدماغية لضمان الالتقاط الفعال للحمض النووي. كسر طرف المسحة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل وتخزينها في -20 & # 176 درجة مئوية حتى الاستخراج.
      1. استخرج الحمض النووي الجيني من المسحات عن طريق إضافة 50 & # 181 لترًا من كاشف استخراج الحمض النووي المتاح تجاريًا مع 30-40 مجم من حبات السيليكا 0.5 مم. فاز الخرزة على العينات في قاطع خلية حبة الخافق بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة. بعد الخطوة الخافق حبة ، أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ز لمدة 1 دقيقة.
      2. احتضان العينات في 100 & # 176 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، والسماح لتبرد. الطرد المركزي العينات في 5000 x g لمدة 3 دقائق ، ثم نقل المادة طافية إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 مل الفردية وتخزينها في -20 & # 176C حتى qPCR.
      3. استخدم PCR الكمي (qPCR) بعد Boyle وآخرون. 2004 18 لتحليل حمل العدوى. استخدم التعديلات التالية:
        1. تمييع عينات استخراج الحمض النووي 6: 100 بالماء منزوع الأيونات المزدوج. أضف 0.7 & # 181L من ألبومين المصل البقري (BSA) إلى كل بئر للمساعدة في منع تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل. قم بتشغيل كل عينة بشكل فردي. في كل لوحة ، استخدم عنصر تحكم سلبي (بدون قالب) وعناصر تحكم إيجابية مع سلسلة من معايير التخفيف لتقدير حمل zoospore (العدوى).
        1. حضاره ب
          1. تحضير مرق الثقافة بإضافة 16 جم من التربتون و 2 جم من الجيلاتين المتحلل و 4 جم من اللاكتوز (TGHL) إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف (121 & # 176 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) والسماح للمرق ليبرد.
          2. تلقيح ب عزل (في هذه الحالة ، معزول عن عزلة نيو ساوث ويلز ، AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1 ، رقم الممر 11) في مرق TGHL وينمو لمدة 7 أيام عند 23 & # 176 درجة مئوية ، ثم نقل ثقافة المرق إلى TGHL agar لوحات.
          3. لعمل أطباق ، أضف 16 جم من التربتون ، 2 جم من الجيلاتين المتحلل ، 4 جم من اللاكتوز (TGHL) ، و 10 جم من الآجار البكتيري إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف (121 & # 176 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة). بمجرد أن يبرد الخليط بما يكفي للمس ، ولكن قبل أن يتجمد ، صب أجار TGHL في ألواح استزراع بقطر 92 مم بحيث تكون 1/4 إلى 1/3 ممتلئة ، في خزانة أمان بيولوجية من الفئة الثانية.
          4. عندما يصلب الأجار ويبرد تمامًا ، قم بتلقيح كل لوحة بـ 0.5 مل من ب من مرق السائل ، وتوزع بالتساوي. السماح ب يجف خليط المرق على اللوح لمدة ساعة تقريبًا ثم يُغلق الألواح بغشاء بارافين بلاستيكي. احتضان لوحات أجار الجانب لأسفل عند 23 & # 176 درجة مئوية لمدة 5-7 د.
          1. تحقق من حركة zoospore تحت مجهر ضوئي مقلوب لضمان قابلية البقاء يوميًا قبل التلقيح. عندما يكون إطلاق zoospore مرتفعًا ، مع وجود العديد من الأبواغ الحيوانية التي تسبح خارج sporangia ، تكون الثقافة جاهزة للتلقيح.
          2. اغمر كل طبق بـ 3 مل من ماء الصنبور القديم أو ماء البركة الاصطناعية ، عن طريق سكب الماء في اللوحة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح للأبواغ الحيوانية بالإفراج عن الماء. بعد فترة الحضانة ، صب معلق zoospore في وعاء معقم جديد.
          3. تقدير تركيز zoospore باتباع تعليمات الشركة المصنعة & # 39s باستخدام مقياس الكريات الدموية. بمجرد معرفة تركيز تعليق zoospore ، قم بتخفيف المعلق إلى تركيز 1 × 10 6 zoospores لكل 3 مل مع ماء الصنبور القديم.
          1. تلقيح كل حيوان بصب 3 مل من خليط اللقاح فوق فنتر 19 في حاويات فردية سعة 50 مل. السماح بجمع اللقاح الزائد في قاعدة حاوية التلقيح. اترك كل حيوان في حاوية التلقيح الفردية لمدة 24 ساعة لضمان الإصابة ، وبعد 24 ساعة ، أعد كل فرد إلى تررم معقم.
            1. تطهير تيراريا باستخدام 13٪ حجم / حجم (حجم / حجم) محلول مبيض تجاري 20 ، اشطف مرتين على الأقل بالماء ، ثم اتركها لتجف لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
