معلومة

متى يتوقف نوكلياز Cas9؟

متى يتوقف نوكلياز Cas9؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا فهمت بشكل صحيح ، فإن خطوات تحرير الجينات باستخدام CRISPR-Cas9 هي تقريبًا كما يلي

  • نوكلياز Cas9 ودليل الحمض النووي الريبي يشكلان معقدًا.
  • يقوم مجمع Cas9 + guide RNA بمسح الحمض النووي الجيني ويتعرف على التسلسلات المتماثلة مع الدليل RNA
  • يحث على كسر حبلا مزدوج في الحمض النووي في بداية تسلسل PAM (ينكسر فقط عندما يكون التسلسل المتماثل للدليل RNA بالقرب من PAM).
  • التعديل الوراثي باستخدام آلية إصلاح الحمض النووي (NHEJ ، HDR) بعد كسر الخيط المزدوج.

إذا كان الأمر كذلك ، في تحرير الجينات باستخدام CRISPR-Cas9 ، فمن المرجح أن يستمر تحرير الجينات طالما أن Cas9 لا يفقد نشاطه ، فهل أنا على حق؟

سؤالي

  • متى يفقد كاس نشاطه؟
  • ما هو منطق التجربة الذي حدد التوقيت؟ / إذا كانت المسألة نفسها غير مستكشفة ، فما نوع التجارب التي يمكن إجراؤها لمعرفة التوقيت عندما يفقد كاس نشاطه؟

كما يوضح هذا الفيلم ، إذا حدث التحرير الجيني بنجاح ، فسوف يحدث بالفعل طفرة في الجين المستهدف.

ومع ذلك ، حتى لو كان الأمر كذلك ، - هذا مجرد تخميني من الآن فصاعدًا - فمن المحتمل أن يظل مكملاً للجين المستهدف ، على الأقل في بداية مسار الدليل RNA. ومع ذلك ، حتى لو تم تحور الجين المستهدف ، من المحتمل أن يظل هناك تسلسل مكمل للدليل RNA، على الأقل المنبع للطفرة. لذا ، حتى لو تم إكمال تعديل جيني واحد ناجح ، أعتقد أنه من الممكن أن يحدث التعديل الجيني مرة أخرى في نفس الموقع. علاوة على ذلك ، حتى إذا تم تحرير الموقع المستهدف بنجاح ، فلا تزال هناك إمكانية للتحرير اللاحق خارج الهدف في مكان آخر. لهذا السبب أعتقد أن الأدوات موجودة لإيقاف ابراكسيا عند الأطفال.


يرتبط الحمض النووي الريبي الإرشادي بالجين المستهدف الذي تم عضه بواسطة ابراكسيا عند الأطفال. الخيط المقابل للخيط الذي ارتبط به الدليل RNA قد انشق للتو. مقتبس من هذا الفيديو.

فكرة لتجربة لاكتشاف متى تصبح تعذر الأداء النطقي لدى الأطفال إذا تم إنشاء مستعمرة خلية واحدة من مجموعة سكانية تم تعديلها جينيًا وكان هناك تباين جيني في الخلايا المولودة من تلك المستعمرة ، فأعتقد أن هذا يعني أنه كان من الممكن أن يكون هناك نشاط Cas9 حتى بعد أن بدأت مستعمرة الخلية المفردة في الثقافة. هل هذه الفكرة صحيحة؟ هل يمكن أن تكون هناك تجربة أكثر ذكاءً؟


فيما يتعلق بفقدان نشاط Cas9 ، فأنت تتطرق بالفعل إلى الإجابة في سؤالك. Cas9 باعتباره نوكليازًا / إنزيمًا نشطًا دائمًا ، وسيستمر في شق الحمض النووي المزدوج الشريطة طالما أن هناك مواقع مستهدفة تكميلية وتوجيه الحمض النووي الريبي لتوجيهه هناك. إذا كان الموقع الهدف هو ليس متحورًا أو تمت إزالته تمامًا بعد الانقسام ، يمكن لـ Cas9 بالفعل شق نفس الموقع مرة أخرى.

ومع ذلك ، حتى إذا تم تحور الجين المستهدف ، فمن المحتمل أن يظل هناك تسلسل مكمل للدليل RNA ، على الأقل في بداية الطفرة.

لست متأكدًا مما إذا كنت قد أسأت فهم النقطة التي تحاول إيضاحها هنا ، ولكن إدخال الطفرات هو كذلك عادة بما يكفي لمنع الانقسام المتكرر لنفس الموقع (على الرغم من أن دراسات التأثيرات غير المستهدفة تظهر بوضوح أن هذا ليس هو الحال دائمًا):

على حد سواء الأبراج العقدية و المكورات العنقودية الذهبية يقوم Cas9 بشق المواقع المستهدفة بين الموضعين -3 و -4 ، مع العد من نهاية تسلسل الدليل 20-nt (انظر الشكل المرفق أدناه). يمكن بعد ذلك إصلاح الكسر المزدوج الذي تقطعت به السبل إما عن طريق ربط طرف غير متماثل (NHEJ) ، أو عبر إعادة تركيب متماثل مدفوعة بالقالب (HR).

في الحالة السابقة (NHEJ) ، تكون الفواصل المزدوجة بعض الأحيان تم إصلاحه بأخطاء صغيرة. هذه الأخطاء عادة تتراكم بالقرب من موقع الاستراحة (اقرأ عن NHEJ لفهم السبب) ، وستدمر مثل هذه الطفرات موقع التعرف على جرنا. لاحظ ، مع ذلك ، أن ليس كل شيء (في الواقع ، عدد قليل جدًا) ستؤدي أحداث إصلاح NHEJ إلى ظهور طفرات ، ويمكن إعادة شق الفواصل "التي تم إصلاحها تمامًا" بواسطة Cas9. ولكن نظرًا لأن الانقسام المتكرر مميت للخلية ، فهناك ميزة انتقائية للطفرات التي تمنع إعادة انقسام الموقع المستهدف. لاحظ أيضًا أن إدخال الطفرات (وبالتالي تحرير الجينات) عبر NHEJ هو عملية عشوائية ، بدون تحكم مباشر من قبل الباحث.

في الحالة الأخيرة (HR) ، يمكن للباحث اختيار قالب الحمض النووي المستخدم لإصلاح الكسر المزدوج الشريطة. يمكن أن يكون على سبيل المثال عبارة عن جزء من الحمض النووي المركب كيميائيًا أو منتج PCR مع بعض التماثل المتسلسل على الأقل للمناطق المحيطة بموقع الانقسام. ولكن نظرًا لعدم وجود متطلبات تسلسل محدد للمنطقة ما بين أثنين مناطق التماثل ، يمكن تصميم منطقة التباعد هذه بحيث تستبدل جزئيًا أو كليًا التعرف الأصلي و / أو تسلسل PAM (المنطقة البنفسجية في الشكل أدناه).


