معلومة

19.3: فحوصات فوق الجينوم - علم الأحياء

19.3: فحوصات فوق الجينوم - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ChIP: طريقة لتحديد مكان ارتباط البروتينات بالحمض النووي أو مكان تعديل الهستونات

نظرًا لأهمية المعلومات اللاجينومية في علم الأحياء ، فقد تم بذل جهود كبيرة لدراسة الإشارات التي تحدد مقدار هذه المعلومات. يتم وصف إجراءات ChIP على النحو التالي وهي موضحة في الشكل 19.2:

  1. تتعرض الخلايا لعامل ربط متقاطع مثل الفورمالديهايد ، مما يتسبب في تكوين روابط تساهمية بين الحمض النووي والبروتينات المرتبطة به (على سبيل المثال ، الهستونات مع تعديلات محددة).
  2. يتم عزل الحمض النووي الجيني من نواة الخلية.
  3. يتم تقطيع الحمض النووي المعزول عن طريق الصوتنة أو الإنزيمات.
  4. تنمو الأجسام المضادة للتعرف على بروتين معين ، مثل تلك التي تشارك في تعديل الهيستون. تنمو الأجسام المضادة عن طريق تعريض البروتينات المهمة للثدييات ، مثل الماعز أو الجرذان ، التي تؤدي استجابتها المناعية بعد ذلك إلى إنتاج الأجسام المضادة المطلوبة.
  5. تضاف الأجسام المضادة إلى المحلول للترسيب المناعي وتنقية المجمعات.
  6. يتم عكس الارتباط المتبادل بين البروتين والحمض النووي ويتم تنقية شظايا الحمض النووي الخاصة بالعلامات اللاجينية.

بعد تجربة ChIP ، لدينا تسلسلات قصيرة من الحمض النووي تتوافق مع الأماكن التي ارتبطت فيها الهستونات بالحمض النووي. لتحديد موقع شظايا الحمض النووي في الجينوم ، يمكن تهجينها إلى أجزاء معروفة من الحمض النووي على صفيف أو شريحة جينية وتصورها بعلامات الفلورسنت ؛ تُعرف هذه الطريقة باسم رقاقة ChIP. بدلاً من ذلك ، يمكن للمرء أن يفعل تسلسلًا ضخمًا موازيًا من الجيل التالي لهذه الأجزاء ؛ يُعرف هذا بـ ChIP-seq. النهج الأخير ، ChIP-seq ، هو نهج أحدث يتم استخدامه بشكل متكرر. إنه مفضل لأنه يحتوي على نطاق ديناميكي أوسع للكشف ويتجنب مشاكل مثل التهجين المتقاطع في رقاقة ChIP.

يبلغ طول كل علامة تسلسل 30 زوجًا أساسيًا. يتم تعيين هذه العلامات إلى مواقع فريدة في الجينوم المرجعي المكون من 3 مليارات قاعدة. يعتمد عدد القراءات على عمق التسلسل ، ولكن عادةً ما يكون هناك ما يقرب من 10 ملايين قراءة معينة لكل تجربة ChIP-seq.

هناك خط أنابيب قياسي إلى حد ما يستخدم لاستنتاج إثراء البروتين محل الاهتمام في كل موقع في الجينوم بالنظر إلى مجموعة من قراءات التسلسل القصيرة من تجربة ChIP-seq. أولاً ، يجب تعيين شظايا الحمض النووي إلى الحمض النووي (يسمى قراءة الخرائط). بعد ذلك ، يجب علينا تحديد مناطق الجينوم التي لديها إثراء إحصائي مهم للبروتين محل الاهتمام (يسمى ذروة الاتصال). بعد خطوات المعالجة المسبقة هذه ، يمكننا بناء نماذج مختلفة خاضعة للإشراف وغير خاضعة للإشراف لدراسة حالات الكروماتين وعلاقتها بالوظيفة البيولوجية. نحن ننظر في كل خطوة من هذه الخطوات على حدة.

تسلسل بيسلفيت: طريقة لتحديد مكان ميثلة الحمض النووي

مثيلة الدنا هي أول تعديل فوق جيني يتم اكتشافه وهو منظم ترانثي مهم من حيث أن مثيلة مخلفات السيتوزين في ثنائي النوكليوتيدات CpG تؤدي إلى "إسكات" أو قمع النسخ. تسلسل بيسلفيت هو طريقة يتم من خلالها معالجة الحمض النووي مع بيسلفيت قبل التسلسل ، مما يسمح بالتحديد الدقيق للنيوكليوتيدات التي تم فيها ميثلة الحمض النووي. تحول معالجة بيسلفيت بقايا السيتوزين غير الميثيل إلى اليوراسيل ، ولكنها لا تؤثر على السيتوزين الميثلي. وهكذا ، يمكن تسلسل الحمض النووي الجيني مع أو بدون معالجة بيسلفيت ، ويمكن مقارنة التسلسلات والمواقع التي لم يتم فيها تحويل السيتوزين إلى اليوراسيل في الحمض النووي المعالج (أو ، على نحو متكافئ ، المواقع التي يوجد فيها ثنائي كبريتات- الفرق المتولد بين التسلسل المعالج وغير المعالج) هي المواقع التي تم فيها ميثلة السيتوزين. يفترض هذا التحليل التحويل الكامل لبقايا السيتوزين غير الميثيل إلى اليوراسيل ، لذلك يمكن أن يؤدي التحويل غير الكامل إلى نتائج إيجابية خاطئة (أي النيوكليوتيدات التي تم تحديدها على أنها ميثلة ولكنها في الواقع لم تتم ميثيلها) [11].


شاهد الفيديو: الحمض النووي DNA: كتابك - جو هانسون (شهر فبراير 2023).