            1. القتل الرحيم للحيوانات التي تظهر علامات سريرية لداء الفطريات الفطرية ، كما هو موضح في الخطوة 1.3.1 ، وعدد متساوٍ من ب- حيوانات السيطرة السلبية.
            2. تشريح عينات الجلد (الظهرية ، البطنية ، والفخذ) من كل حيوان. إصلاح عينات الجلد لمدة 2 ساعة في 4٪ v / v فوسفات مخزنة الفورمالديهايد. يسمح وقت التثبيت القصير والمتسق بتثبيت الأنسجة بالكامل ، ولكنه يسمح أيضًا بتلطيخ الكيمياء المناعية الفعالة والدقيقة. ثم نقل إلى 80٪ من الإيثانول حتى التضمين للتقسيم.
            3. قم بتضمين الجلد في شمع البارافين للتحضير النسيجي باتباع الطرق القياسية 21. باختصار ، يكون البروتوكول كما يلي:
              1. تجفيف الأنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول ، ومسح الإيثانول بالزيلين. تضمين الأنسجة في شمع البارافين ، ووضع جميع عينات الجلد الثلاثة لكل فرد في كتلة البارافين واحدة.
              1. صبغ الشريحة الأولى بهيماتوكسيلين متبوعًا بتلوين إيوزين (H & # 38E). هذه الشريحة لتصور موقع ب sporangia داخل الجلد.
              2. قم بتلوين الشريحة الثانية بعد اختبار TUNEL المتاح تجاريًا للتحضير النسيجي واتبع تعليمات الشركة المصنعة # 39s ، الموضحة أدناه.
                1. أولاً ، ديبارافينيزي أقسام الأنسجة في جرة كوبلين بغسل الشرائح بثلاثة تغييرات من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل غسلة ، واتبع مع تغييرين من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق لكل غسلة. يتبع بغسل واحد من 95٪ إيثانول لمدة 3 دقائق ثم 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق. انتهي بغسل واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
                2. قم بمعالجة الأنسجة باستخدام إنزيم هضم البروتين المخفف حديثًا (بروتيناز K بتركيز 20 & # 956 جم / مل مخفف في PBS) ، ثم قم بإضافته مباشرة إلى الشريحة. السماح للاحتضان لمدة 15 دقيقة. يغسل مع تغييرين من برنامج تلفزيوني في جرة كوبلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
                3. اضغط على السائل الزائد وقم بإخماده في 3.0٪ بيروكسيد الهيدروجين في برنامج تلفزيوني في جرة كوبلين لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني ، لمدة خمس دقائق كل غسلة.
                4. قم بإزالة السائل الزائد ، ثم قم بتطبيق 75 & # 181L / 5 cm 2 من المخزن المؤقت للتوازن مباشرة على الأنسجة الموجودة على الشريحة. احتضان لمدة 10 ثوان. قم بإزالة السائل الزائد حول القسم وقم بتطبيق 55 & # 181L / 5 cm 2 & # 160 من إنزيم deoxynucleotidyl tranferase (TdT) العامل. احتضان في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 & # 176 درجة مئوية.
                5. بعد حضانة TdT ، ضع الشريحة في وعاء كوبلين لقوة العمل توقف / يغسل العازلة ، وحركها لمدة 15 ثانية واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشريحة بثلاثة تغييرات لبرنامج تلفزيوني لمدة دقيقة واحدة لكل غسلة. اضغط على السائل الزائد.
                6. ضعي المتقارن المضاد للديجوكسيجينين (رودامين) الذي تم تدفئته إلى درجة حرارة الغرفة على الأنسجة ، 65 & # 181 لتر / 5 سم 2. احتضان في غرفة ترطيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجنب التعرض للضوء. اغسل مع أربعة تغييرات من برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة لكل غسلة. اضغط على السائل الزائد.
                7. Finish by adding 15 µL of 0.5 - 1 µg/mL DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) in slide mounting medium to the slide, which acts as a counter stain. Then cover with a cover slip and seal with nail polish or rubber cement. Allow slides to dry in the dark as the assay is light sensitive.
                1. For the positive controls, instead of step 4.5.2.2, pre-treat the tissue with DN buffer (30mM trizma base, pH 7.2, 4mM MgCl2, 0.1mM DDT) and let incubate at room temperature for 5 minutes. Then dissolve Dnase I in DN buffer for a final concentration of 0.1ug/mL, and apply it directly to the slide. Incubate for 15 minutes at room temperature.  Then, wash the slide with 5 wash of dH2O for 3 minutes each wash. Blot off the excess liquid. Then resume TUNEL assay as directed in section 4.5.2.3.