نوكلياز ميت Cas9

نشر في الأول من أبريل 2021 بواسطة الدكتور فرانسيس كولينز

الائتمان: iStock / Firstsignal

أظهر التحرير الجيني وعدًا كبيرًا كطريقة غير وراثية لعلاج مجموعة واسعة من الحالات ، بما في ذلك العديد من الأمراض الوراثية ومؤخراً ، حتى COVID-19. ولكن هل يمكن لنسخة من أداة تعديل الجينات كريسبر أن تساعد أيضًا في تخفيف الآلام على المدى الطويل دون التعرض لخطر الإدمان المرتبط بالعقاقير الأفيونية الموصوفة؟

في عمل نشر مؤخرا في المجلة علوم الطب الانتقاليأوضح الباحثون في الفئران أنه يمكن استخدام نسخة معدلة من نظام كريسبر "لإيقاف" جين في الخلايا العصبية الحرجة لمنع انتقال إشارات الألم [1]. في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة ولا يزال النهج بعيدًا عن الاختبار على الأشخاص ، تشير النتائج إلى أن هذه الاستراتيجية الجديدة القائمة على كريسبر يمكن أن تشكل الأساس لطريقة جديدة تمامًا لإدارة الألم المزمن.

حدث هذا النهج الجديد في علاج الألم المزمن لآنا مورينو ، مؤلف الدراسة الأول ، عندما كانت حاصلة على درجة الدكتوراه. طالب في مختبر Prashant Mali المدعوم من المعاهد الوطنية للصحة بجامعة كاليفورنيا في سان دييغو. كانت مالي تدرس مجموعة واسعة من العلاجات الجديدة القائمة على الجينات والخلية. أثناء القراءة على كليهما ، هبط مورينو على ورقة حول طفرة في الجين الذي يشفر بروتينًا يعزز الألم في الخلايا العصبية الشوكية يسمى NaV1.7.

قرأ مورينو أن الأطفال الذين يولدون بطفرة فقدان الوظيفة في هذا الجين يعانون من حالة نادرة تُعرف باسم الحساسية الخلقية للألم (CIP). إنهم حرفيا لا يشعرون بالألم ولا يستجيبون له. على الرغم من أن هؤلاء الأطفال غالبًا ما يفشلون في التعرف على الإصابات الخطيرة بسبب عدم وجود الألم لتنبيههم ، إلا أنه ليس لديهم آثار جسدية أخرى ملحوظة للحالة.

بالنسبة لمورينو ، تم النقر على شيء ما. ماذا لو كان من الممكن تصميم نوع جديد من العلاج - نوع مصمم لخفض هذا الجين أو إيقافه تمامًا ومنع الناس من الشعور بالألم المزمن؟

كان لدى مورينو أيضًا فكرة حول كيفية القيام بذلك. كانت تعمل على قمع أو "إيقاف" الجينات باستخدام نسخة من CRISPR تُعرف باسم & # 8220dead & # 8221 Cas9 [2]. في أنظمة كريسبر المصممة لتحرير الحمض النووي ، غالبًا ما يتم تشبيه إنزيم كاس 9 بمقص. وتتمثل مهمتها في قطع الحمض النووي في المكان المناسب تمامًا بمساعدة دليل RNA. ومع ذلك ، لم يعد Cas9 الميت بتقنية CRISPR لديه أي قدرة على قطع الحمض النووي. إنه ببساطة يلتصق بهدفه الجيني ويمنع تعبيره. ميزة أخرى هي أن النظام لن يؤدي إلى أي تغييرات دائمة في الحمض النووي ، لأن أي علاج يعتمد على CRISPR-dead Cas9 قد يتم عكسه بأمان.

بعد التأكد من أن هذه التقنية تعمل في الخلايا ، انتقل مورينو وزملاؤه إلى الدراسات التي أجريت على فئران التجارب. قاموا بحقن نواقل فيروسية تحمل علاج كريسبر في الفئران التي تعاني من أنواع مختلفة من الألم المزمن ، بما في ذلك الألم الالتهابي والناجم عن العلاج الكيميائي.

قرر مورينو وزملاؤه أن جميع الفئران أظهرت أدلة على تخفيف الآلام بشكل دائم. من اللافت للنظر أن العلاج استمر أيضًا لمدة ثلاثة أشهر أو أكثر ، والأهم من ذلك ، دون أي علامات لأعراض جانبية. يستكشف الباحثون أيضًا طريقة أخرى لفعل الشيء نفسه باستخدام مجموعة مختلفة من أدوات التحرير تسمى نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs).

يقول الباحثون إن أحد هذه الأساليب قد يعمل يومًا ما للأشخاص الذين يعانون من عدد كبير من حالات الألم المزمن التي تنطوي على انتقال إشارة الألم عبر NaV1.7. ويشمل ذلك اعتلال الأعصاب السكري وعرق النسا وهشاشة العظام. كما يمكن أن يوفر الراحة للمرضى الذين يخضعون للعلاج الكيميائي ، إلى جانب أولئك الذين يعانون من العديد من الحالات الأخرى. شارك مورينو ومالي في تأسيس شركة سبينوف Navega Therapeutics ، سان دييجو ، كاليفورنيا ، للعمل على الخطوات قبل السريرية اللازمة للمساعدة في نقل نهجهم إلى العيادة.

الألم المزمن مشكلة صحية عامة مدمرة. في حين أن المواد الأفيونية فعالة في علاج الآلام الحادة ، فإنها يمكن أن تضر أكثر مما تنفع للعديد من حالات الألم المزمن ، كما أنها مسؤولة عن أزمة وطنية من الإدمان والوفيات الناجمة عن جرعات زائدة من المخدرات [3]. لا يمكننا حل أي من هذه المشاكل دون إيجاد طرق جديدة لعلاج الألم المزمن. بينما نتطلع إلى المستقبل ، من المأمول أن تساعد العلاجات الجديدة المبتكرة مثل نظام تعديل الجينات هذا يومًا ما في تحقيق الراحة التي تشتد الحاجة إليها.

[1] تسكين طويل الأمد عن طريق القمع المستهدف في الموقع لـ NaV1.7 في الفئران. Moreno AM، Alemán F، Catroli GF، Hunt M، Hu M، Dailamy A، Pla A، Woller SA، Palmer N، Parekh U، McDonald D، Roberts AJ، Goodwill V، Dryden I، Hevner RF، Delay L، Gonçalves Dos Santos G، Yaksh TL، Mali P. Sci Transl Med. 2021 مارس 1013 (584): eaay9056.