                2. For the negative controls, do not add the terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzyme to those samples (as described in section 4.5.2.4).
                1. Take photos at random intervals along each skin section at 200X using a fluorescent microscope, using filters for both the rhodamine stain, which reveals the apoptotic cells and appears red, and DAPI which reveals all nuclei and appears blue, so that an overlay of cells can be generated. Ensure at least 100 cells are photographed per skin section per sample. Store the slides in a dark microscope box at -20 °C.
                2. Count cells (blue DAPI stained) per image. Ensure at least 100 cells are counted per skin section. To reach 100 cells, count all cells within the image. If less then 100 cells are present in one image, count another image until at least 100 cells are reached per skin section per animal.
                3. Next, count the number of TUNEL positive cells in the same images (red rhodamine stained). TUNEL positive cells, which indicate apoptosis and not necrosis or background, are single cells with clear cell edges (membranes are intact with no lysis). Sometimes the cells shrink to form apoptotic bodies.
                4. Locate the areas counted in the TUNEL assay and analyze the corresponding regions on the H&E stained histosections. Confirm that the H&E stained sections correspond to sites of ب infection, which ensures ب-infected sites are used when counting apoptotic cells in the TUNEL assay.
                1. Collect toe tips from each animal (both ب- exposed and ب- negative) once weekly through week 3 post inoculation, and fortnightly through the end of the experiment, up to 8 toes per individual.
                  1. Cut the toe tip at the second phalange with flame-sterilized scissors, and place in a 1.5 mL microtube and freeze immediately at -80 °C.
                  1. Place samples in 100 µL of sample buffer (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) with two stainless steel beads (3.2 mm) in a 1.5 mL screw cap microtube. Lyse samples by 4 cycles of 1 min bead beating at maximum speed (in the same bead beater as used in step 1.2.1) followed by 3 min on ice. After lysis, centrifuge samples at 12,000 x g and 4 °C for 5 min. Collect supernatant to use in the assay.
                  1. In a 384 well plate, mix 10 µL of protein extract with 10 µL of Bradford reagent, and incubate for 2 min at room temperature. Perform each sample in duplicate, along with a series of 5 fold BSA dilution standards. Read the absorbance at 595 nm on an absorbance plate reader.
                  1. Before extracting the proteins from the sample for the caspase assay, photograph each toe at 40X magnification using an inverted light microscope.
                  2. Analyze the toe sample using a computer imaging software, by estimating area of the toe. Do this by drawing a line around the edge of the toe clip, and have the imaging software estimate area within the shape. Then multiply that area by pi (3.14), which will approximate the surface area of the 3-dimentional skin sample (as length x cross-sectional area (pi x diameter) gives the outer surface area of a tube).
                  1. In a 384 well luminescence plate, add 10 µL of commercially available caspase 3/7 reagent and 10 µL of protein extract. Run each sample in triplicate.
                  2. Mix the reagents by shaking the plate slowly for 15 s. Incubate the plate away from light for 30 min at room temperature. Measure luminescence using a luminescent plate reader.

                  الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

                  نتائج الممثل

                  There were more TUNEL positive cells in the infected animals than in the uninfected control animals. ال فى الموقع location of TUNEL positive cells differed in infected and control animals. In control animals, there was an even distribution of TUNEL positive cells throughout the dermal and epidermal skin layers at low levels (See الشكل 1 أ), but in the infected animals, the TUNEL positive cells were more frequent in the epidermis (Figure 1B). The sites of infection (as observed on the H&E stained slides) were observed as clumped ب sporangia scattered through the thigh and ventral skin sections with none in the dorsum sections. While the TUNEL positive cells were more concentrated at and directly adjacent to sites of infected cells (Figure 1C), there was also more widespread TUNEL positive cells over the epidermis and in epidermal layers that were deeper than where ب resided. في ب infected animals there were more TUNEL positive cells in all three skin types analyzed, but a particularly high level in the thigh and venter skin (12.01 times higher (95% CI: 4.92 - 26.30) in the thigh skin and 22.31 times higher (95% CI 5.25 - 94.82) in the venter skin) (الشكل 2).

                  Over the course of infection there was a difference in caspase activity. في ب infected animals, infection intensity was positively correlated with caspase 3/7 activity (الشكل 3). There was also a difference between infected and uninfected animals through time, post inoculation. Caspase 3/7 activity decreased within the first few weeks after inoculation (with 48.36% less activity in infected animals), and then increased toward the end of week 7 (الشكل 4) في ب infected animals, but remained constant in uninfected individuals.


                  Figure 1: Terminal transferase-mediated dUTP nick end-labelling (TUNEL) in situ assay of infected and uninfected animals. أ) ب- control thigh skin section of Pseudophryne corroboree, and B) ب+ thigh skin section of P. corroboree stained by فى الموقع TUNEL assay. The blue is DAPI staining indicating nuclei of the cells, and the red is the rhodamine stain, which indicates DNA fragmentation characteristically caused by apoptosis. The yellow arrow indicates the position of the ب cluster seen in panel C. C) P. corroboree section of thigh skin stained with H&E. The H&E section is serial to panel B. There is a cluster of empty ب sporangia (arrow) and a few dark immature sporangia near the skin surface. For all three panels the epidermis is at the top of the photo. Comparing panels B and C shows that the rhodamine stained epidermal cells are concentrated around and below the cluster of ب and where skin damage is visible, such as micro-vesicle formation between basal epidermal cells. 400X magnification and the scale bar indicates 0.03 mm. مقتبس من الشكل 2 in Brannelly وآخرون. 2017 Peer J 22. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


                  Figure 2: The proportion of TUNEL positive (TUNEL+) cells per skin type. The proportion of TUNEL positive apoptotic cells per skin type in P. corroboree, with infected animals indicating animals that succumbed to disease (n = 9) and uninfected control animals (n = 10). Error bars indicate 95% confidence intervals of a proportion and * indicates a significant increase in TUNEL+ cell proportions. In the dorsal skin, the infected animals had 14.38 (95% CI 3.32 - 62.24) times more TUNEL positive cells than control animals (Odds Ratio: Z = 3.57, p ɘ.01). In the thigh skin, infected animals had 12.01 (95% CI: 4.92 - 26.30 Odds Ratio: Z = 5.46, p ɘ.01) times more TUNEL positive cells than control animals (Pearson's Chi Squared: χ 2 1 = 44.30, p ɘ.01). In the venter skin, infected animals had 22.31 (95% CI 5.25 - 94.82) times more TUNEL positive cells than control animals (Odds Ratio: Z = 4.21, p ɘ.01). مقتبس من الشكل 3 in Brannelly وآخرون. 2017 Peer J 22 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


                  Figure 3: The correlation between infection intensity, Log10(zoospore equivalents), and caspase 3/7, Log10(Caspase) of inoculated Litoria verreauxii alpina over the course of the experiment. The correlation between infection intensity and caspase activity is 0.463, and the trend line has an equation of y = (0.229)x + 0.939. مقتبس من الشكل 4 in Brannelly وآخرون. 2017 Peer J 22 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.