[2] Nuclease dead Cas9 هو حاجز قابل للبرمجة لتكرار الحمض النووي. Whinn KS، Kaur G، Lewis JS، Schauer GD، Mueller SH، Jergic S، Maynard H، Gan ZY، Naganbabu M، Bruchez MP، O & # 8217Donnell ME، Dixon NE، van Oijen AM، Ghodke H. Sci Rep. 2019 سبتمبر 169 (1): 13292.

[3] الوفيات بسبب الجرعات الزائدة من المخدرات. مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

الحساسية الخلقية للألم (المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية / المعاهد الوطنية للصحة)

المواد الأفيونية (المعهد الوطني لتعاطي المخدرات / المعاهد الوطنية للصحة)

معمل مالي (جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو)

دعم المعاهد الوطنية للصحة: ​​المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشري المعهد الوطني للسرطان المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية


ربط الحمض النووي والانشقاق

تستخدم أنظمة CRISPR / Cas9 دليل RNA مع منطقة مكملة للحمض النووي المستهدف لربط تسلسلها المستهدف على وجه التحديد. ومع ذلك ، هناك مشكلة فورية ومتأصلة في هذا. من أجل تحقيق الخصوصية ، تعد RNAs الموجهة الأطول مفيدة ، حيث يزيد كل نوكليوتيد في دليل RNA من خصوصية النيوكلياز بنحو 4 أضعاف. ومع ذلك ، من أجل ذوبان الحمض النووي واستيعاب الاقتران الأساسي مع دليل الحمض النووي الريبي ، كلما كان دليل الحمض النووي الريبي أطول ، كان نوكلياز أقل كفاءة. كيف يمكن لأنظمة CRISPR / Cas9 أن تتمتع بمثل هذه الخصوصية المتزايدة بشكل كبير على نوكليازات أخرى مثل TALENS و ZFNS وما زالت تحافظ تقريبًا على نفس الكفاءة ، إن لم تكن أفضل؟ (مالي وآخرون 2013)

الإجابة هي أن نظام CRISPR / Cas9 يستخدم ربط Protospacer Adjacent Motif (PAM) كخطوة أولية في تحديد التسلسل المستهدف. كما تم تحديده بواسطة الفحص المجهري لجزيء واحد ، فإن الارتباط الأولي لتسلسل Cas9 إلى PAM (N-G-G) يسمح للإنزيم بفحص التسلسلات المستهدفة المحتملة بسرعة. سينفصل الإنزيم بسرعة عن الحمض النووي الذي لا يحتوي على تسلسل PAM المناسب. إذا وجد البروتين هدفًا محتملًا باستخدام PAM المناسب ، فسوف يقوم بإذابة الحمض النووي المتبقي على الهدف لاختبار ما إذا كان تسلسل الهدف المتبقي مكملًا لتسلسله الإرشادي. تسمح خطوة ربط PAM للبروتين بفحص الأهداف المحتملة بسرعة وتجنب ذوبان العديد من التسلسلات غير المستهدفة في بحثه عن تسلسلات مكملة تمامًا ليتم قطعها. (ستيرنبرغ وآخرون 2014)

في يوليو 2014 ، أندرس وآخرون. نشر بنية بلورية أدت إلى نموذج لربط الحمض النووي المستهدف المعتمد على PAM ، وفكه ، والتعرف عليه بواسطة نوكلياز Cas9. يتم إنشاء الصور التالية بناءً على الشكل 4 من الورقة ، أو هي صور تم تقديمها في Pymol (وزعتها Schrödinger) باستخدام البنية البلورية من تلك الورقة (تم الحصول عليها من بنك بيانات البروتين).

نموذج مقترح لربط الحمض النووي المستهدف المعتمد على PAM والذوبان والتعرف عليه بواسطة Cas9:

الشكل 2: ربط Pam Binding و Phosphate Lock Loop Binding (الصورة الأصلية) (صورة بلورية مأخوذة من PDB: 4UN3 Anders et al. 2014.)

تظهر قواعد NGG لـ Protospacer Adjacent Motif (PAM) لشريط الحمض النووي المستهدف باللون الأصفر. ترتبط بقايا الأرجينين 1333 و 1335 من مجال تفاعل PAM (PI) بالأخدود الرئيسي لقواعد الجوانين في PAM. بقايا ليسين في حلقة قفل الفوسفات ، أيضًا في مجال PI ، تربط الأخدود الصغير.

يؤدي هذا إلى وضع PAM والحمض النووي المستهدف مثل السيرين 1109 في حلقة قفل الفوسفات واثنين من النيتروجين في العمود الفقري لحلقة قفل الفوسفات ، ويمكنهما تكوين روابط هيدروجينية للفوسفات في الموضع +1 من PAM. يعمل هذا على استقرار الحمض النووي المستهدف بحيث يمكن للقواعد الأولى من التسلسل المستهدف (أو البروتوسفاسر) أن تذوب وتدور لأعلى باتجاه RNA التوجيهي.

الشكل 3: حلقة ربط الفوسفات وفك DNA (الصورة الأصلية) (صورة بلورية مأخوذة من PDB: 4UN3 Anders et al. 2014)

إذا كان الحمض النووي المستهدف مكملاً لخيط RNA التوجيهي ، فإن الخيطين سوف يقومان بزوج أساسي. سيسمح هذا للحمض النووي المستهدف بفك ضغطه ، حيث تنقلب القواعد وتربط دليل الحمض النووي الريبي. بدون ربط PAM الأولي وتثبيت فوسفات +1 ، نادرًا ما يكون دليل الحمض النووي الريبي قادرًا على ربط الحمض النووي المستهدف ، وسيكون Cas9 غير فعال للغاية. يوضح هذا آلية تشرح سبب قدرة Cas9 على التمتع بكفاءة عالية وخصوصية عالية ، مما يجعلها أداة قوية لتحرير الجينوم.

الشكل 4: التعرف على الحمض النووي والانقسام (الصورة الأصلية) (الصورة البلورية المقدمة من PDB: 4UN3 Anders et al. 2014.)

أخيرًا ، التلدين الكامل للدليل RNA للحمض النووي المستهدف يسمح لنوكلياز HNH و RuvC بشق خيوطها الخاصة. تنقسم هذه النيوكليزات بشكل محدد للغاية بين النيوكليوتيدات الثالثة والرابعة من PAM. مرة أخرى ، فإن خصوصية الانقسام هذه ، بالإضافة إلى حقيقة أن النيوكليزات الفردية قد تتغير بشكل مستقل ودون التأثير على قدرة Cas9 على ربط تسلسلات معينة ، تجعل نظام CRISPR / Cas9 أداة تحرير جينوم قوية ومرنة في نفس الوقت.


محتويات

في الجينوم البكتيري ، تحتوي مواضع كريسبر على "فواصل" (دنا فيروسي يتم إدخاله في موضع كريسبر) تم إنشاؤه في النوع الثاني من أنظمة المناعة التكيفية من غزو الحمض النووي الفيروسي أو البلازميد (تسمى "الفواصل الأولية"). عند الغزو اللاحق ، يرتبط نوكلياز مرتبط بـ CRISPR مثل Cas9 بمركب tracrRNA-crRNA ، والذي يوجه Cas9 إلى تسلسل protospacer الغازي. لكن Cas9 لن يشق تسلسل protospacer ما لم يكن هناك تسلسل PAM مجاور. لن يحتوي الفاصل في مواضع CRISPR البكتيرية على تسلسل PAM ، وبالتالي لن يتم قطعه بواسطة نوكلياز ، لكن الفاصل الأولي في الفيروس أو البلازميد الغازي سيحتوي على تسلسل PAM ، وبالتالي سيتم شق بواسطة نوكلياز Cas9. [4] في تطبيقات تحرير الجينوم ، يتم تصنيع قليل النوكليوتيد القصير المعروف باسم دليل الحمض النووي الريبي (جرنا) لأداء وظيفة مركب tracrRNA-crRNA في التعرف على التسلسلات الجينية التي لها تسلسل PAM في النهاية 3 ، وبالتالي "توجيه" نوكلياز إلى تسلسل محدد يستطيع نوكلياز قطعه. [7] [8]

إن PAM المتعارف عليه هو التسلسل 5'-NGG-3 '، حيث "N" هي أي قاعدة نووية متبوعة بقاعدتين نوويتين غوانين ("G"). [9] يمكن لـ RNAs التوجيه نقل Cas9 إلى أي موضع في الجينوم لتحرير الجينات ، ولكن لا يمكن إجراء أي تعديل في أي موقع آخر غير الموقع الذي يتعرف فيه Cas9 على PAM. يرتبط PAM الكنسي مع نوكلياز Cas9 لـ الأبراج العقدية (المعينة SpCas9) ، في حين ترتبط PAMs المختلفة ببروتينات Cas9 للبكتيريا النيسرية السحائية, اللولبية اللولبية، و العقدية الحرارية. [10] 5'-NGA-3 'يمكن أن يكون PAM غير متعارف عليه عالي الكفاءة للخلايا البشرية ، لكن الكفاءة تختلف باختلاف موقع الجينوم. [11] بذلت محاولات لهندسة Cas9s للتعرف على PAMs المختلفة من أجل تحسين قدرة CRISPR-Cas9 على تحرير الجينات في أي موقع جينوم مرغوب. [12]

Cas9 من فرانسيسيلا نوفيسيدا يتعرف على تسلسل PAM الكنسي 5'-NGG-3 '، ولكن تم تصميمه للتعرف على 5'-YG-3' (حيث "Y" عبارة عن بيريميدين [13]) ، وبالتالي إضافة نطاق أهداف Cas9 المحتملة. [14] نوكلياز Cpf1 لـ فرانسيسيلا نوفيسيدا يتعرف على PAM 5'-TTTN-3 '[15] أو 5'-YTN-3'. [16]

بصرف النظر عن CRISPR-Cas9 و CRISPR-Cpf1 ، هناك بلا شك العديد من نوكليازات و PAMs غير المكتشفة حتى الآن. [17]

كريسبر / Cas13a (C2c2 سابقًا [18]) من البكتيريا ليبتوتريشيا شاهي هو نظام CRISPR موجه من RNA يستهدف التسلسلات في RNA بدلاً من DNA. PAM ليست ذات صلة بـ CRISPR التي تستهدف الحمض النووي الريبي ، على الرغم من أن الجوانين الذي يحيط بالهدف يؤثر سلبًا على الفعالية ، وقد تم تعيينه على أنه "موقع مرافقة لـ protospacer" (PFS). [19]

تم ابتكار تقنية تسمى GUIDE-Seq لفحص الانقسامات غير المستهدفة الناتجة عن التحرير الجيني. [20] يمكن استغلال متطلبات PAM لاستهداف الطفرات غير المتجانسة أحادية النوكليوتيد على وجه التحديد مع عدم ممارسة أي تأثيرات شاذة على الأليلات من النوع البري. [21]


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


تحويل وإثراء وعرض وتنشر - باستخدام GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kit. يوفر نظام CRISPR Nuclease نظامًا متجهًا للتعبير جاهزًا للاستخدام الكل في واحد مع كاسيت تعبير nuclease Cas9 ودليل استنساخ RNA لاستنساخ سريع لـ crRNA محدد الهدف. يسمح لك هذا النظام بتحرير وهندسة الموقع الجيني الذي تختاره بطريقة محددة التسلسل من بلازميد واحد. بعد تحديد الأهداف ذات الصلة باستخدام GeneArt CRISPRs ، يمكن التحقق من صحة الطفرات ذات الصلة بيولوجيًا باستخدام GeneArt TALs لتقليل الاستهداف المحتمل.

مجموعات ناقلات نوكلياز GeneArt CRISPR هي أنظمة متجهية للمراسل للتعبير عن المكونات الوظيفية اللازمة لتحرير جينوم CRISPR-Cas. تجعل المجموعات من السهل التعبير عن الحمض النووي الريبي المرشد غير المشفر (بما في ذلك crRNA و tracrRNA) ، باستخدام ناقل بلازميد يعبر أيضًا عن نوكلياز Cas9 الداخلي.

ناقل نوكلياز GeneArt CRISPR مع OFP (بروتين الفلورسنت البرتقالي) من أجل الفرز القائم على قياس التدفق الخلوي لمجموعات الخلايا التي تعبر عن crRNA ، بينما يتيح GeneArt CRISPR Nuclease Vector مع CD4 الإثراء القائم على حبة للخلايا التي تعبر عن الرنا الريباسي.

نواقل نوكلياز GeneArt CRISPR. (أ) نوكلياز GeneArt CRISPR: خريطة البلازميد مراسل OFP وميزات Nuclease GeneArt CRISPR: OFP Reporter. يتم توفير المتجه خطيًا بين النيوكليوتيدات 6،732 و 6،752 ، مع 5 نقاط أساس 5 متدلية على كل حبلا كما هو محدد. (ب) نوكلياز GeneArt CRISPR: خريطة Plasmid لتخصيب CD4 وميزات نوكلياز GeneArt CRISPR: تخصيب CD4. يتم توفير المتجه خطيًا بين النيوكليوتيدات 7،336 و 7،355 ، مع 5 نقاط أساس 5 درجات متدلية على كل حبلا كما هو محدد. توفر متجهات نوكلياز GeneArt CRISPR الخطية طريقة سريعة وفعالة لاستنساخ أليغنوكليوتيدات مزدوجة الشريطة ترميز كرنا يمثل هدفًا مرغوبًا في كاسيت تعبير يسمح باستهداف تسلسل محدد من نوكلياز Cas9.