                  Figure 4: Caspase 3/7 activity through week 7 for each group of Litoria verreauxii alpina: ب-infected animals that succumbed to disease (n = 4) and uninfected controls (n = 8). Caspase activity is defined as the luminescence reading controlled for by protein concentration per sample and then log base 10 transformed. The caspase activity (Log10 transformed) for each group per week. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المعياري. * indicates that the infected animals differed from the uninfected controls at that week. (Linear mixed effects model: week, F4 = 11.974, p ɘ.01 week*status, F8 = 2.139, p = 0.037 Week 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0.014), Adapted from الشكل 5 in Brannelly وآخرون. 2017 Peer J 22 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

                  الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

                  مناقشة

                  We explored epidermal apoptosis and cell death as a potential mechanism of pathology of the deadly disease chytridiomycosis or a mechanism of disease resistance in ب susceptible species. We used two methods of assessing cell death in the epidermis, TUNEL assay for فى الموقع epidermal cell death analysis, and caspase 3/7 assay for monitoring epidermal cell death throughout the progress of infection. We found that cell death and apoptosis are correlated with infection load and cell death is significantly higher at the site of infection. In early infection, there is a decrease in apoptosis in the epidermis, but apoptosis increases as pathogen burden increases within the infected tissue.

                  Apoptosis in cells can be tested using numerous different approaches, each with benefits and limitations. It is important to study apoptosis and cell death using multiple assays in order to confirm findings. In this study, we explored two different assays to investigate epidermal cell death and apoptosis in frogs with chytridiomycosis. First, we trialled the TUNEL assay to assess cell death فى الموقع. This test is time consuming, and expensive per sample, and slides must be read immediately as the fluorescent signal quickly fades. Despite these limitations, the results of this فى الموقع experiment are important to further understanding the mechanisms of host-pathogen interactions. Information regarding localization can be determined using this method, and in our study apoptosis was present in high levels at the site of fungal infection and more diffusely at other sites. Additionally it must be noted that the TUNEL assay measures DNA damage, which can be caused by a number of different cell death mechanisms including apoptosis, necrosis and pyroptosis 17 . While there are signatures of apoptosis-associated cell death (such as single cells with membranes still intact, see protocol line 4.6.3, the classification relies on the interpretation of the researcher. Because the mechanism of cell death is not determined by the TUNEL assay, it is possible that another non-apoptosis cell death pathway may have caused the increase in TUNEL positive cells at morbidity of infected animals. The difference in what each assay measures might explain pattern differences in the two assays trialled here.

                  The caspase 3/7 assay can be used to quantify the effect of infection through time. However, as frog toe samples are small, there is limited sample for analysis and standardization. A common method for sample standardization is to determine the total protein concentration of each extract. As the Bradford protein quantification assay consumes sample, it is not an effective method for small extracts. In addition, we found that pigments within the frog skin precluded analysis by nano UV-Vis spectrometry. Small sample sizes also prevented standardization by dry weight. We suggest estimating skin surface area of the toe using photography, as the toe tip samples (these frogs were less than 3 g in body size) were too small to allow assays for both protein concentration and caspase concentration. We found that photographing the toes and using a skin surface area estimate is as effective as traditional protein concentration analyses.

                  In this study, we used two standard techniques for quantifying cell death and apoptosis, but adapted the methods for amphibians and small tissue samples. For the TUNEL assay, we euthanized the animal to ensure enough tissue was available for the assay, and allowed for the comparison of different skin locations. It is possible to adapt this method to smaller tissue samples, such as a toe webbing biopsy, which would not require euthanasia of the animal. Depending on the size of the animal, biopsies could allow for a time series test similar to our approach for the caspase 3/7 assay.

                  In future studies, we suggest the use of additional assays for exploring cell death and apoptosis over the course of chytridiomycosis infection because there is still much to learn of the causal mechanisms of chytridiomycosis pathogenesis. These results suggest that apoptosis and epidermal cell death may be important in the pathogenesis of ب however, more research is needed in order to determine the influence of apoptosis on disease outcomes, particularly in hosts that do not succumb to infection.

                  الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

                  الإفصاحات

                  الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

                  شكر وتقدير

                  We thank the following people who assisted with husbandry and data collection: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney, and T. Knavel and M. Merces for assistance with dissections. We would also like to thank M. McFadden, P. Harlow and Taronga Zoo for raising the L. v. alpina, and G. Marantelli for raising the P. corroboree. We thank F. Pasmans, A. Martel for advice on apoptosis assays, C. Constantine, A. Kladnik and R. Webb for assistance with TUNEL assay, and T. Emeto and W. Weßels for help with protocol and kit for caspase 3/7 assay. This manuscript and protocol is adapted from Brannelly وآخرون 2017 Peer J 22 .


                  التطبيقات

                  • LB is a rich medium, used as general-purpose bacterial culture medium especially Enterobacteriaceae members (E.coli is one among them).
                  • Lysogeny broth is also used for coliphage plaque assays.