منتجات ذات صله

محاولة أطقم Invitrogen TrueTag Donor DNA يمكن أن تساعدك في الحصول على ما يصل إلى 100٪ من الخلايا المطروحة باستخدام قوالب الحمض النووي للمانحين المصممة مسبقًا والتي تم التحقق من صحتها.

هل تبحث عن حلولنا المتميزة لتحرير الجينوم؟

يتعلم أكثر

بمجرد استنساخ شظايا الحمض النووي لمكونات نظام CRISPR-Cas9 ، يمكن نشر المتجه داخل بكتريا قولونية الخلايا لتوليد كميات كافية من التعبير الخاص بك البلازميد. نحن نقدم مجموعة متنوعة من الأكفاء بكتريا قولونية الخلايا ، التي يعتمد اختيارها على طريقة التحويل ، وإنتاجية تجربتك.

هناك طرق مختلفة للتحقق من صحة بناء البلازميد الخاص بك ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو الهضم المقيد أو التسلسل. يعتمد الاختيار على ما إذا كنت مهتمًا بتحديد ما إذا كان البلازميد يحتوي على إدراج الحمض النووي الخاص بك ، أم أنه الإدخال في الاتجاه الصحيح ، أم أن الإدخال يحتوي على التسلسل الصحيح. نحن نقدم أدوات البيولوجيا الجزيئية لتنفيذ أي طريقة تحليل قد تختارها.


الاجابة

تطور نظام كريسبر كنظام مناعي بدائي النواة تكيفي. يستخدم نظام كريسبر نوكلياز داخلي موجه من الحمض النووي الريبي ، Cas9 ، القادر على إجراء عمليات قطع خاصة بالموقع في تسلسلات الحمض النووي التي تطابق التسلسلات الفريدة الموجودة بين التكرارات المتناظرة في مصفوفة كريسبر. في الطبيعة ، يستخدم نظام كريسبر نوكلياز Cas9 الداخلي لتدمير الحمض النووي من الكيانات الغازية ، مثل العاثية.

يمكن أيضًا للكائنات التي تستخدم تقنية كريسبر التقاط الحمض النووي الجديد من الأنواع الغازية ودمجه في مجموعة كريسبر الحالية. تسمح هذه القدرة على دمج الحمض النووي الجديد للكائنات الحية بالدفاع ضد العدوى المستقبلية التي تؤوي التسلسل المدمج حديثًا ، ولكنها تتطلب أيضًا أن يكون بروتين Cas9 قابلاً للتكيف مع عدد لا يحصى من تسلسل الحمض النووي المستهدف. استغل الباحثون قابلية التكيف لنظام كريسبر لإنشاء نوكلياز قابل للبرمجة يمكنه قطع تسلسل الحمض النووي بخصوصية وكفاءة لا مثيل لها.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Cas9 تنوعًا كبيرًا. يمكنها بشكل فعال وعلى وجه التحديد قطع ، وتقطيع ، وربط التسلسلات الجينية في بدائيات النوى ، وحقيقيات النوى ، والثدييات ، وحتى في الخلايا والأجنة البشرية. مهد هذا التنوع الطريق لعدد كبير من التطورات الجديدة في الهندسة الجينومية والتحكم في التعبير. سوف يستكشف موقع الويب هذا الكيمياء الحيوية الأساسية لـ CRISPR / Cas9 ، ويحاول شرح ما يجعل Cas9 جيدًا في ما يفعله من الناحية الكيميائية الحيوية. باختصار:

يوفر CRISPR / Cas9 طريقة فعالة ومرنة لاستهداف وشق الحمض النووي بشكل انتقائي. ينتج بروتين Cas9 فواصل حبلا مزدوجة من خلال مجالات نوكلياز RuvC و HNH مستقلة عند هدف محدد بواسطة جزيء RNA موجه. تعتمد تقنيات تحرير الجينوم الحالية ، مثل الإصلاح الموجه من Homology على إنشاء فواصل حبلا مزدوجة. نظرًا لأنه يمكن تعديل جزيء الحمض النووي الريبي التوجيهي لاستهداف متواليات النوكليوتيدات المتنوعة ، فإن طرق كريسبر / كاس 9 توفر انتقائية أكبر من تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأخرى.

الشكل: رسم تخطيطي للكرتون Cas9 باستخدام مجالات نوكلياز 2 الخاصة به لتقسيم جزيء DNA مستهدف في موقع محدد بواسطة الحافز المجاور لـ protospacer (NGG) و 20 nucleotide guide RNA. (الشكل الأصلي)

علاوة على ذلك ، يستهدف مجمع Cas9 الحمض النووي بكفاءة من خلال آلية ربط الحمض النووي الخاصة به. نظرًا لأنه يمكن تعطيل أحد مجالات نوكلياز دون التأثير على الآخر ، يمكن تحويل مجمع Cas9 إلى نيكاز. بدلاً من ذلك ، يؤدي تعطيل كلا المجالين من نوكلياز إلى إنتاج مركب ربط DNA عالي التحديد. تجعل هذه الأنماط المختلفة للتعرف وتعطيل الجينات من CRISPR / Cas9 فرصة مثيرة لتحرير الجينوم المستهدف.


شكر وتقدير

ج. مدعوم من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO) من خلال منحة TOP (714.015.001). يتم دعم JL من خلال برنامج الجاذبية من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO). عمل R.K. هو جزء من معهد Oncode الذي تموله جزئيًا جمعية السرطان الهولندية وتم تمويله من قبل برنامج الجاذبية من NWO. عمل ن. مدعوم جزئيًا من قبل Stichting Singelswim Utrecht و Stichting FSHD و TKI / Health Holland.


يحدد نظام CRISPR-Cas في بدائيات النوى بدقة إصابة الحمض النووي والفيروسات الطفيلية ويدمرها. تم تكييف نظام CRISPR-Cas لتعديل الجينوم السطحي ، مما يبشر بعصر جديد في البيولوجيا الجزيئية. جيانغ وآخرون. أظهر أن نوكلياز Cas9 يتبنى تأكيدًا مميزًا عندما يرتبط بدليل الاستهداف RNA. ثم يفترض الدليل RNA شكلاً مرتبًا مسبقًا. وبالتالي ، فإن "منطقة بذرة" الحمض النووي الريبي هذه مهيأة لبدء التعرف على تسلسل الحمض النووي المستهدف.

تستخدم المناعة التكيفية البكتيرية بروتينات مترابطة (Cas) مع نسخ CRISPR لتدهور الحمض النووي الغريب. في أنظمة CRISPR-Cas من النوع الثاني ، يحدث تنشيط نوكلياز Cas9 الداخلي للتعرف على الحمض النووي عند ربط الحمض النووي الريبي التوجيهي بواسطة آلية غير معروفة. تكشف الهياكل البلورية لـ Cas9 المرتبطة بـ RNA أحادي الدليل عن تشكيل متميز عن كل من حالات apo و DNA المرتبطة ، حيث يتم طلب تسلسل "بذرة" 10-nucleotide RNA المطلوب لاستجواب DNA الأولي مسبقًا في شكل A. يعتبر هذا الجزء من دليل الحمض النووي الريبي (RNA) ضروريًا لـ Cas9 لتشكيل بنية مختصة للتعرف على الحمض النووي تستعد لإشراك تسلسل هدف DNA مزدوج الشريطة. نحن نفسر هذا على أنه تطور متقارب لآلية "بذرة" تذكرنا بتلك المستخدمة من قبل بروتينات الأرجونوت أثناء تداخل الحمض النووي الريبي في حقيقيات النوى.

تعمل بروتينات CRISPR-Cas بشكل معقد مع CRISPR RNAs الناضجة (crRNAs) لتحديد وتقسيم التسلسلات المستهدفة التكميلية في الأحماض النووية الأجنبية (1). في أنظمة كريسبر من النوع الثاني ، يقوم إنزيم Cas9 بشق الحمض النووي في المواقع المحددة بواسطة جزء دليل مكون من 20 نيوكليوتيد (nt) داخل crRNAs ، جنبًا إلى جنب مع crRNA المنشط عبر (tracrRNA) (2) التي تشكل كرنا: هيكل هجين tracrRNA قادر على ارتباط Cas9 (3). بمجرد تجميعها على الحمض النووي المستهدف ، فإن مجالات نوكلياز Cas9 HNH و RuvC تشق تسلسل الحمض النووي المزدوج الشريطة (dsDNA) داخل السلاسل التي تكون مكملة وغير مكملة لقطاع توجيه الحمض النووي الريبي ، على التوالي (3, 4) (الشكل 1 أ). من خلال هندسة RNA الاصطناعية أحادية الدليل (sgRNA) التي تدمج crRNA و tracrRNA في نسخة واحدة من 80 إلى 100 nt (الشكل 1B) ، تم تسخير Cas9: sgRNA كنظام قابل للبرمجة مكون من مكونين لهندسة الجينوم في مختلف الكائنات الحية (5, 6).

(أ) تنظيم المجال من بروتين النوع II-A Cas9 من S. المقيحة (SpyCas9). (ب) مخطط هيكل ثانوي لـ sgRNA يحمل تكامل منطقة 20-bp DNA. تسلسل البذور مظلل باللون البيج. تمثل القضبان بين أزواج النيوكليوتيدات أزواج قاعدة Watson-Crick المتعارف عليها تشير إلى تفاعلات اقتران القاعدة غير الكنسية. يشار إلى تفاعل التراص الأساسي بواسطة مربع مملوء. (ج) البنية الثلاثية لـ sgRNA في تمثيل الشريط ، مع حذف مركب صلب مركب سيغما- A مرجح 2FObsFاحسب حددت خريطة كثافة الإلكترون عند 1.5 درجة مئوية. (د) مخطط شريطي لمركب SpyCas9-sgRNA ، مرمز بالألوان كما هو محدد في الشكل 1 و A و B. (ه) التمثيلات السطحية للهيكل البلوري لـ SpyCas9 في معقد مع sgRNA (كما هو موضح في الرسوم المتحركة) تظهر نفس المنظر كما في الشكل 1D وعرض 180 درجة.

تعتمد فائدة Cas9 لكل من تطبيقات المناعة البكتيرية وهندسة الجينوم على التحديد الدقيق لهدف الحمض النووي. يعتمد اختيار الهدف على الاقتران الأساسي بين الحمض النووي وتسلسل الحمض النووي الريبي الإرشادي 20-nt ، بالإضافة إلى وجود 2–4-base pair (bp) protospacer الفكرة المجاورة (PAM) القريبة من الموقع المستهدف (3, 4). التكامل المستهدف لتسلسل "بذرة" داخل الجزء الإرشادي من crRNAs أمر بالغ الأهمية للتعرف على الحمض النووي وانقسامه (7, 8). في أنظمة كريسبر من النوع الثاني ، يرتبط Cas9 بالأهداف من خلال التعرف على PAM والبحث في الحمض النووي المجاور للتكامل مع تسلسل "البذور" من 10 إلى 12 نانومتر في الطرف 3 من مقطع RNA التوجيهي (الشكل 1 ب) (3, 911). تُظهر الهياكل البلورية لـ Cas9 المرتبطة بـ sgRNA وخيط الحمض النووي المستهدف ، مع أو بدون حبلا غير مستهدف يحتوي على PAM جزئيًا ، مقطع RNA التوجيهي بالكامل 20-nt المنخرط في تفاعل حلزوني الشكل A مع حبلا DNA الهدف (12, 13). ظلت الطريقة التي تحدد بها منطقة "البذرة" داخل الدليل RNA ارتباط الحمض النووي غير معروفة.

لتحديد كيفية تجميع Cas9 مع دليل RNA ووضعه قبل التعرف على الركيزة ، قمنا بحل التركيب البلوري للنشاط التحفيزي الأبراج العقدية Cas9 (SpyCas9) في مجمع مع 85-nt sgRNA بدقة 2.9 (الشكل 1 والجدول S1). يشبه الهيكل العام للمجمع الثنائي Cas9-sgRNA ، الذي يمثل حالة الإنزيم المحددة مسبقًا للهدف ، البنية ثنائية الفصوص للحالة المرتبطة بالحمض النووي الهدف ، كما لوحظ في الدراسات المجهرية الإلكترونية (14) ، مع وضع الجزء الإرشادي من sgRNA في القناة المركزية بين نوكلياز وفصوص التعرف الحلزونية (الشكل 1 ، C إلى E). يتم الحفاظ على هذه البنية الهيكلية وتنظيم RNA التوجيهي في التركيب البلوري لنسخة غير نشطة من نوكلياز تستخدم على نطاق واسع من Cas9 (D10A / H840A ، يشار إليها باسم dCas9) في مجمع مع sgRNA (الشكل S1).