                  Cold Spring Harbor Protocol recommends pH to be 7.0. However, depending on the application pH can be 7.0 - 8.0. Adjust the pH with 1N NaOH and 1N HCl. Although the protein/peptide component of the medium shows some degree of buffering capacity, which is not sufficient for the rapidly growing bacterial population. For general purposes, this is not an issue. However, some labs prefer to make LB in 5-10mM TRIS buffer of the desired pH.


                  7. Freezing and recovery of C. ايليجانس مخازن

                  أنواع معينة انيقة can be frozen and stored indefinitely in liquid nitrogen ( − 196 ° C) (Brenner, 1974). The keys to a successful freeze are using animals at the correct stage of development, the addition of glycerol to the freezing media, and a gradual cooling to -80 ° C. Freshly starved young larvae (L1-L2 stage) survive freezing best. Well-fed animals, adults, eggs and dauers do not survive well. It is best to use several plates of worms that have just exhausted the بكتريا قولونية OP50 lawn and that contain lots of L1-L2 animals. A 15% final volume of glycerol in the freezing solution is used. A 1 ° C decrease in temperature per minute is desirable during freezing. This can be achieved by placing the worms (in freezer vials) in a styrofoam container at -80 ° C. The styrofoam container can be either a commercial shipping box (with walls at least ¾ inch thick) or a small styrofoam box with slots for holding vials. After 12 or more hours at -80 ° C, the freezer vials should be transferred to their permanent freezer location for long term storage.

                  The CGC uses two solutions for freezing C. ايليجانس : a Liquid Freezing Solution (Brenner, 1974) and Soft Agar Freezing Solution (Leon Avery, personal communication). For long term storage of stocks in liquid nitrogen, Liquid Freezing Solution is recommended. When this solution is used, the worms settle to the bottom of the freezer vial, and no viable animals can be easily retrieved without thawing the entire contents of the vial. A Soft Agar Freezing Solution is useful for freezing working stocks of C. ايليجانس . The addition of the agar helps keep the worms suspended throughout the solution. A small scoop of the frozen contents can be taken, and the remainder can be left in the vial and returned to the freezer for later use. Vials frozen using Soft Agar Freezing Solution should be stored at -80 ° C. If kept in liquid nitrogen, the contents become too hard, and the vial will need to be warmed before it is possible to remove a scoop of the contents. The warming period reduces the number of times live worms can be recovered from the vial. When stored at -80 ° C there is no need to allow the vial to be warmed the contents are soft enough to be used right away. We recover worms 3-4 times from each vial of soft agar stock.

                  Worms can be frozen in 1.8 ml cryotubes. The CGC uses Nunc Cryotube Vials (#65234) with internal threads and freezes six vials of each strain it receives. Two vials are frozen using Soft Agar Freezing Solution and are stored at − 80 ° C for use as working stocks. Four vials are frozen using Liquid Freezing Solution one is thawed as a tester, and the other three are put in at least two different liquid nitrogen tanks. To fill strain requests, the working stocks that are kept at − 80 ° C are used. When the last vial of a stock stored at − 80 ° C is emptied, the worms are once again frozen using Soft Agar Freezing Solution in order to replace these vials. In theory, the stocks kept in liquid nitrogen will never need to be used since the soft agar stocks are continually replaced as they are depleted.

                  The recovery of C. ايليجانس from stocks stored in liquid nitrogen is in the range of 35-45% of the total number of animals frozen. This number decreases only slightly after many years of storage in liquid nitrogen. The recovery of stocks stored at − 80 ° C for many years ( > 10) is not as high as liquid nitrogen, but worms can be safely stored this way for many years (CGC, unpublished data). Of course, a power failure can result in the loss of all stocks kept at − 80 ° C, so it is very wise to keep at least one copy of all stocks in liquid nitrogen. Some mutants strains (especially certain Dpy mutants) do not survive freezing as well as wild-type animals.

                  Protocol 7. Freezing C. ايليجانس using Liquid Freezing Solution

                  S Buffer [129 ml 0.05 M K2HPO4, 871 ml 0.05 M KH2ص4, 5.85 g NaCl]


                  شاهد الفيديو: خطوات رسم الخلية بدائية النواة. بكتريا (ديسمبر 2022).