تكشف المقارنة بين الهياكل البلورية SpyCas9 التي تمثل البروتين وحده وحالات الإنزيم المرتبطة بـ RNA و RNA-DNA عن طبيعة المرونة المطابقة لـ Cas9 أثناء ربط sgRNA والتعرف على الحمض النووي المستهدف (الشكل 2A والتين. S2 و S3). يخضع فص التعرف الحلزوني لعمليات إعادة ترتيب كبيرة عند ارتباط sgRNA ولكن قبل ارتباط الحمض النووي ، خاصة في المجال الحلزوني 3 ، والذي يتحرك كجسم صلب بواسطة

65 Å بالقرب من مجال HNH (الشكل S2D). يكشف تراكب المركب Cas9-sgRNA المرتبط مسبقًا بالهدف على الهياكل المرتبطة بالحمض النووي الهدف عن مزيد من التغييرات التوافقية ، بما في ذلك تحول متواضع في المجالات الحلزونية 2 و 3 ، بالإضافة إلى إزاحة مصاحبة لمجال HNH تجاه الشريط المستهدف ( الشكل 2 أ والشكل S2 و E و F). جنبًا إلى جنب مع بيانات تحلل البروتين المحدودة (الشكل 2 ب والشكل S4) ، تُظهر هذه النتائج أن ارتباط sgRNA يقود التغييرات التوافقية الرئيسية داخل Cas9 (14) ، على الرغم من حدوث إعادة ترتيب هيكلية إضافية عند ارتباط الحمض النووي للركيزة. ومن المثير للاهتمام ، أن الدليل المزدوج غير المتطابق للدليل المستهدف ينتج عنه نمط تحلل بروتيني مشابه للنمط الذي لوحظ في Cas9 المرتبط بـ sgRNA (الشكل S4B) ، مما يشير إلى أن تشكيل Cas9-sgRNA قبل الهدف مؤهل للتعرف على PAM لأنه لا يلزم إجراء المزيد من التغيير التوافقي قبل الهدف ربط الحمض النووي.

(أ) مقارنة بنيوية بين مركب Cas9-sgRNA (هدف سابق) والهيكل المرتبط بالحمض النووي المستهدف (PDB ID 4UN3) (انظر أيضًا الأفلام S1 و S2). طول المتجه يرتبط بمقياس حركة المجال. تشير الأسهم السوداء إلى حركات المجال داخل Cas9-sgRNA عند ربط الحمض النووي المستهدف. (ب) تحلل البروتين المحدود لاختبار التغييرات التوافقية واسعة النطاق لـ Cas9 عند ارتباط sgRNA والتعرف على الحمض النووي المستهدف. (ج) تراكب معقد Cas9-sgRNA المرتبط مسبقًا مع الهياكل المستهدفة المرتبطة بالحمض النووي. من أجل الوضوح ، يظهر فقط مجال CTD المحتوي على PAM. (د) عرض عن قرب لقناة ربط البذور في تمثيل السطح. (ه) sgRNAs متراكبة في حالة ما قبل الهدف (البيج) والحالات المرتبطة بالحمض النووي المستهدفة (الأسود والبرتقالي) مع الأجزاء الإرشادية الموضحة للتوضيح فقط. يشار إلى المحور الحلزوني بخط منقط. تظهر الزوايا ثنائية السطوح (θ) بين القواعد النووية للقطعة الدليلة وتلك الخاصة بالتضاعف المزدوج للحمض النووي الريبي-الحمض النووي الريبي الشكل A في الهياكل المرتبطة بالحمض النووي الهدف بين قوسين. (F) رسم تخطيطي يوضح التفاعلات الرئيسية لـ SpyCas9 مع تسلسل بذور sgRNA. يسلط الشكل الداخلي الضوء على التغيير التوافقي لـ Tyr 450 عند الربط الهدف.

يؤدي ربط RNA المرشد المفرد الذي تقطعت به السبل إلى طلب منطقة التعرف على PAM في Cas9. في حالة عدم وجود sgRNA ، يكون المجال الطرفي C المتفاعل مع PAM الخاص بـ Cas9 مضطربًا إلى حد كبير (الشكل S2A) (14). ومع ذلك ، في الهياكل المعقدة والهدف المرتبط مسبقًا بـ Cas9-sgRNA ، يتم تنظيم مجال CTD للتفاعل PAM لاستيعاب PAM المزدوج (الشكل 2C). يتواجد اثنان من الأرجينين الحرجين (Arg 1333 و Arg 1335) في التعرف على 5′-NGG-3 PAM (13) مسبقًا في بنية Cas9-sgRNA للتعرف على ثنائي النوكليوتيد GG على حبلا DNA غير المستهدف. يوضح هذا البيانات البيوكيميائية التي تشير إلى أن مجمع Cas9-sgRNA يستخدم التعرف على PAM كخطوة ملزمة لتحديد المواقع المستهدفة المحتملة للحمض النووي (9).

في بنية Cas9-sgRNA ، يتبنى الحمض النووي الريبي (RNA) تكوينًا على شكل حرف L حيث يقع جزء الدليل 5 على مقربة مكانية قريبة من الحلقة الجذعية 1 من sgRNA (الشكل 1C والشكل S5). Similar to the DNA-bound Cas9 complexes, Cas9 in the pre–target-bound state makes extensive hydrogen-bonding contacts and aromatic stacking interactions with the crRNA repeat:tracrRNA anti-repeat duplex and stem loop 1 (fig. S6) (12, 15). In contrast to the sgRNA scaffold (nucleotides G21 to U82) for which clear electron density is observed, we observed unambiguous electron density for only 10 of the 20 nucleotides of the guide RNA segment (nucleotides 11 to 20 Fig. 1, B and C), all of which are located in the seed region. Nucleotides 1 to 10 of the guide RNA segment, although present in the crystals (fig. S1), are disordered. The ordered seed nucleotides (G11 to C20, counting from the 5′ end of the sgRNA) are threaded through the narrow nucleic acid–binding channel formed between the two Cas9 lobes, with their bases facing outward (Fig. 2D and fig. S7). Nucleotides G19, C20, and G11 to U13 are exposed to bulk solvent, whereas nucleotides G14 to C18 are shielded from solvent by helical domain 2. The solvent-exposed PAM-proximal seed nucleotides G19 and C20 are therefore positioned to serve as the nucleation site for initiating target binding. This explains how a 2-bp mismatch immediately adjacent to the PAM in the DNA abolishes Cas9 binding and cleavage activity (9).

The single-stranded guide RNA within the seed region maintains a nearly A-form conformation along the ribose-phosphate backbone (Fig. 2E). To maintain this helical configuration, Cas9 makes extensive hydrogen-bonding interactions with phosphates and 2′-hydroxyl groups of the seed nucleotides (Fig. 2F). Such presentation of the seed sequence in a conformation thermodynamically favorable for helical guide:target duplex formation (16) is reminiscent of the guide RNA positioning observed in eukaryotic Argonaute complexes that recognize transcripts by base pairing with a 6-nt RNA seed sequence (fig. S8, A and B) (1719). This situation is distinct from that observed in the type I CRISPR-Cascade targeting complex, in which the entire crRNA guide region is preordered, rather than just the seed segment (fig. S8C) (2022).

Another similarity between the Cas9-bound sgRNA guide segment and the Argonaute-bound microRNA guide segment is the synchronized tilting of bases at each half-helical turn of the RNA strand. In the Cas9-sgRNA complex, a kink introduced by insertion of Tyr 450 between seed nucleobases A15 and G16 results in coordinated tilting of nucleobases G11 to A15 relative to the same region of the guide RNA in the target-bound state (Fig. 2, E and F, and fig. S8A). Notably, the orientation of Tyr 450 shifts by

120° upon target binding (Fig. 2F). The bases G16 to C20 remain in an untilted orientation that is immediately ready for target DNA base pairing. This nonuniformity in base orientation may account for previous observations showing that the 5-nt sequence of the guide RNA that binds to DNA immediately adjacent to the PAM is the most critical segment for Cas9 binding (23).

Structural and biochemical data suggest that guide RNA binding triggers a large structural rearrangement in Cas9. To test whether the seed segment of the RNA itself contributes to formation of an activated Cas9 conformation, we monitored Cas9-sgRNA assembly with the use of a set of progressively truncated guide RNAs containing 0 to 20 nt of the guide segment (N0 to N20 table S2). Limited proteolysis showed that guide RNA binding confers protection from trypsin digestion only when the guide segment has a length of at least 10 nt of the target recognition sequence (N10) (Fig. 3A and fig. S9). The absence of the guide segment results in moderately decreased Cas9 binding affinity for the RNA (fig. S10). Together, these results indicate that despite forming a stable complex with Cas9 (fig. S11), the crRNA:tracrRNA scaffold region of the sgRNA alone fails to induce the target recognition–competent conformation of Cas9.

(أ) SDS–polyacrylamide gel electrophoresis of limited trypsin digestion of SpyCas9 in the presence of truncated guide RNAs. (ب) Analytical size-exclusion chromatograms of SpyCas9-sgRNA in the absence or presence of single-stranded target DNA with the indicated number of complementary nucleotides. The dashed line indicates the peak position of stably bound SpyCas9-sgRNA-ssDNA ternary complex eluting from the gel filtration column. (ج) Cas9-mediated endonuclease activity time course assays using plasmid and oligonucleotide DNA ( 32 P-labeled on both strands) containing a 20-bp λ1 DNA target sequence and a 5′-TGG-3′ PAM motif. Cn (ن = 0, 10, 12, 14, 17, or 20) represents the number of potential guide-target base pairs counted from the PAM end.

To assess the molecular mechanism of Cas9-mediated RNA-DNA hybridization, we first used size exclusion chromatography to evaluate the effects of DNA length on the formation of Cas9-sgRNA-ssDNA (single-stranded DNA) ternary complexes. This analysis showed that target ssDNA length must be at least 10 nt to form a kinetically stable ternary complex with Cas9-sgRNA (Fig. 3B), in good agreement with the requirement for a 10- to 12-bp RNA-DNA heteroduplex to ensure strand propagation observed in Cas9 single-molecule experiments (9, 24). To further explore the importance of the seed region for Cas9-mediated DNA cleavage, we conducted endonuclease activity assays using both plasmid and oligonucleotide DNA substrates and our truncated guide RNAs. The plasmid cleavage assay revealed that the 12-bp seed:DNA heteroduplex is necessary for Cas9-mediated supercoiled plasmid cleavage, which proceeds by nicking first by the RuvC nuclease domain, then by the HNH nuclease domain (Fig. 3C and table S2). These data are consistent with structural observations indicating that the flexible HNH domain can adopt multiple non–catalytically productive states during sgRNA binding and target DNA recognition. In line with previous studies (25), the oligonucleotide cleavage assay showed that the N17 guide RNA displays an almost comparable cleavage rate but much reduced RuvC 3′-5′ exonuclease-trimming activity (3) relative to the N20 guide RNA (Fig. 3C). This trimming activity is more pronounced with the H840A nickase version of Cas9 relative to the D10A nickase version (fig. S12). This observation may explain why the D10A nickase is more efficient than the H840A nickase version of Cas9 when using a double-nicking strategy to enhance genome editing specificity (26).

We propose that the preordered PAM recognition region of the Cas9-sgRNA complex initiates DNA interrogation, followed by base pairing between a short PAM-proximal segment of DNA (1 or 2 bp) and the 3′ end of the seed sequence in the sgRNA (Fig. 4). Conformational changes of Cas9 upon initial DNA binding then accommodate guide RNA strand invasion into and beyond the seed region, triggering additional structural changes necessary for Cas9 to reach a cleavage-competent state. Recent crystal structures of human Argonaute2 bound to a microRNA guide and short RNA target sequences underscore the importance of seed region base pairing for accuracy of target selection (27).

When Cas9 is in the apo state, its PAM-interacting cleft (dotted circle) is largely disordered. In the pretarget state, the PAM-interacting domain and seed sequence from guide RNA are preorganized for PAM recognition, followed by dsDNA melting next to PAM. The nonseed region is disordered and indicated as a dotted line. Base pairing between the seed sequence and the target DNA drives Cas9 into a near-active conformation complete base pairing between the full guide segment and the target DNA strand enables Cas9 to reach a fully active state.

Our results suggest the apparent convergent evolution of a similar mechanism for CRISPR-Cas9. Collectively, our structural and biochemical data show that Cas9 is subject to multilayered regulation during its activation. The preordered RNA seed sequence and protein PAM-interacting cleft enable the Cas9-sgRNA complex to interact productively with potential DNA sequences for target sampling. The inactive conformation of apo Cas9, as well as the additional conformational changes required for the complex to reach its ultimate catalytically active state, could help to avoid spurious DNA cleavage within the host genome and hence minimize off-target effects in Cas9-based genome editing.


معلومات الكاتب

الانتماءات

RNA Therapeutics Institute, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Haiwei Mou, Jordan L. Smith, Lingtao Peng, Chun-Qing Song, Ankur Sheel, Deniz M. Ozata, Erik J. Sontheimer, Melissa J. Moore & Wen Xue

David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02142, USA

Hao Yin, Qiongqiong Wu, Daniel G. Anderson & Zhiping Weng

Program in Bioinformatics and Integrative Biology, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Jill Moore, Xiao-Ou Zhang, Yingxiang Li & Zhiping Weng

Department of Bioinformatics, School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai, People’s Republic of China

Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02142, USA

Harvard-MIT Division of Health Sciences & Technology, Cambridge, MA, 02139, USA

Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Wellstone Muscular Dystrophy Program, Department of Neurology, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Program in Molecular Medicine, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Erik J. Sontheimer & Wen Xue

Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Howard Hughes Medical Institute, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School, 368 Plantation Street, Worcester, MA, 01605, USA


شاهد الفيديو: DNA replication in prokaryotic cell 3D animation with subtitle (شهر نوفمبر 2022).